Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Analysere superkomplekser av den mitokondriale elektrontransportkjede med innfødte elektroforese, in-gel-analyser og elektrolysering

Published: June 1, 2017 doi: 10.3791/55738
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pediatrics-Division Cardiology, University of Rochester

Summary

Denne protokollen beskriver separasjonen av funksjonelle mitokondrielle elektrontransportkjedekomplekser (Cx) IV og superkomplekser derav ved bruk av naturlig elektroforese for å avsløre informasjon om deres montering og struktur. Den innfødte gel kan underkastes immunoblotting, in-gel-analyser og rensing ved elektroeluering for ytterligere å karakterisere individuelle komplekser.

Abstract

Den mitokondrielle elektrontransportkjeden (ETC) omdirigerer energien som er oppnådd fra nedbrytningen av forskjellige brenselstoffer i den bioenergetiske valutaen til cellen, ATP. ETC består av 5 massive proteinkomplekser, som også samles i superkomplekser som kalles respirasomer (CI, C-III og C-IV) og syntasomer (CV) som øker effektiviteten av elektrontransport og ATP-produksjon. Ulike metoder har blitt brukt i over 50 år for å måle ETC-funksjon, men disse protokollene gir ikke informasjon om montering av individuelle komplekser og superkomplekser. Denne protokollen beskriver teknikken for naturlig gelpolyakrylamidgelelektroforese (PAGE), en metode som ble modifisert for mer enn 20 år siden for å studere ETC-kompleksstruktur. Native elektroforese tillater separasjon av ETC-komplekser i deres aktive former, og disse kompleksene kan deretter studeres ved hjelp av immunoblotting, in-gel-analyser (IGA) og rensing ved elektroeluering. Ved å kombinere reSultene av innfødt gel PAGE med de andre mitokondriale analysene, er det mulig å få et komplett bilde av ETC-aktivitet, dens dynamiske montering og demontering, og hvordan dette regulerer mitokondriell struktur og funksjon. Dette arbeidet vil også diskutere begrensninger av disse teknikkene. I sammendraget er teknikken til native PAGE, etterfulgt av immunoblotting, IGA og elektroeluering, presentert nedenfor, en kraftig måte å undersøke funksjonaliteten og sammensetningen av mitokondrielle ETC superkomplekser.

Introduction

Mitokondriell energi i form av ATP er ikke bare viktig for celleoverlevelse, men også for regulering av celledød. Genereringen av ATP ved oksidativ fosforylering krever en funksjonell elektrontransportkjede (ETC, Cx-I til IV) og mitokondriell ATP-syntase (Cx-V). Nylige studier har vist at disse store proteinkompleksene er organisert i superkomplekser, kalt respirasomer og syntasomer 1 , 2 . Det er utfordrende å analysere montering, dynamikk og aktivitetsregulering av disse massive kompleksene og superkompleksene. Mens oksygenforbruksmålinger tatt med en oksygenelektrode og enzymanalyser utført ved bruk av et spektrofotometer kan gi verdifull informasjon om ETC-kompleks aktivitet, kan disse analysene ikke gi informasjon om nærvær, størrelse og underenhetssammensetningen av proteinkomplekset eller de involverte superkompleksene. Imidlertid utviklingen av blå og klar innfødt (BN og CN) SIDE 3 har skapt et kraftig verktøy for å avsløre viktig informasjon om komplisert sammensetning og montering / demontering og om den dynamiske reguleringen av den supramolekylære organisasjonen av disse viktige respiratoriske kompleksene under fysiologiske og patologiske forhold 4 .

Samlingen av disse kompleksene i høyere rekkefølge superkomplekser ser ut til å regulere mitokondriell struktur og funksjon 5 . For eksempel øker respirasom-samlingen effektiviteten av elektronoverføring og genereringen av protonmotivkraften over den mitokondrie indre membran 5 . I tillegg øker sammensetningen av syntasomer ikke bare effektiviteten av ATP-produksjonen og overføringen av energiekvivalenter inn i cytoplasma 2 , men støtter også den mitokondrie indre membran i den rørformede cristae 6 , </ Sup> 7 . Studier av superkompleksmontering under hjerteutvikling i musembryoer viser at generasjonen av Cx-I-holdige superkomplekser i hjertet begynner på omtrent embryonal dag 13,5 8 . Andre har vist at mengden Cx-I-holdige superkomplekser faller i hjertet på grunn av aldrings- eller iskemi / reperfusjonsskader 9 , 10 eller kan spille en rolle i utviklingen av neurodegenerative sykdommer 11 .

Denne protokollen beskriver metoder for native gel PAGE som kan brukes til å undersøke samlingen og aktiviteten til ETC-kompleksene og superkompleksene. Den omtrentlige molekylvekten av mitokondrielle superkomplekser kan vurderes ved å separere proteinkompleksene i CN- eller BN-polyakrylamidgeler. CN PAGE tillater også visualisering av den enzymatiske aktiviteten av alle mitokondriale komplekser direkte i gelen (in-gel assays;IGA) 12 . Dette arbeidet viser aktiviteten til respirasomer ved å fremheve Cx-I's evne til å oksidere NADH gjennom IGA og tilstedeværelsen av syntasomer på grunn av ATP-hydrolyserende aktivitet av Cx-V ved IGA. De multiple kompleksene og superkompleksene som inneholder Cx-I og Cx-V kan også demonstreres ved å overføre proteinene til nitrocellulosemembraner og utføre immunoblotting. Fordelen ved denne tilnærmingen er at BN eller CN PAGE separerer generelt proteinkomplekser basert på deres fysiologiske størrelse og sammensetning; Overføringen til en membran bevarer dette mønsteret av band. Analysering av proteinkomplekser i en BN- eller CN-PAGE kan også gjøres ved bruk av 2D-PAGE (se Fiala et al. 13 for en demonstrasjon) eller ved sukrose densitet sentrifugering 14 , 15 . For ytterligere å analysere et bestemt bånd, kan det utelukkes fra BN PAGE, og proteinene fra dette proteinkomplekset kan være purifieD ved å elektroelutere dem under innfødte forhold. Innfødt elektroeluering kan utføres innen få timer, noe som kan gjøre en signifikant forskjell for den passive diffusjonen (som brukt i referanse 16) av proteiner fra en gel i den omgivende buffer.

Sammendrag beskriver disse metodene flere tilnærminger som tillater ytterligere karakterisering av supermolekyler med høy molekylvekt fra mitokondriske membraner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter ble utført ved hjelp av hjerter fra C57BL / 6N mus (villtype). Musene ble anestetisert med CO 2 før cervikal dislokasjon, og alle prosedyrer ble utført i henhold til Divisjonen for laboratoriedyrmedisin ved University of Rochester og i samsvar med statlig lov, føderal lov og NIH-politikk. Protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Rochester (University Committee for Animal Resources).

1. CN og BN PAGE

MERK: Alt utstyr som brukes til BN og CN PAGE må være fri for vaskemiddel. For å sikre dette, vask alt utstyr med 0,1 M saltsyre, etterfulgt av omfattende skylling med deionisert H20.

  1. Forberedelse
    1. Forbered anodebuffer bestående av 25 mM imidazol, pH 7,0, ved 4 ° C; Lagre ved 4 ° C.
    2. Forbered katodbufferen for CN eller BN PAGE.
      1. For CN PAGE, bruk 7,5 mM imidazol og 50 mM tricin; Tilsett 0,5 g natriumdeokoksolat og 0,2 g laurylmaltosid per liter buffer. Juster pH til 7,0 ved 4 ° C og oppbevar ved 4 ° C.
      2. For BN PAGE, bruk 7,5 mM imidazol og 50 mM tricin og juster pH til 7,0 ved 4 ° C. Oppbevares ved 4 ° C.
      3. For lyseblå BN-katodebuffer, bruk 7,5 mM imidazol og 50 mM tricin. Juster pH til 7,0 ved 4 ° C og tilsett 20 mg Coomassie per liter buffer. Oppbevares ved 4 ° C.
    3. Fremstill ekstraksjonsbuffer (EB) med 50 mM NaCl, 50 mM imidazol, 2 mM aminokapronsyre og 1 mM EDTA. Juster pH til 7,0 ved 4 ° C og oppbevar ved 4 ° C.
    4. Forbered 3x gelbuffer (brukt for BN og CN geler) med 75 mM imidazol og 1,5 M aminokapronsyre. Juster pH til 7,0 ved 4 ° C og oppbevar ved 4 ° C.
    5. Forbered en lastebuffer (LB) på 0,01 g Ponceau S, 5 g glyserol og 5 ml H 2 O. Oppbevares ved romtemperatur.
    6. Forbered Coomassie blå ved å tilsette 50 mg Coomassie til 1 ml 500 mM 6-aminoheksansyre. Juster pH til 7,0 ved 4 ° C og oppbevar ved 4 ° C.
    7. Klargjør 20 mM og 200 mM laurylmaltosid i H20. Lag alikvoter på 200 μl og oppbevar dem frosset. Tørk opp vaskemiddelet før bruk.
3% til 8% (mini) 4% til 10% (maksi)
0,5 gels (lys) 0,5 geler (tung) 0,5 gels (lys) 0,5 geler (tung)
AAB (ml) 0,42 1.3 2.5 7.7
CN / BN buffer (mL) 1.6 1.6 8.5 8.5
H20 (ml) 2.7 1.4 14 6.3
Glycerol (g) 0 0,47 0 2.5
Volum (ml) 4,72 4,77 25 25
APS (μL) 27 27 65 65
TEMED (μL) 4 4 10 10

Tabell 1: Mengder av ingredienser som trengs for å hente 1 Mini- eller Maxi-PAGE. Volumene som brukes i denne tabellen, beregnes for 1 min eller 1 maksi-gel, 1,5 mm tykk. Volumet av AAB er basert på en 40% stamløsning. Lys og tung refererer til konsentratIon av AAB. APS og TEMED blir tilsatt etter at hver kolonne av gradientblanderen er fylt med AAB-oppløsning.

  1. Heller og løpende geler
    MERK: Bruk 3-8% eller 4-10% akrylamid / bisakrylamid (AAB) gradient for henholdsvis CN- eller BN-geler. Tabell 1 oppsummerer mengdene buffer, AAB, H20, glycerol, ammoniumpersulfat (APS) og tetrametyletylendiamin (TEMED) anvendt for en mini-gel (85 mm bred x 73 mm høy x 1,5 mm tykk) eller maksi-gel (160 Mm bred x 200 mm høy x 1,5 mm tykk). Montering av glassplater med CN- eller BN-geler kan kjøles i en pose med noen ml 1x gelbuffer eller innpakket i papirhåndkle fuktet med 1x gelbuffer til oppbevaring. Gelene er stabile for bruk i opp til en uke.
    1. For å helle gelen, plasser gradientblanderen på en forhøyet omrøringsplate for å sikre at gelen vil strømme av tyngdekraften inn i det tilberedte gelkammeret.
    2. Fyll utløpskammeret til gradientblanderen med 4,77 / 25 ml (Mini / maxi) av den tunge løsningen (med høyere konsentrasjon av AAB).
    3. Forsiktig åpner stoppekoblingen mellom det tunge og lyse kammeret og la en dråpe løsning gå gjennom til den andre siden.
      MERK: Dette skyver luftbobler fra tilkoblingsrøret og stoppekranen, som forhindrer strømning mellom de to kamrene. Dette kan ikke gjøres hvis begge sider allerede er fylt, fordi det samme trykket vil forhindre at boblen beveger seg gjennom.
    4. Fyll det andre kammeret i gradientblanderen med 4,72 / 25 ml (mini / maxi) av lysoppløsningen.
    5. Plasser en omrøringsbjelke i utløpskammeret med den tunge løsningen og begynn å røre. Bruk rørehastighet som ikke forårsaker bobling.
    6. Legg raskt til APS og TEMED til hvert kammer for å initiere polymerisering.
    7. Åpne forbindelsen mellom de to kamrene på gradientblanderen og la blandingen gå i noen sekunder før du åpner utløpskammeret for å helle gelen.
      MERK: Gravity wiLl drenerer begge kamrene like, og blanding av lyset i den tunge løsningen vil sakte redusere akrylamidtettheten fra bunnen til toppen av gelen. Bruk hele innholdet som er i gradientblanderen til å helle gelen.
      1. På slutten, monter forsiktig kammen, med brønnene inne i gelen for å unngå bobler og lagblanding.
    8. Vask straks gradientblanderen med etanol for å skylle ut hvilken som helst gel. Skyll med vann og hell den andre gelen. La gelene polymerisere (vanligvis mindre enn 20 minutter er nødvendig for mini-geler).
    9. For å kjøre gelene, monter dem i elektrodeaggregatet og fyll midt / øvre kammer med CN eller lyseblå BN-katodebuffer. Vent noen minutter for å sjekke lekkasjer før du legger anodebuffer til det ytre / nedre kammeret.
      1. Trekk forsiktig brønnkammerene og vask brønnene med katodebuffer ved hjelp av en sprøyte eller pipette.
      2. Kjør gelene i et kaldt rom (4 ° C) eller fullstendig pakket i is.
        1. For CN mini-PAGE, bruk 100 V for den første timen og 200 V til ferdig, vanligvis en ekstra 1-1,5 timer. Alternativt kan du kjøre CN mini-PAGE ved 30-40 V natten over.
          MERK: Fokus her er på proteinmolekyler med høy molekylvekt, så proteinkomplekser med en molekylvekt på mindre enn 140 kDa vil løpe ut av gelen. Kortere kjøretider for elektroforese kan brukes til å holde komplekser med lav molekylvekt.
        2. For BN maxi-PAGE, bruk 100 V og kjør gelene over natten (ca. 18 timer).
          MERK: Strømmen vil være svært lav (<15 mA), så en strømforsyning som kan håndtere disse forholdene er nødvendig. På dette tidspunktet kan gelene brukes til IGA eller immunoblotting. I noen tilfeller kan bånd eller baner kuttes ut av gelene ved hjelp av et knivblad på en glassplate for elektroeluering.
  2. Prøveforberedelse
    MERK: Membranbundne mitokondrielle superkomplekser må ekstraheres fra thE indre mitokondriske membran. For å bevare mitokondrielle superkomplekser, bruk enten frisk isolerte mitokondrier eller prøver som har blitt frosset og opptining bare én gang. Beregningene / volumene nedenfor er gitt for mini-geler (brønnen i en 10-brønn kam i en gel 1,5 mm tykk holder opptil 35-40 μL) og maxi-geler (brønnen i en 15 brønn kam holder opp til 200 ul). I tillegg lagre en alikvot av hver prøve (vanligvis 10 μL), som skal kjøres på en denaturerende SDS-gel for deteksjon av den spenningsavhengige anionkanalen (VDAC) som en lastekontroll.
    1. Plasser en passende mengde ( f.eks. 10-50 μg protein for mini-geler og 50-200 μg for maksi-geler) av isolerte mitokondrier eller vevshomogenat i mikrotubber og sentrifuge ved 17 000 xg i 10-15 minutter ved 4 ° C.
      MERK: Dette trinnet fjerner noe av den oppløselige mitokondrielle matriksen og / eller cytosoliske proteiner.
    2. Aspirer og kast supernatanten og tilsett ekstraksjonsbuffer til ønsket mengdeÅ legge på gelen. Resuspender sedimentet forsiktig på is. Hvis ønskelig, legg til en generell proteasehemmerblanding på dette punktet.
      MERK: Basert på det utstyret som brukes her, ble 30 μl brukt til en mini-gel og 100 μL for en maksi-gel, som begrenser protein / bufferforholdet til ikke mer enn 2 μg protein til 1 μl buffer.
    3. Legg til vaskemiddel ( f.eks. 2 μg lauryl maltosid / 1 μg protein, se Representative resultater og diskusjon for mer informasjon).
      MERK: Generelt brukes lauryl maltosid, men digitonin kan også brukes.
    4. Inkubér på is i 20 minutter. Bland forsiktig i begynnelsen og sporadisk under inkubering ved triturering og / eller omrøring av røret.
    5. Sentrifuger ved 17 000 xg i 10 minutter ved 4 ° C for å fjerne eventuelle membran og vevsfragmenter.
    6. Overfør supernatanten til et nytt rør. For CN-prøver, tilsett 1 μL LB for hver 10 μL prøvevolum; Det totale volumet av prøven skal være ca.Omtrent 40 μl for en mini-gel og 130 μL for en maxi-gel. For BN-prøver legger du Coomassie til prøvene slik at forholdet mellom fargestoff og vaskemiddel er 1: 4 (w / w).
    7. Legg 30 og 120 μl av prøvene i brønnene i henholdsvis mini- eller maxi-gel. Bruk de resterende 10 μL fra hver prøve for denaturerende SDS-gel for å oppdage VDAC som lastkontroll.
    8. For å klargjøre molekylvektmarkørene, oppløs 1 hetteglass med en høymolekylær kalibreringsblanding (se tabell over materialer for mer informasjon) i 60 μl BN / CN gelbuffer og tilsett 120 μl H20 og 20 μl LB. Legg 15 μL per kjørefelt.
    9. Kjør gelene som angitt i trinn 1.2.9.2.

2. In-gel-analyser for Cx-I og Cx-V

MERK: Analysene utføres ved romtemperatur. Ta bilder, skanner eller bilder av de utviklende bandene for dokumentasjon. (Viktig) Proteiner kan ikke overføres ontO nitrocellulose membraner etter å ha fullført en IGA.

  1. Cx-I-analyse
    1. Forberedelse.
      1. Forbered en analysebuffer med 5 mM Tris i H20 med en pH på 7,4; Lagre ved romtemperatur.
      2. Oppløs 10 mg NADH i 1 ml assaybuffer. Oppbevares i alikvoter på 100 μl ved -20 ° C til bruk; Unngå frysing og tining.
      3. Veid 25 mg Nitroblue tetrazolium i en mikrotube.
      4. Forbered fiksativet ved å fortynne 5 ml eddiksyre i 95 ml H20; Lagre ved romtemperatur.
    2. Utfører analysen.
      1. Kombiner 10 ml analysebuffer med 25 mg Nitroblue tetrazolium (sluttkonsentrasjon: 2,5 mg / ml) og 100 μl 10 mg / ml NADH (0,1 mg / ml). Legg dette til hele gelen, banen eller et område av interesse utelatt fra en CN-gel.
        MERK: Dette kan gjøres i en klar plast- eller glassbeholder. Vær oppmerksom på at denne analysen ikke kan utføres etter BN PAGE.
      2. Følg utviklingen av blåbånd etter mild omrøring (rocker) i> 3 min.
      3. Fiks gelen i 10-20 ml eddiksyreoppløsning eller vask i 5 mM Tris, pH 7,4 for å stoppe reaksjonen. Ta bilder for dokumentasjon (se Materialebordet).
  2. Cx-V-analyse
    MERK: Cx-V-analysen skal gjøres ved bruk av dupliserte CN- eller BN-geler, hvor man inkuberes med 5 μg / ml oligomycin (en Cx-V-inhibitor) for å demonstrere Cx-V-uavhengig aktivitet.
    1. Forberedelse.
      1. Forbered en analysebuffer med 35 mM Tris og 270 mM glycin; Juster pH til 8,3 ved romtemperatur. Oppbevar bufferen frossen i 50 ml alikvoter, men kontroller pH etter frysing og tining.
      2. Tilbered 1 M MgS04 i H20; Lagre ved 4 ° C til bruk.
      3. Veie 27,28 mg Pb (NO3) 2 inn i en mikrotube.
      4. Veid 60 mg ATP inn i en mikrotube.
      5. Oppløs 1 mg oLigomycin i 1 ml etanol. Oppbevares ved -20 ° C til bruk.
      6. Forbered et fikseringsmiddel ved å blande 50 ml metanol med 50 ml H20; Lagre ved romtemperatur.
    2. Utfører analysen.
      1. Inkuber en gel, en bane eller et område av interesse fra en BN- eller CN-gel i 2 timer med forsiktig omrøring (rocker) i 10-20 ml assaybuffer ± 5 μg / ml oligomycin (50-100 μl 1 mg / Ml i etanol) ved romtemperatur.
      2. Etter inkubering, erstatt bufferen med 14 ml frisk analysebuffer og tilsett 190 μl 1 M MgSO 4 (14 mM), 27,28 mg Pb (NO 3 ) 2 (5 mM), 60 mg ATP ( 8 mM) og 75 ul oligomycin (hvor det er nødvendig).
      3. Inkuber med forsiktig agitasjon (rocker) og se etter et hvitt bunnfall, da bånd på oligomycinbehandlede geler vil gi ikke-Cx-V-avhengige bånd.
        MERK: Utfallet av bunnfallet kan ta flere timer.
      4. Fest gelen i metanol-Basert fiksativ ( f.eks. 50% metanol), fordi sure løsninger vil oppløse hovedbunnfallet. Fotografere resultatene.
        MERK: Bunnfallet forstyrrer ikke Coomassie-fargingen av gelene.

3. Proteinoverføring til nitrocellulose eller polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner

  1. Forbered en overføringsbuffer med 25 mM Tris og 200 mM glycin. Juster pH til 8,3 og tilsett 0,0005 g / l SDS og 200 mL / L metanol. Oppbevares ved romtemperatur.
    1. Kutt en nitrocellulose eller PVDF-membran (porestørrelse: 0,45 μm) med et knivblad eller en saks til en størrelse litt større enn gelen.
      MERK: Nitrocellulose membraner tillater Ponceau S-farging for å vurdere proteinbelastning, mens PVDF-membraner gir mer skarpt definerte bånd.
  2. Protokollen.
    1. Soak nitrocellulose membranen, filterpapiret og svampene for aMinst 10 minutter i overføringsbuffer. Plasser PVDF-membranen i 100% metanol i 15 s eller i henhold til anbefaling fra produsenten før du plasserer den i overføringsbuffer. Legg den åpne kassetten til overføringssettet i en flat bolle med overføringsbuffer.
    2. Legg svampen og 1-2 lag med filterpapir på baksiden av kassetten. Fjern boblene.
    3. Legg gelen på filterpapiret. Angi orienteringen av gelen ved å klippe et hjørne av gelen og / eller membranen.
    4. Plasser membranen på toppen av gelen. Fjern alle bobler.
    5. Legg filterpapir og en svamp på toppen av membranen. Fjern alle bobler i denne sandwichen.
    6. Lukk kassetten og legg den i kassettholderen til overføringssettet.
    7. Overfør proteinene ved 25 V i ca. 12-18 timer.

4. Immunoblotting

  1. Forberedelse.
    1. Forbered en ponyceau-flekk (500 ml) ved å tilsette 25 mlAv eddiksyre og 0,5 g Ponceau S til 475 ml H20; Lagre ved romtemperatur (kan gjenbrukes).
    2. Tilbered Tris-bufret saltvann (TBS) med 200 mM NaCl, 25 mM Tris-Base og 2,7 mM KCl. Juster pH til 8,0 og oppbevar ved romtemperatur.
    3. Forbered TBS-tween (TBST) ved å tilsette 0,5 mL / L Tween 20 til TBS; Lagre ved romtemperatur.
    4. Forbered melkefaststoffer / TBST ved å oppløse 5 g melkefaststoffer i 100 ml TBST. Oppbevares ved 4 ° C og bruk innen 3 dager.
    5. Forbered BSA / TBST ved å oppløse 3 g bovint serumalbumin (BSA, fraksjon V) i 100 ml TBST. Oppbevares ved 4 ° C og bruk innen 3 dager.
  2. Protokollen.
    1. Når overføringen er ferdig, plasser membranen i Ponceau S løsning for å visualisere alle overførte proteiner. Merk avstanden til markørene på membranen med en blyant og dokumenter Ponceau-S-farget membran ved fotografi eller skanning.
    2. Vask membranen 3 ganger i 10 minutter hver wiTBS under forsiktig omrøring.
    3. Blokker membranen med melkefaststoffer / TBST i 1-2 timer ved romtemperatur eller over natten i et kaldt rom med mild omrøring.
    4. Vask membranen i 10 minutter med TBST under forsiktig omrøring.
    5. Inkuber med primær antistoff natten over i det kalde rommet under mild omrøring. Tynn antistoffet ( f.eks. 1: 1000 for anti-ATP5A og -NDUFB6) i BSA / TBST.
      MERK: De fleste antistoffer gir et bedre signal på membraner fra native geler når de inkuberes over natten.
    6. Vask membranen i 10 minutter med TBST under forsiktig omrøring.
    7. Inkuber med sekundært antistoff i minst 60 minutter ved romtemperatur, unnu mild omrøring. Fortynn antistoffet (1: 5000 til 1: 50 000) i faststoffmelken / TBST.
    8. Vask membranen 3 ganger i 10 minutter ved romtemperatur, med TBST, uten mild omrøring.
    9. Under den siste vasken skal du forberede det forbedrede kjemoluminescens-substratet (ECL) i henhold til instruksjonene i manufacturer.
    10. Inkubér membranen med ECL-substrat ved hjelp av instruksjoner fra produsenten.
    11. Registrer signalet på filmen ved hjelp av instruksjoner fra produsenten av ECL-substratet.

5. Elektroeluksjon

  1. Forberedelse.
    1. Fremstill en elueringsbuffer av 25 mM tricin, 3,75 mM imidazol (pH 7,0 ved 4 ° C) og 5 mM 6-aminoheksansyre.
      MERK: Bruk alltid hansker mens du håndterer elektrolytteren og membrankapslene for å forhindre forurensning med eksterne proteiner.
  2. På dagen før du bruker elektroeluteren for naturlig elektroeluering, utfør følgende:
    1. Soak membranhettene (cut-off: 3,5 kDa) i elueringsbuffer i 1 time ved 60 ° C. Overfør kappene til frisk elueringsbuffer og suge dem i 12 timer eller lenger i kjøleskapet.
      MERK: En avskjærende molekylvekt på 3,5 kDa forhindrer tap av liten pRoteiner som lett kan dissociere fra proteinkomplekset av interesse.
    2. Vask elektroelutermodulen, glassrørene, tanken og lokket grundig med etanol. Skyll med vann og la utstyret tørke.
  3. På dagen for innfødt elektroeluering gjør du følgende.
    1. Legg en frit i bunnen (frostet) av hvert glassrør som skal brukes. Hvis nødvendig, plasser glassrøret i elueringsbufferen og skyv fritt fra innsiden til bunnen av røret.
    2. Skyv glassrøret med fritt inn i elektrolyttemodulens modul. Våt grommet med elueringsbuffer og skyv glassrøret på plass. Forsikre deg om at glassrørets topper er jevne med grommen.
    3. Lukk de tomme grommene med stopper.
    4. Sett en fuktig membranhett nederst på silikonadapteren og fyll adapteren med elueringsbuffer. Pip opp bufferen i adapteren opp og ned sakte for å fjerne eventuelle luftbobler rundt dialysemembranen. </ Li>
    5. Skyv den bufferfylte adapteren til bunnen av glassrøret. Fjern alle bobler som vises på frittstående inne i glassrøret.
    6. Fyll hvert glassrør med elueringsbuffer.
    7. Plasser de ekspanderte båndene på BN PAGE i glassrørene (se trinn 1.2.9.3). Klipp store stykker i mindre stykker. Pass på at fyllhøyden i glassrøret er rundt 1 cm.
    8. Plasser hele modulen i tanken.
    9. Tilsett ca. 600 ml kald elueringsbuffer til tanken. Sørg for at silikonadapterkapene er i bufferen for å hindre bobler i dialysemembranen.
    10. Plasser en omrøringsbjelke på bunnen av tanken.
      MERK: Omrøring hindrer at boblene stikker til bunnen av dialysemembranen.
    11. Løs proteiner i 4 timer ved 350 V i et kaldt rom.
    12. Etter at elueringen er fullført, fjern elektroelutermodulen fra buffertanken og legg den i en vask eller en bolle.
    13. Hvis en stopper ble brukt, fjern den for å draI det øvre bufferkammeret. Ellers bruk en stor pipette for å fjerne bufferen.
    14. Fjern bufferen fra hvert glassrør og kast. Pass på at silikonadapteren forblir på plass og at væsken under fritiden ikke forstyrres eller rystes.
    15. Fjern forsiktig silikonadapteren, sammen med membranhetten fra bunnen av glassrøret. Pipetter innholdet (ca. 400 μL) av silikonhetten til en mikrotube. Med en annen 200 μl elueringsbuffer skylles silikonhetten og legges til mikrotuben. Gjenta for alle glassrør.
    16. Når membranhettene kan gjenbrukes, oppbevares membranhettene ved å plassere dem i elueringsbuffer inneholdende 0,5 mg / ml natriumazid. Kjøl dem.
      MERK: Eluatet har lav proteinkonsentrasjon og kan konsentreres ved hjelp av en sentrifugalfilterinnretning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å visualisere mitokondrielle superkomplekser ble nyskapede mitokondrier fra mus brukt 17 , 18 . Mitokondrielle superkomplekser er følsomme overfor gjentatte sykluser av frysing og tining, noe som fører til deres oppløsning, selv om dette kan være tolerabelt for enkelte forskere. Hvis frysing er nødvendig for lagring, for å sikre best resultat, skal prøvene ikke gjennomgå mer enn en syklus med frysing og tining.

For å visualisere de mitokondrie ETC-kompleksene med BN PAGE ble 100 μg protein fra isolerte hjerte-mitokondrier lastet på en 4-10% gel ( figur 1A ). Coomassie-flekken i laste- og katodebufferen er tilstrekkelig til å merke proteinkompleksene under løpet. Superkomplekser vises etter å ha økt kontrasten digitalt (ikke vist). For CN PAGE, to prøver på 20 μg oF-protein fra isolerte mitokondrier ble lastet på en 3-8% CN-gel og separert ( figur 1B ). CN PAGE ble farget med Coomassie og ødelagt for å visualisere proteinkompleksene. Etter å ha økt kontrasten digitalt, oppsto flere proteinkomplekser med en molekylvekt som var større enn monomeren av Cx-I ( Figur 1B , høyre). Konsentrasjonene av AAB brukt tillatt for de største superkompleksene for bare å komme inn i gelen fra brønnen. En gel som slutter med en gradient på mindre enn 3% AAB, er imidlertid ikke stabil nok til å manipulere for overføring eller for å utelate et bånd eller bane. I tillegg opprettholder lav konsentrasjon av AAB i de øvre delene av 3-8% CN-geler litt mobilitet av proteinkompleksene, noe som er viktig hvis man vurderer naturlig elektroeluering 19 .

Monomerer og superkomplekser av Cx-I og monomerer, dimerer og superkomplekser av CXV er enzymatisk aktiv og kan visualiseres av IGA ( figur 1C- F ). Analysene viser at Cx-I og Cx-V i isolerte hjerte mitokondrier er tilstede i proteinkomplekser som er større enn deres respektive monomerer. I IGA-analysen for Cx-I oksyderes NADH og elektroner overføres for å redusere nitroblue tetrazolium. Dette resulterer i en lokalisert blå farge ved molekylvekten til Cx-I-monomerer og Cx-I-holdige respirasomer / superkomplekser ( figur 1C ). Aktiviteten til Cx-V vurderes fra F1-underenhetens evne til å hydrolysere ATP og kan gjøres ved bruk av CN- eller BN-geler ( Figur 1D- F ). ADP generert fra denne reaksjonen interagerer med bly og resulterer i et hvitt utfelling ved nivået av Cx-V monomerer, dimerer, syntasomer og subkomplekser (mest sannsynlig den ikke-sammenpakkede F 1- delen av Cx-V). Merk at oligomycin eliminerer lAbeling av disse bandene, bekrefter at de inneholder Cx-V ( Figur 1E ).

For alle eksperimenter som er beskrevet her, ble det zwitterioniske vaskemiddelet, lauryl maltosid, brukt i en konsentrasjon på 2 μg / 1 μg protein, som er den høyest mulige konsentrasjon som bevarer superkompleksene samtidig som det gir konsistente og reproducerbare resultater ( figur 1F ). Effektiviteten av lauryl maltosid avhenger imidlertid av lotnummer, lagringsforhold og alder. Således er den nøyaktige konsentrasjonen som brukes i ett laboratorium ikke nødvendigvis den samme som rapportert i manuskripter. Den riktige konsentrasjonen av vaskemiddel vil solubilisere membranene, men holde kompleksene og superkompleksene intakt og må bestemmes ved å bruke forskjellige konsentrasjoner av laurylmaltosid ( figur 1F ). For CN PAGE ble et totalt prøvevolum på 40 ul pr. Brønn forberedtRedigeres her, noe som resulterer i et protein / vaskemiddelforhold på 1 μg / 2 μg eller et vaskemiddel / bufferforhold på 1 μg / 1 μl (lik 1,9 mM). Fra 40 μl ble 30 μl påført per brønn av mini-gelen; De resterende ble brukt som en alikvot for påvisning av VDAC, en lastkontroll ( figur 2D ).

For immunoblotting, er CN foretrukket for BN PAGE fordi proteiner ikke er lastet med Coomassie, som kan forstyrre deteksjon av antistoffer. Figur 2 viser deteksjon av superkomplekser som inneholder Cx-I og Cx-V proteinerne NDUFB6 og ATP5A fra isolerte hjerte-, lever- og hjerne-mitokondrier. Ponceau S-merking etter overføring og før immunblotting kan brukes til å markere molekylvektmarkørene og å kontrollere for proteinpåføring ( figur 2A ). Dette vil visualisere monomerer av proteinkompleksene av ETC på nitrocellulOse membraner, men Ponceau S-merking er ikke alltid tilstrekkelig for visualisering av mitokondrielle superkomplekser ( figur 2A ), som kan oppnås ved immunoblotting.

Cx-I samler seg ikke inn i dimerer og tetramerer, i seg selv, men danner stadig mer molekylære superkomplekser med Cx-III og Cx-IV 14 , 20 , 21 . Her viser bruk av et antistoff mot NDUFB6 at prøven fra hjertet inneholdt mer Cx-I monomer og høymolekylære superkomplekser (toppband) som mitokondriene fra leveren eller hjernen ( figur 2B ). Mengden av mellomstore respirasom-superkomplekser var også mye høyere i hjertet enn i de andre vevene ( figur 2B ).

Ved å bruke anti-ATP5A antistoffer,Monomerer av Cx-V er detekterbare i mitokondrier fra alle vev, mens et klart mønster av bånd som representerer dimerer (D) og større superkomplekser (SC), som er tydelig synlige i hjerte mitokondrier, ikke er så fremtredende i lever- og hjerne-mitokondrier ( Figur 2C ). Overeksponering (1 min mot 20 s) av immunoblottet viser flere Cx-V-holdige superkomplekser, som kan representere tetramerer og syntasomer ( figur 2C ). Disse mønstrene av Cx-V-inneholdende proteinkomplekser i hjerte-, lever- og hjerne-mitokondrier viser forskjeller som kan være vevsspesifikke og har ennå ikke blitt utforsket.

Proteinbelastning av disse blottene kan følges av Ponceau S-farging og VDAC-deteksjon av ovennevnte alikvot ved SDS PAGE, som vist i figur 2D .

Ikke alle antiboDør er egnet til å detektere et protein i den kvaternære eller tertiære struktur av et proteinkompleks etter innfødt PAGE. For å overvinne dette problemet kan hele og delvise baner fra den innfødte gelen monteres på en denaturerende gel for en andre dimensjon (2D-geler, se referanse 13 for en demonstrasjon). 2D elektroforese er et verdifullt verktøy for å visualisere proteiner i et supramolekylært kompleks. Som vist i figur 2 er imidlertid superkomplekser til stede i variable mengder, og signalet fra individuelle proteiner fra superkomplekser kan være vanskelig å visualisere i den andre denatureringsdimensjonen. For å overvinne dette problemet ble elektroeluering av proteinkomplekser fra native geler brukt her. Dette isolerer superkompleksbånd fra flere baner for å gi mer materiale til videre studier.

Når du bruker elektroeluering, er bare interessebåndet, som har blitt identifisert av IGA og / eller visualisert på en BN PAGE, ekskludertlakkering; Proteinene fra dette stykket gel blir videre renset ved eluering fra gelen. Figur 3A viser en bane av en BN PAGE hvorfra bånd som representerer monomeren ble skåret ut for elektroeluering. For å vurdere Cx-V-aktiviteten til monomeren etter elektroeluering ble eluatet påført på en andre CN PAGE. Eluatet av monomeren inneholder fortsatt enzymatisk aktivt Cx-V, men subkomplekser vises også ( figur 3B ). Sølvfarging av eluatet etter innfødt CN-PAGE ( Figur 3C ) eller denaturerende SDS-PAGE ( Figur 3D ) indikerer tilstedeværelsen av proteiner i eluatet, og immunoblotting mot ATP5A indikerer tilstedeværelsen av Cx-V i begge prøver ( Figur 3D ).

Figur 1
Figur 1: Visualisering av MitokOndrial superkomplekser. ( A ) To baner med en 4-10% BN maxi-gel, med prøver av isolerte hjerte mitokondrier. Alikvoter av samme prøve ble kjørt i begge baner, ved 100 ug protein per brønn. Monomerene av proteinkompleksene I, II, III, IV og V i ETC er tydelige synlige og er merket til høyre for gelen. ( B ) To prøver av hjerte mitokondrier (1 og 2, 20 μg protein / bane) ble separert på en CN PAGE og visualisert ved Coomassie-farging. SC indikerer posisjonen til superkompleksene etter forstørrelse og digital forbedring av den øvre delen av gelen (området er indikert med røde piler). ( C ) 20 μg mitokondrielt protein ble separert på en 3-8% CN PAGE og ble behandlet for Cx-I IGA. Forstørrede og digitalt forbedrede bilder viser bånd av Cx-I-reaksjonsprodukt. ( D ) 20 μg mitokondrielt protein ble separert på en 3-8% BN PAGE og behandlet for Cx-V IGA. storslåtte Ed og digitalt forbedrede bilder demonstrerer band av Cx-V reaksjonsprodukt. ( E ) 50 μg mitokondrielt protein ble separert på en 5-15% CN PAGE og behandlet for Cx-V IGA uten (-) og med (+) 5 μg / ml oligomycin (Oligo). ( F ) Mitokondrielt protein (20 μg / lane) ble solubilisert med 2 - 6 μg lauryl maltosid / 1 μg protein, som angitt på toppen av gelen, og separert på en 3-8% CN-gel etterfulgt av Cx- V IGA. Alle bildene ble fotografert med enten et lysbord ( A - C ) eller en svart overflate ( D - F ). Kamera spesifikasjoner er i Materialetabellen. Plasseringen av molekylvektmarkørene (MW) er angitt på venstre side av alle paneler. Forkortelser: D = dimerer; F 1 * = subkompleks av Cx-V; LM = lauryl maltosid; M = molekylvektmarkør; M = monomerer; SC = superkomplekser.G1large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2: Detektering av myokondriske superkomplekser ved immunoblotting. 20 μg protein fra hjertet (H), leveren (Li) og hjernen (B) mitokondrier ble separert på en 3-8% CN PAGE og overført til nitrocellulosemembran. ( A ) Ponceau S-farging av membranen indikerer tilstedeværelsen av proteinkomplekser og molekylvektmarkører (m). Den blå pilen peker på toppen av gelen. ( B ) Cx-I-proteinet, NDUFB6, ble immunomerket på blottet vist i (A) (1 min eksponeringstid). ( C ) Cx-V ble visualisert med anti-ATP5A antistoff (20 s og 1 min eksponering, som angitt). De røde pilene i (B) og (C) viser området forstørret og digitalt forbedret for visuaLisering av Cx-I- og Cx-V-holdige superkomplekser, og den blå pilen peker på toppen av gelen. ( D ) Ponceau S og immunomerkning av VDAC-alikvoten av hvert ekstrakt anvendt i (A), (B) og (C), som ble separert ved SDS PAGE og overført til nitrocellulose. Forkortelser: M = monomerer av Cx-I eller Cx-V, D = dimerer av Cx-V, SC = superkomplekser som inneholder Cx-I eller Cx-V. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3: Elektroeluering av Cx-V. ( A ) BN PAGE av en mitokondriell prøve. Det bokserte bånd representerer monomeren av Cx-V som ble skåret og elektroeluert. ( B ) Eluatet ble utsatt for CN PAGE, og etterfølgende IGA for Cx-V demonstrerer monomerer (M)Og subkomplekser som inneholder F1 av Cx-V. ( C ) Sølvfarging av CN-PAGE av eluatet demonstrerer monomerer (M). ( D ) Sølvfarging (venstre panel) og immunblot for ATP5A (høyre panel) av et denaturerende natriumdodecylsulfat (SDS) PAGE av eluatet indikerer nærværet av Cx-V. For SDS PAGE, se protokoller publisert andre steder. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En funksjonell ETC er nødvendig for mitokondriell ATP-generasjon. Kompleksene til ETC er i stand til å danne to typer superkomplekser: respirasomerene (Cx-I, -III og -IV) 1 og syntasomerene (Cx-V) 2 . Samlingen av hvert kompleks er nødvendig for en intakt ETC, mens organisasjonen av ETC i superkomplekser antas å øke total ETC-effektivitet 5 , 22 . Hvordan disse superkompleksene monteres og demonteres, er ikke godt forstått, men protokollene som presenteres her kan muliggjøre en bedre forståelse av disse prosessene.

Den største utfordringen ved å studere ETC-montering er størrelsen på disse proteinkompleksene. For eksempel kan mitokondrie respirasomer bestå av Cx-I (ca. 880 kDa) og ett eller flere molekyler Cx-III (460 kDa) og Cx-IV (200 kDa, aktiv som dimer), hvilket resulterer i en superkompleks med en molekylær Vekt på ca.2000 kDa. I tillegg har Cx-V en molekylvekt på ca. 600 kDa, men har vist seg å samle seg i dimerer, tetramerer, oligomerer og bånd av dimerer 7 , 23 , hvilket resulterer i superkomplekser med en molekylvekt på minst 2000 kDa. Med tanke på den enorme størrelsen på disse superkompleksene, har flere delvis relaterte tilnærminger tradisjonelt blitt brukt til å identifisere og karakterisere disse superkompleksene, av dette laboratoriet og av andre 8 , 14 , 24 .

Dette arbeidet har vist teknikken med innfødt gel PAGE, hvor aktive proteinkomplekser blir forsiktig ekstrahert fra mitokondriamembranen ved bruk av milde vaskemidler. Kompleksene migrerer i gelene, hovedsakelig på grunn av deres størrelse og inneboende ladning (CN PAGE) eller på grunn av størrelsen og negativ ladning av proteinbundet Coomassie blue (BN PAGE). Disse gelene kan farves ved bruk av COomassieblått ( f.eks. I CN-geler) eller sølvfarge ( f.eks. I BN og CN PAGE) for å avsløre proteinbånd.

Lauryl maltosid ble brukt til forsøkene som ble demonstrert her fordi dette vaskemiddelet jobbet mest pålitelig. Alternativt kan digitonin brukes til å ekstrahere proteinkomplekser 12 . Data fra mitokondrier isolert fra voksne hjerter, lever og hjerner har blitt vist her, men disse teknikkene har blitt utført på embryonale og voksne hjertehomogenater 8 . Andre har utført denne teknikken ved å bruke isolerte mitokondrier fra dyrkede celler 24 . Når man bruker vevshomogenater eller dyrkede celler med høyt DNA-innhold, kan det imidlertid være nyttig å legge til en nuklease for å hindre strekking under elektroforese 25 .

Aktiviteten til de forskjellige kompleksene kan analyseres direkte i gelen, som vist her for Cx-I og Cx-V og tecHniques er også tilgjengelige for å undersøke aktivitetene til Cx-II, -III og -IV 12 . Imidlertid må analysen av disse IGAene gjøres nøye. For det første kan den enzymatiske reaksjonen skyldes ikke-ETC-enzymer eller ufullstendige samlede komplekser. For eksempel er det rutinemessig å utføre Cx-V IGA med en parallellgel som har blitt behandlet med oligomycin for å hemme intakt Cx-V ( figur 3 ). I tillegg kan andre NADH-oxidaser utgjøre Cx-1 in-gel-aktivitet. Man kan utføre en parallell IGA i nærvær av en Cx-I-inhibitor, slik som rotenon. Imidlertid ble i figur 1 isolerte mitokondrier anvendt, så cytoplasmatiske NADH-oksidaser ikke var tilstede; Dermed representerer data mest sannsynlig Cx-I-inneholdende monomerer og superkomplekser. I tillegg er kvantifiseringen av disse resultatene mulig ved å måle signalintensiteten til båndene på fotografier eller skanninger. Ulempene med denne tilnærmingen inkluderer forskjellene mellom ogI geler, mobilitet av reaksjonsproduktet, manglende evne til å kvantifisere produktet tilfredsstillende gjennom hele dybden av gelen og den potensielle ikke-linearitet av reaksjonen 27 . For å overvinne sistnevnte har noen foreslått å skaffe seg reaksjonshastigheter ved hjelp av serielle fotografier, men dette har ikke blitt prøvd her.

Proteinet i native geler kan også overføres til membraner, og proteinsammensetningen av båndene kan undersøkes ved immunoblotting (demonstrert her) eller 2D PAGE (demonstrert i referanse 13 ). Monomerer av ETC-kompleksene er tradisjonelt blitt identifisert av deres overflod i native geler av isolerte mitokondrier, deres plassering i gelen og deres posisjon i forhold til molekylærmarkørproteinet ( figur 1 ). Videre bidrar merking av etterfølgende immunblokker med antistoffer som er spesifikke for underenheter av forskjellige komplekser, å identifisere komplekset og sammensetningenAv superkomplekser. Derfor identifiserer anti-NDUFB6 og -ATP5A monomerer av og superkomplekser som inneholder henholdsvis Cx-1 og Cx-V, som vist her. Antistoffer mot Cx-II til IV kan brukes til samme formål. I noen tilfeller kan antistoffer som fungerer godt i denaturerende geler, ikke fungere godt i native geler på grunn av at noen antistoffer er spesifikke for denaturert protein eller at en epitop kan maskeres av andre proteiner i et opprinnelig kompleks.

Den nøyaktige bestemmelse av molekylvekten til disse superkompleksene er vanskelig, siden de fleste tilgjengelige molekylvektmarkører ligger under størrelsen av Cx-V-monomerer. Migrering av proteinkomplekser i en innfødt gel avhenger av størrelsen, inneboende ladning og vaskemiddel som benyttes 28 . I eksemplene her ble monomerer av kompleksene identifisert basert på geler, markører og immunoblotting. Dimer av Cx-V ble identifisert basert på relativ migrasjon sammenlignet med monomerer av Cx-I og -V og på immunoblotting. Alt annet over monomerer og dimerer i geler, IGA og immunoblotter regnes som superkomplekser.

Native immunoblots kan også kvantifiseres for superkomplekser ved å analysere båndtetthet ved bruk av standardteknikker. Denne metoden ble ikke vist her, men en nyere publikasjon demonstrerer denne teknikken 8 . Normalisering av proteinpåføring kan gjøres ved bruk av Ponceau-rødfarging av banen eller ved å lagre en prøve av mitokondriale ekstraktet for å måle tettheten av VDAC-båndet på en denaturerende immunoblot ( figur 2A og D ). Videre er undersøkelse av forholdet mellom superkomplekser og monomerer i samme immunoblot en annen måte å kvantifisere båndtettheten på, men man må være forsiktig med å ta bilder på forskjellige tidspunkter under lette utvikling, slik at båndene ikke er overeksponerte.

Endelig kan bånd fra innfødte geler bli elektroeluert for å generere purifieD, aktive proteinkomplekser som kan samle seg i høyere rekkefølge komplekser og kan brukes til videre studier av kompleks funksjon. For eksempel ble Cx-V monomerer elektroeluert og rekonstituert i liposomer for å demonstrere den elektriske funksjonalitet 29 . En alternativ tilnærming til naturlig elektroeluering elueres ved passiv diffusjon i den omgivende buffer 16 , men dette er langsom sammenlignet med naturlig elektroeluering. Endelig opprettholder et stort problem med elektroeluering den enzymatiske funksjon av det elektroeluerte proteinkomplekset, da komplekset kan dissociere under rensing. Derfor må enhver analyse av funksjon etter isolasjon ved denne teknikken nøye testes.

Ved å kombinere disse protokollene med enzymatiske analyser og oksygenforbruksmålinger, som sondrer funksjonen til individuelle ETC-komplekser og aktiviteten til hele ETC 30 og andre methOds, for eksempel den krystallografiske 31 og elektronmikroskopiske 32 evaluering av strukturen av komplekser og superkomplekser, kan et komplett bilde av ETCs indre virkninger oppstå. Vi er nærmere å forstå hvordan kompleksene er samlet, hvordan elektroner strømmer ned i kjeden, og hvordan protoner pumpes over membranen for å generere gradienten og deretter strømme tilbake til matrisen gjennom Cx-V for å generere ATP. Utvilsomt vil disse teknikkene bli ytterligere raffinert for å gi ytterligere detaljer om strukturen, funksjonen og den dynamiske reguleringen av ETC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra American Heart Association Founders Affiliate [12GRNT12060233] og Strong Children's Research Center ved University of Rochester.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protean II mini-gel chamber Biorad 1658004 Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis
Protean XL maxi-gel Biorad 1653189 Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis
Gradient maker, Hoefer SG15 VWR 95044-704 Pouring mini-gel gradients
Gradient maker, maxi-gel VWR GM-100 Pouring maxi-gel gradients
Transfer kit Biorad 1703930 Complete set to wet transfer of proteins onto membranes
Electroeluter model 422 Biorad 1652976 Electroelution of proteins from native or SDS PAGES
Glass plates Biorad 1653308 Short plates
Glass plates Biorad 1653312 Spacer plates
Glass plates Biorad 1651823 Inner plates
Glass plates Biorad 1651824 Outer Plates
Power supply Biorad 1645070 Power supply suitable for native electrophoresis
ECL-Western  Thermo Scientific 32209 Chemolumniscense substrate
SuperSignal-West Dura Thermo Scientific 34075 Enhanced chemolumniscense substrate
Film/autoradiography film GE Health care 28906845 Documentation of Western blots
Film processor CP1000 Agfa NC0872640
Canon Power Shot 640  Canon NA Taking photos to document gels, membranes and blots.
Canon Power Shot 640 Camera hood  Canon shielding camera for photos being taken on a light table
Acrylamide/bisacrylamide Biorad 1610148 40% pre-mixed solution
Glycine Sigma G7403
SDS (sodium dodecyl sulfate) Invitrogen 15525-017
Tris-base Sigma T1503 Buffer
Tricine Sigma T0377
Sodium deoxychelate Sigma D66750 Detergent
EDTA Sigma E5134
Sucrose Sigma S9378
MOPS Sigma M1254 Buffer
Imidazole Sigma I15513 Buffer
Lauryl maltoside Sigma D4641 Detergent
Coomassie G250 Biorad 161-0406
Aminohexanoic acid Sigma O7260
Native  molecular weight kit GE Health care  17-0445-01 High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis.
Name Company Catalog Number Comments
NADH Sigma N4505
Nitroblue tetrazolium Sigma N6639
Tris HCl Sigma T3253
ATP   Sigma A2383
Name Company Catalog Number Comments
Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2): Sigma 228621
Oligomycin Sigma O4876
Name Company Catalog Number Comments
Ponceau S Sigma P3504
anti-ATP5A Abcam ab14748 antibody to ATP synthase subunit ATP5A
anti-NDUFB6 Abcam ab110244 antibody to Cx-1 subunit NDUFB6
anti-VDAC Calbiochem 529534 antibody to VDAC
ECL HRP linked antibody GE Health Care NA931V secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC
Blocking reagent Biorad 170-6404
BSA
sodium chloride Sigma S9888
potassium chloride Sigma P9541
EGTA Sigma E3889
Name Company Catalog Number Comments
Silver staining Kit Invitrogen LC6070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lenaz, G., Genova, M. L. Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation. Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).
  2. Saks, V., et al. Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells. J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).
  3. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
  4. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  5. Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
  6. Hahn, A., et al. Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology. Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).
  7. Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).
  8. Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes. PloS one. 9 (11), e113330 (2014).
  9. Genova, M. L., Lenaz, G. The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging. Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).
  10. Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
  11. Kuter, K., et al. Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).
  12. Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes. Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).
  13. Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. (48), (2011).
  14. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  15. Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III. Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).
  16. Giorgio, V., et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).
  17. Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria. J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).
  18. Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia. Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).
  19. Schagger, H. Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).
  20. Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
  21. Schafer, E., et al. Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).
  22. Wittig, I., Schagger, H. Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes. Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).
  23. Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).
  24. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  25. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  26. Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).
  27. Glancy, B., Balaban, R. S. Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).
  28. Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).
  29. Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).
  30. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain. J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).
  31. Zickermann, V., et al. Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I. Science. 347 (6217), 44-49 (2015).
  32. Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. Structure of mammalian respiratory complex I. Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).

Tags

Biochemistry Mitochondria elektron transportkjede respirasomer syntasomer klar naturlig elektroforese in-gel analyser elektroeluering
Analysere superkomplekser av den mitokondriale elektrontransportkjede med innfødte elektroforese, in-gel-analyser og elektrolysering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beutner, G., Porter Jr., G. A.… More

Beutner, G., Porter Jr., G. A. Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution. J. Vis. Exp. (124), e55738, doi:10.3791/55738 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter