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Biochemistry

Analisi di supercomplexes della catena di trasporto elettronico mitocondriale con elettroforesi nativa, analisi in-gel e elettroelution

Published: June 1, 2017 doi: 10.3791/55738
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pediatrics-Division Cardiology, University of Rochester

Summary

Questo protocollo descrive la separazione dei complessi funzionali della catena di trasporto elettronico mitocondriale (Cx) IV e dei suoi supercomplexi utilizzando l'elettroforesi nativa per rivelare informazioni sulla loro struttura e struttura. Il gel nativo può essere sottoposto a immunoblotting, analisi in-gel e purificazione mediante elettroelution per caratterizzare ulteriormente i singoli complessi.

Abstract

La catena di trasporto elettronico mitocondriale (ETC) trasforma l'energia derivata dalla rottura di vari combustibili nella valuta bioenergetica della cellula, ATP. L'ETC è composto da 5 complessi proteici massicci, che si riuniscono anche in supercomplexes chiamati respirasomi (CI, C-III e C-IV) e sintasi (CV) che aumentano l'efficienza del trasporto di elettroni e della produzione di ATP. Sono stati utilizzati diversi metodi per oltre 50 anni per misurare la funzione ETC, ma questi protocolli non forniscono informazioni sull'assemblaggio di singoli complessi e supercomplex. Questo protocollo descrive la tecnica dell'elettroforesi genica gel poliacrilammide (PAGE), un metodo modificato più di 20 anni fa per studiare la struttura complessa di ETC. L'elettroforesi nativa consente la separazione dei complessi ETC nelle loro forme attive, e questi complessi possono essere studiati utilizzando immunoblotting, test in-gel (IGA) e purificazione mediante elettroelution. Combinando il reI risultati di un gel nativo PAGE con quelli di altri test mitocondriali, è possibile ottenere un quadro completo dell'attività ETC, del suo assemblaggio dinamico e dello smontaggio e come questo regola la struttura e la funzione mitocondriale. Questo lavoro discuterà anche i limiti di queste tecniche. In sintesi, la tecnica della PAGE nativa, seguita da immunoblotting, IGA e elettroelution, presentata sotto, è un modo potente per studiare la funzionalità e la composizione dei supercomplex mitocondriali ETC.

Introduction

L'energia mitocondriale sotto forma di ATP non è solo essenziale per la sopravvivenza cellulare, ma anche per la regolazione della morte cellulare. La generazione di ATP da fosforilazione ossidativa richiede una catena funzionale di trasporto di elettroni (ETC; Cx-I-IV) e mitocondriale ATP sintasi (Cx-V). Recenti studi hanno dimostrato che questi grandi complessi proteici sono organizzati in supercomplex, chiamati respirasomi e sintasi 1 , 2 . È impegnativo analizzare l'assemblaggio, la dinamica e la regolazione delle attività di questi complessi e supercomplexi massicci. Mentre le misurazioni del consumo di ossigeno prese con un esame di elettrodi di ossigeno e di enzimi condotti utilizzando uno spettrofotometro possono fornire preziose informazioni sull'attività complessa del ETC, questi dosaggi non possono fornire informazioni riguardanti la presenza, la dimensione e la composizione subunità del complesso proteico o dei supercomplexi coinvolti. Tuttavia, lo sviluppo di nativi azzurri e chiari (BN e CN) PAGE 3 ha creato un potente strumento per rivelare importanti informazioni sulla composizione complessiva e sull'assemblaggio / smontaggio e sulla regolazione dinamica dell'organizzazione supramolecolare di questi complessi respiratori vitali in condizioni fisiologiche e patologiche 4 .

L'assemblaggio di questi complessi in supercomplex di ordine superiore sembra regolare la struttura mitocondriale e la funzione 5 . Ad esempio, il complesso respiratorio aumenta l'efficienza del trasferimento di elettroni e la generazione della forza motrice protonica attraverso la membrana interna mitocondriale 5 . Inoltre, l'assemblaggio di sintasi non solo aumenta l'efficienza della produzione di ATP e il trasferimento di equivalenti energetici nel citoplasma 2 , ma anche forma la membrana interna mitocondriale nella crista tubolare 6 ,/ Sup> 7 . Studi di assemblaggio supercomplex durante lo sviluppo cardiaco in embrioni di topi mostrano che la generazione di supercomplex contenenti Cx-I nel cuore inizia a circa il giorno embrionale 13.5 8 . Altri hanno dimostrato che la quantità di supercomplex contenenti Cx-I diminuisce nel cuore a causa dell'invecchiamento o delle lesioni di reazioni di ischemia / reperfusione 9 , 10 o possono svolgere un ruolo nella progressione delle malattie neurodegenerative 11 .

Questo protocollo descrive metodi per PAGE nativo di gel che può essere utilizzato per indagare l'assemblaggio e l'attività dei complessi ETC e dei supercomplex. Il peso molecolare approssimativo dei supercomplex mitocondriali può essere valutato separando i complessi proteici in gel di poliacrilammide CN o BN. CN PAGE consente anche la visualizzazione dell'attività enzimatica di tutti i complessi mitocondriali direttamente nel gel (in-gel assay;IGA) 12 . Questo lavoro dimostra l'attività dei respirasomi evidenziando la capacità di Cx-I di ossidare NADH attraverso l'IGA e la presenza di sintassi derivanti dall'attività di idrolisi ATP di Cx-V da parte di IGA. I complessi multipli e i supercomplex contenenti Cx-I e Cx-V possono anche essere dimostrati trasferendo le proteine ​​sulle membrane di nitrocellulosa e eseguendo immunoblotting. Il vantaggio di questo approccio è che BN o CN PAGE in genere separano i complessi proteici in base alla loro dimensione e composizione fisiologica; Il trasferimento a una membrana conserva questo modello di bande. L'analisi dei complessi proteici in una BN o in CN PAGE può essere effettuata anche utilizzando la 2D-PAGE (vedere Fiala et al. 13 per una dimostrazione) o mediante centrifugazione di densità di saccarosio 14 , 15 . Per analizzare ulteriormente una banda specifica, è possibile escoggersi dalla BN PAGE e le proteine ​​di questo complesso proteico possono essere purificateD elettrolientandoli in condizioni naturali. L'elettroelution nativo può essere eseguito entro poche ore, che potrebbe fare una differenza significativa alla diffusione passiva (come usato nel riferimento 16) di proteine ​​da un gel nel buffer circostante.

In sintesi, questi metodi descrivono diversi approcci che consentono l'ulteriore caratterizzazione di supercomplex di peso molecolare dalle membrane mitocondriali.

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Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando cuori da topi C57BL / 6N (tipo selvatico). I topi sono stati anestetizzati con CO 2 prima della dislocazione cervicale e tutte le procedure sono state eseguite in stretta conformità con la Divisione di Medicina Veterinaria Laboratoria presso l'Università di Rochester e in conformità con la legge statale, statuto federale e la politica NIH. Il protocollo è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Rochester (Commissione universitaria delle risorse animali).

1. CN e BN PAGE

NOTA: Tutte le apparecchiature utilizzate per BN e CN PAGE devono essere prive di detersivo. Per garantire questo, lavare tutte le apparecchiature con acido cloridrico 0,1 M, seguito da un ampio risciacquo con H 2 O deionizzato.

  1. Preparazione
    1. Preparare un tampone di anodo costituito da 25 mM imidazolo, pH 7,0, a 4 ° C; Conservare a 4 ° C.
    2. Preparare il buffer catodico per CN o BN PAGE.
      1. Per CN PAGE, utilizzare 7.5 mM imidazolo e 50 mM tricina; Aggiungere 0,5 g di deossolfato di sodio e 0,2 g di lauril maltoside per litro di tampone. Regolare il pH a 7 ° C a 4 ° C e conservare a 4 ° C.
      2. Per BN PAGE, utilizzare 7.5 mM imidazolo e 50 mM tricina e regolare il pH a 7.0 a 4 ° C. Conservare a 4 ° C.
      3. Per il tampone catodico BN in blu chiaro, utilizzare 7.5 mM imidazolo e 50 mM tricina. Regolare il pH a 7,0 a 4 ° C e aggiungere 20 mg di Coomassie per litro di tampone. Conservare a 4 ° C.
    3. Preparare il buffer di estrazione (EB) con 50 mM NaCl, 50 mM imidazolo, 2 mM acido aminocaproico e 1 mM EDTA. Regolare il pH a 7 ° C a 4 ° C e conservare a 4 ° C.
    4. Preparare il tampone gel 3x (utilizzato per i gel BN e CN) con 75 mM imidazolo e 1,5 M acido aminocaproico. Regolare il pH a 7 ° C a 4 ° C e conservare a 4 ° C.
    5. Preparare un tampone di caricamento (LB) di 0,01 g di Ponceau S, di 5 g di glicerolo e di 5 ml di H 2 O. Conservare in cameratemperatura.
    6. Preparare il blu di Coomassie aggiungendo 50 mg di Coomassie a 1 mL di 500 mM di acido 6-aminoheico. Regolare il pH a 7 ° C a 4 ° C e conservare a 4 ° C.
    7. Preparare 20 mM e 200 mM lauril maltoside in H 2 O. Fare aliquote di 200 μL e conservarli congelati. Sciogliere il detergente prima dell'uso.
Da 3% a 8% (mini) Dal 4% al 10% (maxi)
0.5 gel (leggero) 0.5 gel (pesante) 0.5 gel (leggero) 0.5 gel (pesante)
AAB (ml) 0.42 1.3 2.5 7.7
Tampone CN / BN (mL) 1.6 1.6 8.5 8.5
H 2 O (mL) 2.7 1.4 14 6.3
Glicerolo (g) 0 0.47 0 2.5
Volume (ml) 4.72 4.77 25 25
APS (μL) 27 27 65 65
TEMED (μL) 4 4 10 10

Tabella 1: Quantità di ingredienti necessari per versare 1 mini- o maxi-pagine. I volumi usati in questa tabella sono calcolati per 1 mini- o 1 maxi-gel, spessore 1,5 mm. Il volume di AAB si basa su una soluzione di magazzino del 40%. Leggeri e pesanti si riferiscono al concentratoIone di AAB. APS e TEMED vengono aggiunti dopo che ogni colonna del miscelatore di gradiente viene riempita con la soluzione AAB.

  1. Versare ed eseguire gel
    NOTA: Utilizzare rispettivamente 3-8% o 4-10% di gradiente di acrilammide / bisacrilammide (AAB) per i geni CN o BN. La Tabella 1 riepiloga le quantità di tampone, AAB, H 2 O, glicerolo, ammonio-persulfato (APS) e tetrametiletiletilendiammina (TEMED) utilizzati per un mini-gel (85 mm di larghezza x 73 mm di altezza x 1,5 mm di spessore) o maxi-gel Mm largo x 200 mm di altezza x 1,5 mm di spessore). Le confezioni di lastre di vetro con gemme CN o BN possono essere refrigerate in una borsa con qualche ml di tampone di gel 1x o avvolti in un tovagliolo di carta bagnato con tampone di gel 1x per lo stoccaggio. I gel sono stabili per essere utilizzati fino a una settimana.
    1. Per versare il gel, posizionare il miscelatore di gradiente su una piastra di agitazione elevata per assicurare che il gel fluisca per gravità nella camera gel preparata.
    2. Riempire la camera di deflusso del miscelatore di gradiente con 4.77 / 25 mL (Mini / maxi) della soluzione pesante (con una maggiore concentrazione di AAB).
    3. Aprire delicatamente la connessione del rubinetto tra la camera pesante e quella leggera e consentire una goccia di soluzione per passare all'altro lato.
      NOTA: questo spinge le bolle d'aria dal tubo di collegamento e dal rubinetto che impedirà il flusso tra le due camere. Questo non può essere fatto se entrambe le parti sono già state riempite, perché la pressione uguale impedirà la bolla di muoversi.
    4. Riempire l'altra camera del miscelatore di gradiente con 4.72 / 25 mL (mini / maxi) della soluzione leggera.
    5. Posizionare una barra di stirata nella camera di deflusso con la soluzione pesante e iniziare a mescolare. Utilizzare una velocità della barra di mescolamento che non provoca la formazione di bolle.
    6. Aggiungere rapidamente APS e TEMED ad ogni camera per avviare la polimerizzazione.
    7. Aprire la connessione tra le due camere del miscelatore gradiente e consentire la miscelazione per alcuni secondi prima di aprire la camera di mandata per versare il gel.
      NOTA: Gravità wiLo scarico di entrambe le camere sarà uguale e la miscelazione della luce nella soluzione pesante diminuirà lentamente la densità dell'acrilamide dal basso fino alla parte superiore del gel. Utilizzare l'intero contenuto contenuto nel mixer gradiente per versare il gel.
      1. Alla fine, montare attentamente il pettine, con i pozzetti all'interno del gel per evitare bolle e miscelazione a strati.
    8. Lavare immediatamente il miscelatore di gradiente con etanolo per sciacquare qualsiasi gel. Sciacquare con acqua e versare il secondo gel. Lasciare polimerizzare i gel (di solito meno di 20 minuti è necessario per mini-gel).
    9. Per eseguire i gel, montarli nel morsetto di montaggio dell'elettrodo e riempire la camera centrale / superiore con il citofono BN del CN ​​o del blu-chiaro. Attendere qualche minuto per verificare le perdite prima di aggiungere un buffer anodico alla camera esterna / inferiore.
      1. Estrarre delicatamente i pozzetti e lavare i pozzetti con il buffer catodico utilizzando una siringa o una pipetta.
      2. Eseguire i gel in una stanza fredda (4 ° C) o completamente imballata in ghiaccio.
        1. Per CN mini-PAGE, utilizzare 100 V per la prima ora e 200 V finché non è terminato, di solito un altro 1-1,5 h. In alternativa, eseguire la CN mini-PAGE a 30-40 V durante la notte.
          NOTA: l'attenzione è qui sui complessi proteici ad alto peso molecolare, per cui complessi proteici con un peso molecolare inferiore a 140 kDa esauriranno dal gel. Possono essere utilizzati tempi di corsa più brevi per l'elettroforesi per mantenere complessi a basso peso molecolare.
        2. Per BN maxi-PAGE, utilizzare 100 V ed eseguire i gel durante la notte (circa 18 h).
          NOTA: La corrente sarà molto bassa (<15 mA), quindi è necessario un alimentatore in grado di gestire queste condizioni. A questo punto, i gel possono essere utilizzati per IGA o immunoblotting. In alcuni casi, bande o corsie possono essere tagliate fuori dai gel usando una lama di rasoio su una lastra di vetro per elettroelution.
  2. preparazione del campione
    NOTA: I supercomplex mitocondriali a membrana devono essere estratti da thE membrana mitocondriale interna. Per proteggere i supercomplex mitocondriali, utilizzare mitochondria appena isolato o campioni che sono stati congelati e scongelati una sola volta. I calcoli / volumi riportati di seguito sono dati per mini-gel (il pozzetto di un pettine da 10 pozzetti in un gel da 1,5 mm di spessore fino a 35-40 μL) e maxi gel (il pozzo di un pettine da 15 pozzetti è fino a 200 μL). Inoltre, salvare un'aliquota di ogni campione (di solito 10 μL), da eseguire su un gel SDS denaturante per la rilevazione del canale di anione dipendente dalla tensione (VDAC), come controllo di caricamento.
    1. Inserire una quantità appropriata ( ad es., 10-50 μg di proteine ​​per mini-gel e 50 - 200 μg per maxi gel) di mitocondri isolati o tessuto omogeneato in microtubi e centrifugare a 17.000 xg per 10-15 min a 4 ° C.
      NOTA: Questo passaggio elimina alcune delle matrici mitocondriali solubili e / o proteine ​​citosoliche.
    2. Aspirare e scartare il surnatante e aggiungere il tampone di estrazione alla quantità desiderataDa caricare sul gel. Riposare delicatamente il sedimento su ghiaccio. Se si desidera, aggiungere un mix di inibitori della proteasi generale a questo punto.
      NOTA: Sulla base dell'apparecchiatura utilizzata qui, 30 μL è stato usato per un mini-gel e 100 μL per un maxi-gel, limitando il rapporto proteina / tampone a non più di 2 μg di proteine ​​a 1 μl di tampone.
    3. Aggiungere detersivo ( ad esempio, 2 μg di lauril maltoside / 1 μg di proteine, vedere i risultati rappresentativi e la discussione per ulteriori informazioni).
      NOTA: In genere si utilizza il lauril maltoside, ma può anche essere utilizzato il digitonin.
    4. Incubare su ghiaccio per 20 min. Mescolare delicatamente all'inizio e occasionalmente durante l'incubazione triturando e / o agitando il tubo.
    5. Centrifugare a 17.000 xg per 10 minuti a 4 ° C per rimuovere qualsiasi membrana e frammenti di tessuto.
    6. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo. Per i campioni di CN, aggiungere 1 μL di LB per ogni 10 μL di volume del campione; Il volume totale del campione dovrebbe essere appApprossimativamente 40 μL per un mini-gel e 130 μL per un maxi-gel. Per i campioni BN, aggiungere Coomassie ai campioni in modo che il rapporto tra colorante e detersivo sia di 1: 4 (w / w).
    7. Caricare 30 e 120 μL dei campioni nei pozzetti del mini- o maxi-gel, rispettivamente. Utilizzare il restante 10 μL da ogni campione per il gel denaturativo SDS per rilevare VDAC come un controllo di caricamento.
    8. Per preparare i marcatori a peso molecolare, sciogliere 1 flaconcino di una miscela di calibrazione ad alta molecola (vedere la tabella dei materiali per ulteriori informazioni) in 60 μl di buffer BN / CN gel e aggiungere 120 μl di H2O e 20 μL di LIBBRE. Caricare 15 μL per corsia.
    9. Eseguire i gel come descritto nel punto 1.2.9.2.

2. Analisi in-gel per Cx-I e Cx-V

NOTA: I dosaggi vengono eseguiti a temperatura ambiente. Scatta foto, scansioni o immagini delle bande di sviluppo per la documentazione. (Importante) Le proteine ​​non possono essere trasferiteO membrane nitrocellulose dopo aver completato un IGA.

  1. Cx-I assay
    1. Preparazione.
      1. Preparare un tampone di analisi di 5 mM Tris in H 2 O, con un pH di 7,4; conservare a temperatura ambiente.
      2. Sciogliere 10 mg di NADH in 1 mL di tampone di dosaggio. Conservare in aliquote di 100 μL a -20 ° C fino all'uso; Evitare il congelamento e scongelamento.
      3. Pesare 25 mg di Tetrazolium Nitroblue in un microtube.
      4. Preparare il fissativo diluendo 5 mL di acido acetico in 95 mL di H 2 O; conservare a temperatura ambiente.
    2. Esecuzione del dosaggio.
      1. Combinare 10 mL di buffer di analisi con 25 mg di tetrazolium Nitroblue (concentrazione finale: 2,5 mg / mL) e 100 μL di 10 mg / mL NADH (0,1 mg / mL). Aggiungete questo a tutto il gel, una corsia o una zona di interesse escluse da un gel CN.
        NOTA: questo può essere fatto in un contenitore trasparente di plastica o di vetro. Tieni presente che questo test non può essere eseguito dopo BN PAGE.
      2. Seguire lo sviluppo delle bande blu dopo una leggera agitazione (rocker) per> 3 min.
      3. Fissare il gel in 10 - 20 ml di soluzione di acido acetico o lavare in 5 mM Tris, pH 7,4 per fermare la reazione. Scattare fotografie per la documentazione (vedere la tabella dei materiali).
  2. Analisi Cx-V
    NOTA: Il test Cx-V deve essere effettuato usando gel duplicati CN o BN, dove uno viene incubato con oligomicina da 5 μg / mL (un inibitore Cx-V) per dimostrare l'attività indipendente da Cx-V.
    1. Preparazione.
      1. Preparare un tampone di analisi con 35 mM Tris e 270 mM glicina; Regolare il pH a 8,3 a temperatura ambiente. Conservare il tampone congelato in aliquote da 50 mL, ma controllare il pH dopo il congelamento e la scongelamento.
      2. Preparare 1 M MgSO 4 in H 2 O; Conservare a 4 ° C fino all'uso.
      3. Pesare 27,28 mg di Pb (NO 3 ) 2 in un microtube.
      4. Pesare 60 mg di ATP in un microtube.
      5. Sciogliere 1 mg di oLigomicina in 1 ml di etanolo. Conservare a -20 ° C fino all'uso.
      6. Preparare un fissativo mescolando 50 mL di metanolo con 50 mL di H 2 O; conservare a temperatura ambiente.
    2. Esecuzione del dosaggio.
      1. Incubare un gel, una corsia o una zona di interesse da un gel di BN o CN per 2 ore con agitazione leggera (rocker) in 10-20 mL di tampone di dosaggio ± 5 μg / mL oligomicina (50-100 μL di 1 mg / ML in etanolo) a temperatura ambiente.
      2. Dopo l'incubazione, sostituire il tampone con 14 ml di tampone di analisi fresco e aggiungere, in ordine, 190 μl di 1 M MgSO 4 (14 mM), 27,28 mg di Pb (NO 3 ) 2 (5 mM), 60 mg di ATP 8 mM) e 75 μL di oligomicina (ove necessario).
      3. Incubare con agitazione leggera (rocker) e guardare per un precipitato bianco, poiché le bande su gel trattati con oligomicina daranno bande non-Cx-V.
        NOTA: L'aspetto del precipitato può richiedere diverse ore.
      4. Fissare il gel in metanolo-( Ad esempio, metanolo al 50%), perché le soluzioni acide dissolvono il precipitato di piombo. Fotografate i risultati.
        NOTA: il precipitato di piombo non interferisce con la colorazione Coomassie dei gel.

3. Trasferimento di proteine ​​a membrane di nitrocellulosa o polivinilidene difluoruro (PVDF)

  1. Preparare un tampone di trasferimento di 25 mM Tris e 200 mM di glicina. Regolare il pH su 8.3 e aggiungere 0.0005 g / L SDS e 200 mL / L metanolo. Conservare a temperatura ambiente.
    1. Tagliare una membrana di nitrocellulosa o PVDF (dimensione dei pori: 0,45 μm) con una lama di rasoio o forbici ad una dimensione leggermente più grande di quella del gel.
      NOTA: Le membrane di Nitrocellulosa consentono la colorazione Ponceau S per valutare il carico delle proteine, mentre le membrane PVDF producono bande più nitide.
  2. Protocollo.
    1. Immergere la membrana di nitrocellulosa, la carta filtrante e le spugne per unaAlmeno 10 minuti nel buffer di trasferimento. Mettere la membrana PVDF in metanolo al 100% per 15 secondi o secondo la raccomandazione del produttore prima di collocarla nel buffer di trasferimento. Posizionare la cassetta aperta del kit di trasferimento in una ciotola piatta con tampone di trasferimento.
    2. Posizionare la spugna e 1-2 strati di carta filtrante sul lato posteriore della cassetta. Rimuovere le bolle.
    3. Posizionare il gel sul filtro. Indicare l'orientamento del gel tagliando un angolo del gel e / o della membrana.
    4. Posizionare la membrana sulla parte superiore del gel. Rimuovere tutte le bolle.
    5. Posizionare la carta filtrante e una spugna sulla parte superiore della membrana. Rimuovere tutte le bolle in questo panino.
    6. Chiudere la cassetta e inserirla nel supporto della cassetta del kit di trasferimento.
    7. Trasferire le proteine ​​a 25 V per circa 12-18 h.

4. Immunoblotting

  1. Preparazione.
    1. Preparare una macchia Ponceau (500 mL) aggiungendo 25 mLDi acido acetico e 0,5 g di Ponceau S a 475 ml di H 2 O; Conservare a temperatura ambiente (può essere riutilizzato).
    2. Preparare la soluzione salina a tampone Tris (TBS) con 200 mM NaCl, 25 mM Tris-Base e 2,7 mM KCl. Regolare il pH su 8,0 e conservare a temperatura ambiente.
    3. Preparare TBS-tween (TBST) aggiungendo 0,5 mL / L Tween 20 a TBS; conservare a temperatura ambiente.
    4. Preparare solidi di latte / TBST sciogliendo 5 g di solidi di latte in 100 ml di TBST. Conservare a 4 ° C e usare entro 3 giorni.
    5. Preparare BSA / TBST sciogliendo 3 g di albumina serica bovina (BSA, frazione V) in 100 mL di TBST. Conservare a 4 ° C e usare entro 3 giorni.
  2. Protocollo.
    1. Al termine del trasferimento, posizionare la membrana nella soluzione Ponceau S per visualizzare tutte le proteine ​​trasferite. Etichettare la posizione dei marcatori sulla membrana con una matita e documentare la membrana Ponceau-S macchiata per fotografia o scansione.
    2. Lavare la membrana 3 volte per 10 min ogni wiTh TBS sotto agitazione leggera.
    3. Bloccare la membrana con solidi di latte / TBST per 1-2 ore a temperatura ambiente o per una notte in una stanza fredda con agitazione leggera.
    4. Lavare la membrana per 10 min con TBST sotto agitazione leggera.
    5. Incubare con l'anticorpo primario durante la notte in camera fredda sotto agitazione leggera. Diluire l'anticorpo ( ad esempio, 1: 1.000 per anti-ATP5A e -NDUFB6) in BSA / TBST.
      NOTA: la maggior parte degli anticorpi danno un segnale migliore sulle membrane dai gel nativi quando vengono incubati durante la notte.
    6. Lavare la membrana per 10 min con TBST sotto agitazione leggera.
    7. Incubare con anticorpo secondario per almeno 60 minuti a temperatura ambiente e agitazione minima. Diluire l'anticorpo (1: 5.000 a 1: 50.000) nei solidi del latte / TBST.
    8. Lavare la membrana 3 volte per 10 minuti a temperatura ambiente con agitazione TBST e dolce.
    9. Durante l'ultimo lavaggio, preparare il substrato di chemoluminescenza migliorata (ECL) secondo le istruzioni del manufacturer.
    10. Incubare la membrana con il supporto ECL utilizzando le istruzioni fornite dal produttore.
    11. Rileva il segnale sul film utilizzando le istruzioni fornite dal produttore del substrato ECL.

5. Elettroelution

  1. Preparazione.
    1. Preparare un tampone di eluizione di 25 mM tricina, 3.75 mM imidazolo (pH 7.0 a 4 ° C) e 5 mM acido 6-aminohexanoico.
      NOTA: indossare guanti in qualsiasi momento durante la manipolazione dell'elettrodoelettrico e dei tappi a membrana per evitare la contaminazione con proteine ​​esterne.
  2. Il giorno prima dell'uso dell'elettroutensile per elettroelution nativo, eseguire quanto segue:
    1. Immergere i tappi a membrana (cut-off: 3,5 kDa) in tampone di eluizione per 1 h a 60 ° C. Trasferire i tappi al buffer di eluizione fresco e immergerli per almeno 12 ore in frigorifero.
      NOTA: Un peso molecolare di taglio di 3,5 kDa impedisce la perdita di piccoli pRotte che possono facilmente dissociarsi dal complesso proteico di interesse.
    2. Lavare completamente il modulo elettroelettrico, i tubi di vetro, il serbatoio e il coperchio con etanolo. Sciacquare con acqua e lasciare asciugare l'attrezzatura.
  3. Il giorno della elettroelurazione nativa, procedere come segue.
    1. Mettere una frusta nel fondo (smerigliato) di ogni tubo di vetro da utilizzare. Se necessario, posizionare il tubo di vetro in tampone di eluzione e spingere la fetta dall'interno al fondo del tubo.
    2. Spingere il tubo di vetro con la frittura nel modulo dell'elettroutensile. Bagnare la guarnizione con il tampone di eluizione e far scivolare il tubo di vetro in posizione. Assicurarsi che le superfici dei tubi di vetro siano uguali con la guarnizione.
    3. Chiudere i gommini vuoti con i tappi.
    4. Posizionare un tappo a membrana umida nella parte inferiore dell'adattatore al silicone e riempire l'adattatore con tampone di eluizione. Infilare lentamente e lentamente il tampone nell'adattatore per rimuovere le bolle d'aria attorno alla membrana di dialisi/ Li>
    5. Far scorrere l'adattatore riempito a tampone al fondo del tubo di vetro. Rimuovere tutte le bolle che appaiono sulla fetta all'interno del tubo di vetro.
    6. Riempire ogni tubo di vetro con tampone di eluizione.
    7. Posizionare le fascette eccedenti della BN PAGE nei tubi di vetro (vedere punto 1.2.9.3). Tagliare pezzi di grandi dimensioni in pezzi più piccoli. Assicurarsi che l'altezza di riempimento all'interno del tubo di vetro sia di circa 1 cm.
    8. Posizionare l'intero modulo nel serbatoio.
    9. Aggiungere circa 600 ml di tampone di eluizione fredda al serbatoio. Assicurarsi che i tappi dell'adattatore al silicio siano nel buffer per evitare le bolle alla membrana della dialisi.
    10. Posizionare una barra di agitazione nella parte inferiore del serbatoio.
      NOTA: L'agitazione impedirà che le bolle si attaccino al fondo della membrana di dialisi.
    11. Eluate le proteine ​​per 4 h a 350 V in una stanza fredda.
    12. Dopo aver completato l'eluizione, rimuovere il modulo elettroelettrico dal serbatoio di tampone e metterlo in un dispersore o una ciotola.
    13. Se è stato utilizzato un tappo, rimuoverloNella camera di tampone superiore. Altrimenti, utilizzare una pipetta grande per rimuovere il buffer.
    14. Rimuovere il tampone da ogni tubo di vetro e scartare. Assicurarsi che l'adattatore di silicone rimanga in posizione e che il liquido sotto il frit non sia disturbato o scosso.
    15. Rimuovere con cautela l'adattatore di silicone, insieme al tappo a membrana dal fondo del tubo di vetro. Pipettare il contenuto (circa 400 μL) del tappo in silicone in un microtube. Con altri 200 μl di tampone di eluizione, risciacquare il tappo di silicio e aggiungere al microtube. Ripetere per tutti i tubi di vetro.
    16. Poiché i tappi a membrana possono essere riutilizzati, conservare i tappi a membrana inserendoli in tampone di eluizione contenente 0,5 mg / ml di sodio azide. Frigorifero.
      NOTA: L'eluato ha una bassa concentrazione proteica e può essere concentrato utilizzando dispositivi filtranti centrifughi.

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Representative Results

Per visualizzare i supercomplex mitocondriali, i mitocondri freschi isolati dai topi sono stati usati 17 , 18 . I supercomplex mitocondriali sono sensibili a ripetuti cicli di congelamento e scongelamento, portando alla loro disgregazione, anche se questo può essere tollerabile per alcuni ricercatori. Se il freddo è necessario per lo stoccaggio, per garantire i migliori risultati, i campioni non devono subire più di un ciclo di congelamento e scongelamento.

Per visualizzare i complessi ETC mitocondriali con BN PAGE, 100 μg di proteine ​​dai mitocondri cardiaci isolati sono stati caricati su un gel 4-10% ( Figura 1A ). La macchia di Coomassie nel tampone di carico e di catodo è sufficiente per etichettare i complessi proteici durante la corsa. Supercomplexes appaiono dopo aver aumentato il contrasto digitale (non mostrato). Per CN PAGE, due campioni di 20 μg oF proteine ​​da mitocondri isolati sono stati caricati su un gel CN ​​del 3,8% e separati ( figura 1B ). La PAGE CN è stata macchiata con Coomassie e destained per visualizzare i complessi proteici. Dopo aver aumentato il contrasto digitale, sono comparsi diversi complessi proteici con un peso molecolare superiore al monomero di Cx-I ( Figura 1B , a destra). Le concentrazioni di AAB utilizzate consentono ai supercomplex più grandi di entrare nel gel dal pozzo. Tuttavia, un gel che termina con un gradiente inferiore al 3% di AAB non è abbastanza stabile da manipolare per il trasferimento o per l'eccitazione di una banda o di una corsia. Inoltre, la bassa concentrazione di AAB nelle parti superiori dei gel di CN del 3-8% mantiene una certa mobilità dei complessi proteici, importante se si considera l'elettroelurazione nativa 19 .

Monomeri e supercomplex di Cx-I e monomeri, dimeri e supercomplex di CXV sono enzimaticamente attivi e possono essere visualizzati da IGA ( Figura 1C- F ). I dosaggi dimostrano che in mitocondri cardiaci isolati, Cx-I e Cx-V sono presenti nei complessi proteici superiori ai loro rispettivi monomeri. Nel dosaggio IGA per Cx-I, NADH viene ossidato e gli elettroni vengono trasferiti per ridurre il tetrazolium nitroblue. Ciò si traduce in un colore azzurro localizzato al peso molecolare dei monomeri Cx-I e respirasomi / supercomplexi contenenti Cx-I ( Figura 1C ). L'attività di Cx-V è valutata dalla capacità della subunità F1 di idrolizzare ATP e può essere effettuata usando gel CN ​​o BN ( Figura 1D- F ). L'ADP generato da questa reazione interagisce con il piombo e si traduce in un precipitato bianco a livello di monomeri, dimeri, sintasi, e subcomplex Cx-V (probabilmente la parte F1 non assemblata di Cx-V). Si noti che l'oligomicina elimina la lChe confermano che contengono Cx-V ( figura 1E ).

Per tutti gli esperimenti qui descritti, il detergente zwitterionico, lauril maltoside, è stato utilizzato a una concentrazione di 2 μg / 1 μg di proteina, la concentrazione massima possibile che conserva i supercomplex, fornendo risultati coerenti e riproducibili ( Figura 1F ). Tuttavia, l'efficacia del lauril maltoside dipende dal numero di lotto, dalle condizioni di stoccaggio e dall'età. Quindi la concentrazione esatta utilizzata in un laboratorio non è necessariamente la stessa di quanto riportato nei manoscritti. La corretta concentrazione di detergente solubilizzerà le membrane ma mantiene intatti i complessi ei supercomplexi e deve essere determinata utilizzando una varietà di concentrazioni di lauril maltoside ( Figura 1F ). Per CN PAGE è stato preparato un volume totale di campioni di 40 μL per pozzettoOttenendo un rapporto proteico / detergente di 1 μg / 2 μg o un rapporto detergente / bufano di 1 μg / 1 μL (pari a 1,9 mM). Dai 40 μL si applica 30 μL per pozzetto del mini-gel; Il rimanente è stato utilizzato come aliquota per la rilevazione di VDAC, un controllo di caricamento ( Figura 2D ).

Per l'immunoblotting, il CN è preferito alla BN PAGE poiché le proteine ​​non sono caricate con Coomassie, che possono interferire con la rilevazione da parte degli anticorpi. La Figura 2 mostra la rilevazione di supercomplexes contenenti le proteine ​​CX-I e Cx-V NDUFB6 e ATP5A da cuore isolato, fegato e mitocondri cerebrali. L'etichettatura di Ponceau S dopo il trasferimento e prima dell'immunoblotting può essere usata per contrassegnare i marcatori di peso molecolare e per controllare il caricamento delle proteine ​​( Figura 2A ). Questo visualizzerà i monomeri dei complessi proteici dell'ETTC su nitrocellulO membrane, ma l'etichettatura di Ponceau S non è sempre sufficiente per la visualizzazione di supercomplex mitocondriali ( Figura 2A ), che può essere ottenuta mediante immunoblotting.

Cx-I non si riunisce in dimeri e tetrameri, di per sé, ma forma supercomplex di peso molecolare sempre più elevato con Cx-III e Cx-IV 14 , 20 , 21 . Qui, utilizzando un anticorpo contro NDUFB6 dimostra che il campione proveniente dal cuore conteneva più monomeri Cx-I e supercomplexes ad alta molecola (bande superiori) che i mitocondri dal fegato o dal cervello ( Figura 2B ). La quantità di supercomplex di respirazione a medio termine era anche molto più elevata nel cuore rispetto agli altri tessuti ( Figura 2B ).

Utilizzando anticorpi anti-ATP5A,I monomeri di Cx-V sono rilevabili nei mitocondri da tutti i tessuti, mentre un modello distinto di fasce rappresentative di dimeri (D) e supercomplexi superiori (SC), che sono chiaramente visibili nei mitocondri cardiaci, non sono così importanti nei mitocondri del fegato e del cervello ( Figura 2C ). La sovraesposizione (1 min rispetto a 20 s) dell'immunoblot mostra diversi supercomplex contenenti Cx-V, che potrebbero rappresentare tetrameri e sintasi ( Figura 2C ). Questi modelli di complessi proteici contenenti Cx-V nel cuore, nel fegato e nei mitocondri cerebrali mostrano differenze che possono essere specifiche del tessuto e non sono ancora state esplorate.

Il caricamento delle proteine ​​di queste macchie può essere seguito dal rilevamento di Ponceau S e dalla rilevazione VDAC della suddetta aliquota da SDS PAGE, come mostrato nella figura 2D .

Non tutti antiboGli stampi sono idonei a rilevare una proteina all'interno della struttura quaternaria o terziaria di un complesso proteico dopo la PAGE nativa. Per superare questo problema, le corsie intere e parziali del gel nativo possono essere montate su un gel di denaturazione per una seconda dimensione (gel 2D, vedere il riferimento 13 per una dimostrazione). L'elettroforesi 2D è uno strumento prezioso per visualizzare le proteine ​​in un complesso supramolecolare. Tuttavia, come mostrato nella figura 2 , i supercomplex sono presenti in quantità variabili e il segnale di singole proteine ​​da supercomplex può essere difficile da visualizzare nella seconda dimensione denaturante. Per ovviare a questo problema, è stata utilizzata l'elettroelution dei complessi proteici da gel nativi. Questo isola bande supercomplex da più corsie per produrre più materiale per ulteriori studi.

Quando si utilizza l'elettroelution, solo la fascia di interesse, identificata da IGA e / o visualizzata su una BN PAGE, è esclusazato; Le proteine ​​di questo pezzo di gel vengono ulteriormente purificate mediante eluizione dal gel. La figura 3A mostra una corsia di una BN PAGE da cui sono state escise le bande che rappresentano il monomero per l'elettroelution. Per valutare l'attività Cx-V del monomero dopo elettroelution, l'eluato è stato applicato ad una seconda PAGE CN. L'eluato del monomero contiene ancora Cx-V attivo enzimaticamente, ma appaiono anche i sottocomplex ( Figura 3B ). La colorazione d'argento dell'elua dopo la PAGE nativa CN ( figura 3C ) o la denaturazione della SDS PAGE ( Figura 3D ) indica la presenza di proteine ​​nell'elua, e l'immunoblotting contro ATP5A indica la presenza di Cx-V in entrambi i campioni ( Figura 3D ).

Figura 1
Figura 1: Visualizzazione di MitochSupercomplex ondri. ( A ) Due corsie di un maxi-gel di 4-10% BN, con campioni di mitocondri cardiaci isolati. Alquote dello stesso campione sono state eseguite in entrambe le corsie, a 100 μg di proteina per pozzetto. I monomeri dei complessi proteici I, II, III, IV e V dell'ETC sono chiaramente visibili e sono etichettati alla destra del gel. ( B ) Due campioni di mitocondri cardiaci (1 e 2, 20 μg di proteine ​​/ corsia) sono stati separati su una PAGE CN e visualizzati mediante colorazione di Coomassie. SC indica la posizione dei supercomplex dopo l'ingrandimento e la valorizzazione digitale della parte superiore del gel (l'area è indicata da frecce rosse). ( C ) 20 μg di proteine ​​mitocondriali sono state separate in un PAGE 3 e 8% CN e sono state elaborate per Cx-I IGA. Le immagini ingrandite e digitalmente migliorate dimostrano le fasce di prodotto di reazione Cx-I. ( D ) 20 μg di proteina mitocondriale sono stati separati su una PAGE BN di 3-8% e trattati per Cx-V IGA. magnifi Ed immagini digitalmente migliorate dimostrano fasce di prodotto di reazione Cx-V. ( E ) 50 μg di proteina mitocondriale sono stati separati su un PAGE di 5-15% e trattati per Cx-V IGA senza (-) e con (+) 5 μg / mL oligomicina (Oligo). ( F ) La proteina mitocondriale (20 μg / lana) è stata solubilizzata con 2-6 μg di lauril maltoside / 1 μg di proteina, come indicato nella parte superiore del gel, e separata su un gel CN ​​del 3-8% seguito da Cx- V IGA. Tutte le immagini sono state fotografate utilizzando una tavola leggera ( A - C ) o una superficie nera ( D - F ). Le specifiche della fotocamera sono nella tabella dei materiali. La posizione dei marcatori di peso molecolare (MW) è indicata sul lato sinistro di tutti i pannelli. Abbreviazioni: D = dimeri; F 1 * = sottocomplex di Cx-V; LM = lauril maltoside; M = marcatore di peso molecolare; M = monomeri; SC = supercomplex.G1large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Individuazione di Supercomplex mitocondriali mediante immunoblotting. 20 μg di proteine ​​del cuore (H), del fegato (Li) e del cervello (B) mitocondri sono state separate in un PAGE 3,8% di CN e trasferite sulla membrana di nitrocellulosa. ( A ) La colorazione Ponceau S della membrana indica la presenza di complessi proteici e marker di peso molecolare (m). La freccia blu punta sulla parte superiore del gel. ( B ) La proteina Cx-I, NDUFB6, è stata immunologica sulla macchia indicata in (A) (tempo di esposizione di 1 min). ( C ) Cx-V è stato visualizzato con anticorpo anti-ATP5A (20 s e 1 min di esposizione, come indicato). Le frecce rosse in (B) e (C) indicano l'area ingrandita e digitalmente migliorata per la visuaLizzazione dei supercomplex contenenti Cx-I e Cx-V e la freccia blu punta alla parte superiore del gel. ( D ) Ponceau S e l'immunolabellazione della aliquota VDAC di ogni estratto utilizzato in (A), (B) e (C), separati da SDS PAGE e trasferiti in nitrocellulosa. Abbreviazioni: M = monomeri di Cx-I o Cx-V, D = dimeri di Cx-V, SC = supercomplexi contenenti Cx-I o Cx-V. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Elettroelution di Cx-V. ( A ) PAGE BN di un campione mitocondriale. La banda in scatola rappresenta il monomero di Cx-V che è stato tagliato ed elettroeluted. ( B ) L'eluato è stato sottoposto a PAGE CN e successiva IGA per Cx-V dimostra monomeri (M)E sottocomplex contenenti F 1 di Cx-V. ( C ) La colorazione d'argento della PAGE CN dell'elua mostra monomeri (M). ( D ) La colorazione d'argento (pannello sinistro) e l'immunoblot per l'ATP5A (pannello destro) di una denaturazione del dodecil solfato di sodio (SDS) PAGE dell'elua indica la presenza di Cx-V. Per SDS PAGE, fare riferimento a protocolli pubblicati altrove. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Un ETC funzionale è necessario per la generazione di ATP mitocondriale. I complessi dell'ETC sono in grado di formare due tipi di supercomplex: i respirasomi (Cx-I, -III e -IV) 1 ei sintasi (Cx-V) 2 . L'assemblaggio di ogni complesso è richiesto per un ETC intatto, mentre l'organizzazione dell'ETC in supercomplexes è pensata per aumentare l'efficienza complessiva ETC 5 , 22 . Come questi complessi di assemblaggio e smontaggio non sono ben compresi, ma i protocolli qui presentati possono consentire una migliore comprensione di questi processi.

La grande sfida di studiare l'assemblaggio ETC è la dimensione di questi complessi proteici. Ad esempio, i respirasomi mitocondriali possono essere costituiti da Cx-I (circa 880 kDa) e da una o più molecole di Cx-III (460 kDa) e Cx-IV (200 kDa, attive come dimero), ottenendo un supercomplex con molecole Peso di circa2.000 kDa. Inoltre, Cx-V ha un peso molecolare di circa 600 kDa, ma è stato dimostrato di assemblare in dimeri, tetrameri, oligomeri e nastri di dimeri 7 , 23 , con conseguente supercomplexes con un peso molecolare di almeno 2.000 kDa. Considerando l'enorme dimensione di questi supercomplex, sono stati tradizionalmente utilizzati alcuni approcci parzialmente connessi per identificare e caratterizzare questi supercomplex, da questo laboratorio e da altri 8 , 14 , 24 .

Questo lavoro ha dimostrato la tecnica del gel nativo PAGE, in cui i complessi proteici attivi vengono estratti delicatamente dalla membrana mitocondriale usando detergenti delicati. I complessi migrano nei gel principalmente a causa della loro dimensione e carica intrinseca (CN PAGE) o dovuta alla dimensione e alla carica negativa di blu coomassie legato alla proteina (BN PAGE). Questi gel possono essere macchiati utilizzando COomassie blu ( ad es. In gel CN) o colorazione d'argento ( ad esempio in BN e CN PAGE) per rivelare fasce di proteine.

Il maltoside Lauril è stato utilizzato per gli esperimenti qui dimostrati perché questo detersivo ha funzionato in modo più affidabile. In alternativa, la digitonina può essere usata per estrarre complessi proteici 12 . Sono stati mostrati dati da mitocondri isolati da cuori, fegati e cervelli adulti, ma queste tecniche sono state eseguite su homogenati embrionali e adulte del cuore 8 . Altri hanno eseguito questa tecnica utilizzando mitocondri isolati dalle cellule colte 24 . Tuttavia, quando si utilizzano homogenati di tessuti o cellule colte con un elevato contenuto di DNA, può essere utile aggiungere una nuclease per prevenire la formazione di striature durante l'elettroforesi 25 .

L'attività dei diversi complessi può essere analizzata direttamente nel gel, come dimostrato qui per Cx-I e Cx-V, e tecSono disponibili anche studi per esaminare le attività di Cx-II, -III e -IV 12 . Tuttavia, l'analisi di questi IGA deve essere eseguita con attenzione. In primo luogo, la reazione enzimatica potrebbe essere dovuta agli enzimi non ETC o ai complessi incompleti. Ad esempio, è normale eseguire l'IGA Cx-V con un gel parallelo trattato con oligomicina per inibire l'intatta Cx-V ( Figura 3 ). Inoltre, altre ossidasi NADH possono rappresentare l'attività in-gel Cx-1. Si potrebbe eseguire un IGA parallelo in presenza di un inibitore Cx-I, come il rotenone. Tuttavia, in figura 1 sono stati utilizzati mitocondri isolati, quindi non erano presenti le ossidasi NADH citoplasmatiche; Quindi i dati mostrano probabilmente monomeri e supercomplex contenenti Cx-I. Inoltre, la quantificazione di questi risultati è possibile misurando l'intensità del segnale delle bande su fotografie o scansioni. I disagi a questo approccio includono le differenze tra eAll'interno dei gel, la mobilità del prodotto di reazione, l'incapacità di quantificare adeguatamente il prodotto in tutta la profondità del gel e la potenziale non-linearità della reazione 27 . Per superare questi ultimi, alcuni hanno suggerito di ottenere i tassi di reazioni utilizzando foto seriali, ma questo non è stato provato qui.

La proteina in gel nativi può anche essere trasferita alle membrane e la composizione proteica delle bande può essere esaminata mediante immunoblotting (qui dimostrato) o 2D PAGE (dimostrato nel punto 13 ). I monomeri dei complessi ETC sono stati tradizionalmente identificati dalla loro abbondanza in gel nativi di mitocondri isolati, nella loro posizione nel gel e nella loro posizione rispetto alla proteina del marcatore molecolare ( Figura 1 ). Inoltre, l'etichettatura dei successivi immunoblots con anticorpi specifici per sottounità di diversi complessi aiuta ad identificare il complesso e la composizioneDi supercomplex. Pertanto, gli anti-NDUFB6 e -ATP5A identificano monomeri e supercomplexi contenenti rispettivamente Cx-1 e Cx-V, come dimostrato qui. Gli anticorpi a Cx-II-IV possono essere utilizzati allo stesso scopo. In alcuni casi, gli anticorpi che funzionano bene nei gel di denaturazione potrebbero non funzionare bene nei gel nativi a causa del fatto che alcuni anticorpi sono specifici per la proteina denaturata o che un epitopo può essere mascherato da altre proteine ​​in un complesso nativo.

La determinazione esatta del peso molecolare di questi supercomplex è difficile, poiché la maggior parte dei marcatori a peso molecolare disponibili si trova sotto la dimensione dei monomeri Cx-V. La migrazione di complessi proteici in un gel nativo dipende dalla dimensione, dalla carica intrinseca e dal detersivo utilizzato 28 . Negli esempi qui i monomeri dei complessi sono stati identificati sulla base di gel, marcatori e immunoblotting. I dimeri di Cx-V sono stati identificati sulla base della migrazione relativa rispetto ai monomeri di Cx-I e -V e sull'immunoassorbente. Tutto quanto sopra i monomeri e i dimeri nei gel, IGA e immunoblots sono considerati come supercomplex.

Gli immunobloti nativi possono anche essere quantificati per supercomplexes analizzando la densità di banda usando tecniche standard. Questo metodo non è stato mostrato qui, ma una pubblicazione recente dimostra questa tecnica 8 . La normalizzazione del carico proteico può essere effettuata utilizzando la colorazione rossa Ponceau della corsia o salvando un campione dell'estratto mitocondriale per misurare la densità della banda VDAC su un immunoblot denaturante ( Figura 2A e D ). Inoltre, l'esame del rapporto di supercomplex ai monomeri nello stesso immunoblot è un altro modo per quantificare la densità di banda, ma bisogna fare attenzione a scattare foto in momenti diversi durante lo sviluppo di macchie in modo che le bande non siano esposte.

Infine, le bande dei gel nativi possono essere elettro-eluate per generare purifieD, complessi proteici attivi che possono essere assemblati in complessi di ordine superiore e possono essere utilizzati per ulteriori studi di funzione complessa. Ad esempio, i monomeri Cx-V sono stati precedentemente elettroelettati e ricostituiti in liposomi per dimostrare la funzionalità elettrica 29 . Un approccio alternativo all'elettroelution nativa è l'eluizione mediante diffusione passiva nel tampone circostante 16 , ma questo è lento rispetto alla elettroelution nativa. Infine, un grosso problema con l'elettroelution sta mantenendo la funzione enzimatica del complesso proteico elettroeluted, in quanto il complesso può dissociarsi durante la purificazione. Pertanto, ogni analisi della funzione dopo l'isolamento da questa tecnica dovrebbe essere rigorosamente testata.

Combinando questi protocolli con i test enzimatici e le misurazioni del consumo di ossigeno, che sondano la funzione dei singoli complessi ETC e l'attività dell'intero ETC 30 e altri metodiCome la valutazione cristallografica 31 e la valutazione microscopica elettronica 32 della struttura dei complessi e dei supercomplex, è possibile ed è emerso un quadro completo delle operazioni interne dell'ETC. Siamo più vicini alla comprensione di come i complessi sono assemblati, come gli elettroni scorrono lungo la catena e come i protoni vengono pompati attraverso la membrana per generare il gradiente e quindi tornare alla matrice attraverso Cx-V per generare ATP. Senza dubbio, queste tecniche saranno ulteriormente raffinate per fornire ulteriori dettagli sulla struttura, la funzione e la regolazione dinamica dell'ETTC.

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Disclosures

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'American Heart Association's Founder's Affiliate [12GRNT12060233] e del Forte Centri di Ricerca per l'infanzia presso l'Università di Rochester.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protean II mini-gel chamber Biorad 1658004 Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis
Protean XL maxi-gel Biorad 1653189 Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis
Gradient maker, Hoefer SG15 VWR 95044-704 Pouring mini-gel gradients
Gradient maker, maxi-gel VWR GM-100 Pouring maxi-gel gradients
Transfer kit Biorad 1703930 Complete set to wet transfer of proteins onto membranes
Electroeluter model 422 Biorad 1652976 Electroelution of proteins from native or SDS PAGES
Glass plates Biorad 1653308 Short plates
Glass plates Biorad 1653312 Spacer plates
Glass plates Biorad 1651823 Inner plates
Glass plates Biorad 1651824 Outer Plates
Power supply Biorad 1645070 Power supply suitable for native electrophoresis
ECL-Western  Thermo Scientific 32209 Chemolumniscense substrate
SuperSignal-West Dura Thermo Scientific 34075 Enhanced chemolumniscense substrate
Film/autoradiography film GE Health care 28906845 Documentation of Western blots
Film processor CP1000 Agfa NC0872640
Canon Power Shot 640  Canon NA Taking photos to document gels, membranes and blots.
Canon Power Shot 640 Camera hood  Canon shielding camera for photos being taken on a light table
Acrylamide/bisacrylamide Biorad 1610148 40% pre-mixed solution
Glycine Sigma G7403
SDS (sodium dodecyl sulfate) Invitrogen 15525-017
Tris-base Sigma T1503 Buffer
Tricine Sigma T0377
Sodium deoxychelate Sigma D66750 Detergent
EDTA Sigma E5134
Sucrose Sigma S9378
MOPS Sigma M1254 Buffer
Imidazole Sigma I15513 Buffer
Lauryl maltoside Sigma D4641 Detergent
Coomassie G250 Biorad 161-0406
Aminohexanoic acid Sigma O7260
Native  molecular weight kit GE Health care  17-0445-01 High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis.
Name Company Catalog Number Comments
NADH Sigma N4505
Nitroblue tetrazolium Sigma N6639
Tris HCl Sigma T3253
ATP   Sigma A2383
Name Company Catalog Number Comments
Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2): Sigma 228621
Oligomycin Sigma O4876
Name Company Catalog Number Comments
Ponceau S Sigma P3504
anti-ATP5A Abcam ab14748 antibody to ATP synthase subunit ATP5A
anti-NDUFB6 Abcam ab110244 antibody to Cx-1 subunit NDUFB6
anti-VDAC Calbiochem 529534 antibody to VDAC
ECL HRP linked antibody GE Health Care NA931V secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC
Blocking reagent Biorad 170-6404
BSA
sodium chloride Sigma S9888
potassium chloride Sigma P9541
EGTA Sigma E3889
Name Company Catalog Number Comments
Silver staining Kit Invitrogen LC6070

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References

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Biochimica Edizione 124 Mitocondri catena di trasporto di elettroni respirasomi sintasi elettroforesi nativa chiara dosaggi in-gel elettroelution
Analisi di supercomplexes della catena di trasporto elettronico mitocondriale con elettroforesi nativa, analisi in-gel e elettroelution
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Beutner, G., Porter Jr., G. A.… More

Beutner, G., Porter Jr., G. A. Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution. J. Vis. Exp. (124), e55738, doi:10.3791/55738 (2017).

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