Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Analyse af superkomplekser af den mitokondrieelektron transportkæde med indfødte elektroforese, in-gel analyser og elektrolysering

Published: June 1, 2017 doi: 10.3791/55738
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pediatrics-Division Cardiology, University of Rochester

Summary

Denne protokol beskriver adskillelsen af ​​funktionelle mitokondrieelektrontransportkædekomplekser (Cx) IV og superkomplekser deraf ved anvendelse af nativ elektroforese for at afsløre information om deres samling og struktur. Den native gel kan underkastes immunoblotting, in-gel assays og oprensning ved elektroeluering for yderligere at karakterisere individuelle komplekser.

Abstract

Den mitokondrieelektroniske transportkæde (ETC) transducerer den energi, der stammer fra nedbrydning af forskellige brændstoffer i cellenes bioenergetiske valuta, ATP. ETC består af 5 massive proteinkomplekser, som også samles i superkomplekser kaldet respirasomer (CI, C-III og C-IV) og syntasomer (CV), der øger effektiviteten af ​​elektrontransport og ATP-produktion. Forskellige metoder har været anvendt i over 50 år til at måle ETC-funktion, men disse protokoller giver ikke oplysninger om samling af individuelle komplekser og superkomplekser. Denne protokol beskriver teknikken for native gelpolyacrylamidgelelektroforese (PAGE), en metode, der blev modificeret for mere end 20 år siden for at studere ETC-kompleks struktur. Naturlig elektroforese tillader separation af ETC-komplekser i deres aktive former, og disse komplekser kan derefter undersøges ved anvendelse af immunoblotting, in-gel assays (IGA) og oprensning ved elektroeluering. Ved at kombinere reSulten af ​​indfødt gel PAGE med andre mitokondriale assays, er det muligt at få et komplettere billede af ETC-aktivitet, dens dynamiske montering og demontering, og hvordan dette regulerer mitokondriell struktur og funktion. Dette arbejde vil også diskutere begrænsninger af disse teknikker. Sammenfattende er teknikken af ​​native PAGE, efterfulgt af immunoblotting, IGA og elektroelution, præsenteret nedenfor, en effektiv måde at undersøge funktionaliteten og sammensætningen af ​​mitokondrie ETC superkomplekser.

Introduction

Mitokondriell energi i form af ATP er ikke kun afgørende for celleoverlevelse, men også for regulering af celledød. Genereringen af ​​ATP ved oxidativ phosphorylering kræver en funktionel elektrontransportkæde (ETC, Cx-I til IV) og mitochondriel ATP-syntase (Cx-V). Nylige undersøgelser har vist, at disse store proteinkomplekser er organiseret i superkomplekser, kaldet respirasomer og syntasomer 1 , 2 . Det er udfordrende at analysere samling, dynamik og aktivitetsregulering af disse massive komplekser og superkomplekser. Mens iltforbrugsmålinger taget med en oxygenelektrode og enzymanalyser udført under anvendelse af et spektrofotometer kan give værdifuld information om ETC-kompleks aktivitet, kan disse assays ikke tilvejebringe information vedrørende nærvær, størrelse og subunitsammensætning af proteinkomplekset eller de involverede superkomplekser. Men udviklingen af ​​blå og klar indfødte (BN og CN) PAGE 3 har skabt et kraftfuldt værktøj til at afsløre vigtige oplysninger om kompleks sammensætning og montering / demontering og om den dynamiske regulering af den supramolekylære organisering af disse vitale respiratoriske komplekser under fysiologiske og patologiske forhold 4 .

Sammensætningen af ​​disse komplekser i højere ordenes superkomplekser synes at regulere mitokondriell struktur og funktion 5 . For eksempel øger respirasom-samlingen effektiviteten af ​​elektronoverførsel og genereringen af ​​protonmotivkraft over den mitokondrie indre membran 5 . Derudover øger sammensætningen af ​​syntasomer ikke kun effektiviteten af ​​ATP-produktion og overførslen af ​​energiækvivalenter i cytoplasma 2 , men støtter også den mitokondrie indre membran i den rørformede cristae 6 , </ Sup> 7 . Undersøgelser af superkompleks samling under hjerteudvikling i musembryoer viser, at dannelsen af ​​Cx-I-indeholdende superkomplekser i hjertet begynder på ca. embryonal dag 13,5 8 . Andre har vist, at mængden af ​​Cx-I-holdige superkomplekser falder i hjertet på grund af aldring eller iskæmi / reperfusionsskader 9 , 10 eller kan spille en rolle i udviklingen af ​​neurodegenerative sygdomme 11 .

Denne protokol beskriver metoder til native gel PAGE, som kan bruges til at undersøge samlingen og aktiviteten af ​​ETC-komplekserne og superkomplekserne. Den omtrentlige molekylvægt af mitokondrielle superkomplekser kan vurderes ved at separere proteinkomplekserne i CN- eller BN-polyacrylamidgeler. CN PAGE tillader også visualisering af den enzymatiske aktivitet af alle mitokondriale komplekser direkte i gelen (in-gel assays;IGA) 12 . Dette arbejde demonstrerer aktiviteten af ​​respirasomer ved at fremhæve Cx-I's evne til at oxidere NADH gennem IGA og tilstedeværelsen af ​​syntasomer på grund af ATP-hydrolyserende aktivitet af Cx-V ved IGA. De multiple komplekser og superkomplekser indeholdende Cx-I og Cx-V kan også demonstreres ved at overføre proteinerne til nitrocellulosemembraner og udføre immunoblotting. Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at BN eller CN PAGE adskiller generelt proteinkomplekser baseret på deres fysiologiske størrelse og sammensætning; Overførslen til en membran bevarer dette mønster af bånd. Analysering af proteinkomplekser i en BN eller CN PAGE kan også gøres ved anvendelse af 2D-PAGE (se Fiala et al. 13 til en demonstration) eller ved saccharosetæthedscentrifugering 14 , 15 . For yderligere at analysere et specifikt bånd kan det udskilles fra BN PAGE, og proteinerne fra dette proteinkompleks kan være purifieD ved at elektroelutere dem under indfødte forhold. Naturlig elektroeluering kan udføres inden for få timer, hvilket kunne gøre en signifikant forskel for den passive diffusion (som anvendt i reference 16) af proteiner fra en gel i den omgivende buffer.

Sammenfattende beskriver disse fremgangsmåder adskillige fremgangsmåder, der tillader yderligere karakterisering af supermolekylære superkomplekser fra mitokondrie membraner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøg blev udført ved anvendelse af hjerter fra C57BL / 6N mus (vildtype). Mus blev bedøvet med CO 2 før cervikal dislokation, og alle procedurer blev udført i nøje overensstemmelse med Division of Laboratory Animal Medicine ved University of Rochester og i overensstemmelse med statslov, føderal statut og NIH-politik. Protokollen blev godkendt af den institutionelle dyrepleje og brugskomité ved University of Rochester (University Committee for Animal Resources).

1. CN og BN PAGE

BEMÆRK: Alt udstyr, der bruges til BN og CN PAGE, skal være fri for vaskemiddel. For at sikre dette vaskes alt udstyr med 0,1 M saltsyre, efterfulgt af omfattende skylning med deioniseret H 2 O.

  1. Forberedelse
    1. Forbered anodebuffer bestående af 25 mM imidazol, pH 7,0, ved 4 ° C; Opbevares ved 4 ° C.
    2. Forbered katodebuffer for CN eller BN PAGE.
      1. For CN PAGE anvendes 7,5 mM imidazol og 50 mM tricin; Tilsæt 0,5 g natriumdeoxycholat og 0,2 g lauryl maltosid pr. Liter buffer. Juster pH til 7,0 ved 4 ° C og opbevar ved 4 ° C.
      2. For BN PAGE anvendes 7,5 mM imidazol og 50 mM tricin og juster pH til 7,0 ved 4 ° C. Opbevares ved 4 ° C.
      3. Til lyseblå BN-katodepuffer anvendes 7,5 mM imidazol og 50 mM tricin. Juster pH til 7,0 ved 4 ° C og tilsæt 20 mg Coomassie pr. Liter buffer. Opbevares ved 4 ° C.
    3. Fremstil ekstraktionsbuffer (EB) med 50 mM NaCI, 50 mM imidazol, 2 mM aminocapronsyre og 1 mM EDTA. Juster pH til 7,0 ved 4 ° C og opbevar ved 4 ° C.
    4. Forbered 3x gelbuffer (anvendt til BN og CN geler) med 75 mM imidazol og 1,5 M aminocaproinsyre. Juster pH til 7,0 ved 4 ° C og opbevar ved 4 ° C.
    5. Forbered en påfyldningsbuffer (LB) på 0,01 g Ponceau S, 5 g glycerol og 5 ml H 2 O. Opbevares ved værelsettemperatur.
    6. Forbered Coomassie blå ved at tilsætte 50 mg Coomassie til 1 ml 500 mM 6-aminohexansyre. Juster pH til 7,0 ved 4 ° C og opbevar ved 4 ° C.
    7. Fremstil 20 mM og 200 mM laurylmaltosid i H20. Lav alikvoter på 200 μl og opbevar dem frosne. Tør vasken op inden brug.
3% til 8% (mini) 4% til 10% (maxi)
0,5 gels (lys) 0,5 geler (tung) 0,5 gels (lys) 0,5 geler (tung)
AAB (ml) 0,42 1.3 2.5 7.7
CN / BN buffer (mL) 1.6 1.6 8.5 8.5
H20 (mL) 2.7 1.4 14 6.3
Glycerol (g) 0 0,47 0 2.5
Volumen (ml) 4,72 4,77 25 25
APS (μL) 27 27 65 65
TEMED (μL) 4 4 10 10

Tabel 1: Kvantiteter af ingredienser, der er nødvendige for at hælde 1 mini- eller maxi-side. De mængder, der anvendes i denne tabel, beregnes for 1 mini- eller 1 maxi-gel, 1,5 mm tykt. Volumenet af AAB er baseret på en 40% stamopløsning. Lys og tung refererer til koncentratetIon af AAB. APS og TEMED tilsættes efter hver kolonne af gradientblanderen er fyldt med AAB-opløsning.

  1. Hælde og løbende geler
    BEMÆRK: Brug 3-8% eller 4-10% acrylamid / bisacrylamid (AAB) gradient for henholdsvis CN- eller BN-geler. Tabel 1 opsummerer mængderne af buffer, AAB, H20, glycerol, ammoniumpersulfat (APS) og tetramethylethylendiamin (TEMED) anvendt til en mini-gel (85 mm bred x 73 mm høj x 1,5 mm tykk) eller maxi-gel (160 Mm bred x 200 mm høj x 1,5 mm tyk). Samlinger af glasplader med CN- eller BN-geler kan afkøles i en pose med et par ml 1x gelbuffer eller indpakket i papirhåndklæde fugtet med 1x gelbuffer til opbevaring. Gelerne er stabile til brug i op til en uge.
    1. For at hælde gelen skal du placere gradientblanderen på en forhøjet omrøringsplade for at sikre, at gelen strømmer gennem tyngdekraften ind i det fremstillede gelkammer.
    2. Fyld udløbskammeret i gradientblanderen med 4,77 / 25 ml (Mini / maxi) af den tunge opløsning (med en højere koncentration af AAB).
    3. Åbn forsigtigt stopkranforbindelsen mellem det tunge og lyse kammer og lad en dråbe opløsning gå igennem til den anden side.
      BEMÆRK: Dette skubber luftbobler fra forbindelsesrøret og stophanen, som forhindrer flow mellem de to kamre. Dette kan ikke gøres, hvis begge sider allerede er blevet fyldt, fordi det samme tryk forhindrer boblen i at bevæge sig igennem.
    4. Fyld det andet kammer i gradientblanderen med 4,72 / 25 ml (mini / maxi) af lysopløsningen.
    5. Anbring en omrøringsbjælke i udløbskammeret med den tunge opløsning og begynde omrøring. Brug en omdrejningshastighed, der ikke forårsager bobler.
    6. Hurtigt tilsæt APS og TEMED til hvert kammer for at initiere polymerisering.
    7. Åbn forbindelsen mellem de to kamre i gradientblanderen og lad det blande i nogle få sekunder, før du åbner udstrømningskammeret for at hælde gelen.
      BEMÆRK: Gravity wiLl dræner begge kamre lige, og blanding af lyset i den tunge opløsning reducerer langsomt acrylamiddensiteten fra bunden til toppen af ​​gelen. Brug hele indholdet, der er i gradientblanderen, til at hælde gelen.
      1. I slutningen monteres kammen omhyggeligt, med brøndene inde i gelen for at undgå bobler og lagblanding.
    8. Vask straks gradientblanderen med ethanol for at skylle op en hvilken som helst gel. Skyl med vand og hæld den anden gel. Lad gelerne polymerisere (normalt mindre end 20 min er nødvendig for mini-geler).
    9. For at køre gelerne skal du montere dem i elektrodekonstruktionen og fylde center / øvre kammer med CN eller lyseblå BN katode buffer. Vent et par minutter for at kontrollere for lækager, før du tilføjer anodebuffer til det ydre / nedre kammer.
      1. Træk brøndkamrene forsigtigt ud og vask brøndene med katodepuffer ved hjælp af en sprøjte eller pipette.
      2. Kør gelerne i et koldt rum (4 ° C) eller helt pakket i is.
        1. For CN mini-PAGE, brug 100 V i den første time og 200 V indtil færdig, normalt en ekstra 1-1,5 h. Alternativt kan du køre CN mini-PAGE ved 30-40 V natten over.
          BEMÆRK: Fokus her er på proteinkomplekser med høj molekylvægt, så proteinkomplekser med en molekylvægt på mindre end 140 kDa vil løbe tør for gelen. Kortere tidspunkter for elektroforese kan anvendes til at holde komplekser med lav molekylvægt.
        2. For BN maxi-PAGE, brug 100 V og kør gelerne natten over (ca. 18 timer).
          BEMÆRK: Strømmen vil være meget lav (<15 mA), så en strømforsyning, som kan håndtere disse forhold, er nødvendig. På dette tidspunkt kan gelerne anvendes til IGA eller immunoblotting. I nogle tilfælde kan bånd eller baner skæres ud af gelerne ved hjælp af et knivblad på en glasplade til elektroeluering.
  2. Prøveforberedelse
    BEMÆRK: Membranbundne mitokondrielle superkomplekser skal ekstraheres fra thE indre mitokondrial membran. For at bevare mitokondrielle superkomplekser skal du bruge enten frisk isoleret mitokondrier eller prøver, der er frosset og optøet kun én gang. Beregningerne / volumenerne nedenfor gives til mini-geler (brønden i en 10-brøndskam i en gel 1,5 mm tykk holder op til 35-40 μL) og maxi-geler (brønden i en 15 brøndskammen holder op til 200 μl). Desuden gemmes en alikvot af hver prøve (sædvanligvis 10 μl), der skal køres på en denaturerende SDS-gel til påvisning af den spændingsafhængige anionkanal (VDAC) som en belastningskontrol.
    1. Anbring en passende mængde ( f.eks. 10-50 μg protein til mini-geler og 50-200 μg for maxi-geler) af isolerede mitokondrier eller vævshomogenat i mikrotubber og centrifuge ved 17.000 xg i 10-15 minutter ved 4 ° C.
      BEMÆRK: Dette trin fjerner nogle af de opløselige mitokondriematrix og / eller cytosoliske proteiner.
    2. Aspirer og kassér supernatanten og tilsæt ekstraktionsbuffer til den ønskede mængdeAt indlæse på gelen. Resuspender sedimentet forsigtigt på is. Hvis det ønskes, tilføj en generel proteaseinhibitor blanding på dette tidspunkt.
      BEMÆRK: Baseret på det udstyr, der anvendes her, blev 30 μL brugt til en mini-gel og 100 μl for en maxi-gel, der begrænsede protein / bufferforholdet til ikke mere end 2 μg protein til 1 μl buffer.
    3. Tilsæt vaskemiddel ( fx 2 μg lauryl maltosid / 1 μg protein, se repræsentative resultater og diskussion for mere information).
      BEMÆRK: Normalt anvendes lauryl maltosid, men digitonin kan også anvendes.
    4. Inkubér på is i 20 minutter. Bland forsigtigt i begyndelsen og lejlighedsvis under inkubation ved triturering og / eller omrøring af røret.
    5. Centrifuge ved 17.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C for at fjerne eventuelle membran og vævsfragmenter.
    6. Overfør supernatanten til et nyt rør. For CN-prøver tilsættes 1 μL LB for hver 10 μL prøvevolumen; Den samlede mængde af prøven skal være ca.Ca. 40 μl for en mini-gel og 130 μl for en maxi-gel. Til BN prøver, tilføj Coomassie til prøverne, så forholdet mellem farvestof og vaskevand er 1: 4 (vægt / vægt).
    7. Indlæs 30 og 120 μl af prøverne i henholdsvis brøndene i henholdsvis mini- eller maxi-gel. Brug de resterende 10 μL fra hver prøve til denaturerende SDS gel til at detektere VDAC som en belastningskontrol.
    8. For at fremstille molekylvægtsmarkørerne opløses 1 hætteglas med en højmolekylær kalibreringsblanding (se Materialetabellen for mere information) i 60 μl BN / CN gelbuffer og tilsæt 120 μl H20 og 20 μl LB. Indlæs 15 μL pr. Bane.
    9. Kør gelerne som beskrevet i trin 1.2.9.2.

2. In-gel Assays for Cx-I og Cx-V

BEMÆRK: Analyserne udføres ved stuetemperatur. Tag billeder, scanninger eller billeder af de udviklende bands til dokumentation. (Vigtigt) Proteiner kan ikke overføres ontO nitrocellulosemembraner efter afslutning af en IGA.

  1. Cx-I assay
    1. Forberedelse.
      1. Forbered en analysebuffer af 5 mM Tris i H20 med en pH på 7,4; Opbevares ved stuetemperatur.
      2. Opløs 10 mg NADH i 1 ml assaybuffer. Opbevares i alikvoter på 100 μl ved -20 ° C indtil anvendelse; Undgå frysning og optøning.
      3. Vejes 25 mg Nitroblue tetrazolium i en mikrotube.
      4. Forbered fiksativet ved at fortynde 5 ml eddikesyre i 95 ml H20; Opbevares ved stuetemperatur.
    2. Udfører analysen.
      1. Kombiner 10 ml assaybuffer med 25 mg Nitroblue tetrazolium (slutkoncentration: 2,5 mg / ml) og 100 μl 10 mg / ml NADH (0,1 mg / ml). Tilføj dette til hele gelen, en bane eller et område af interesse udskåret fra en CN gel.
        BEMÆRK: Dette kan gøres i en klar plast- eller glasbeholder. Bemærk venligst, at dette assay ikke kan udføres efter BN PAGE.
      2. Følg udviklingen af ​​blåbånd efter forsigtig agitation (rocker) i> 3 min.
      3. Fastgør gelen i 10-20 ml eddikesyreopløsning eller vask i 5 mM Tris, pH 7,4 for at stoppe reaktionen. Tag fotografier til dokumentation (se Materialebordet).
  2. Cx-V assay
    BEMÆRK: Cx-V-analysen skal udføres ved anvendelse af dublet CN- eller BN-geler, hvor man inkuberes med 5 μg / ml oligomycin (en Cx-V-inhibitor) for at demonstrere Cx-V-uafhængig aktivitet.
    1. Forberedelse.
      1. Forbered en analysebuffer med 35 mM Tris og 270 mM glycin; Juster pH til 8,3 ved stuetemperatur. Opbevar bufferen frosset i 50 ml alikvoter, men kontroller pH efter frysning og optøning.
      2. Fremstil 1 M MgS04 i H20; Opbevares ved 4 ° C indtil brug.
      3. Vægt 27,28 mg Pb (NO3) 2 i en mikrotube.
      4. Vej 60 mg ATP i en mikrotube.
      5. Opløs 1 mg oLigomycin i 1 ml ethanol. Opbevares ved -20 ° C indtil brug.
      6. Forbered et fikseringsmiddel ved at blande 50 ml methanol med 50 ml H20; Opbevares ved stuetemperatur.
    2. Udfører analysen.
      1. Inkuber en gel, en bane eller et område af interesse fra en BN- eller CN-gel i 2 timer med forsigtig omrøring (rocker) i 10-20 ml assaybuffer ± 5 μg / ml oligomycin (50-100 μl 1 mg / Ml i ethanol) ved stuetemperatur.
      2. Efter inkubering erstattes bufferen med 14 ml frisk analysebuffer og tilsættes 190 μl 1 M MgSO4 (14 mM), 27,28 mg Pb (NO3) 2 (5 mM), 60 mg ATP (14 mM) 8 mM) og 75 μl oligomycin (hvor det er nødvendigt).
      3. Inkuber med forsigtig omrøring (rocker) og se efter et hvidt bundfald, da bånd på oligomycinbehandlede geler vil give ikke-Cx-V-afhængige bånd.
        BEMÆRK: Udfaldet af bundfaldet kan tage flere timer.
      4. Fastgør gelen i methanol-Baseret fiksativ ( fx 50% methanol), fordi sure opløsninger vil opløse blyfældningen. Fotografere resultaterne.
        BEMÆRK: Blyfældningen forstyrrer ikke Coelsassie-farvningen af ​​gelerne.

3. Proteinoverførsel til nitrocellulose eller polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner

  1. Forbered en overføringsbuffer med 25 mM Tris og 200 mM glycin. Juster pH til 8,3 og tilsæt 0,0005 g / l SDS og 200 mL / L methanol. Opbevares ved stuetemperatur.
    1. Skær en nitrocellulose- eller PVDF-membran (porestørrelse: 0,45 μm) med et knivblad eller en saks til en størrelse, der er lidt større end gelen.
      BEMÆRK: Nitrocellulosemembraner tillader Ponceau S-farvning for at vurdere proteinbelastning, mens PVDF-membraner giver mere skarpt definerede bånd.
  2. Protokol.
    1. Sug nitrocellulose membranen, filterpapiret og svampene for aMindst 10 minutter i overføringsbuffer. Placer PVDF membranen i 100% methanol i 15 s eller i henhold til producentens anbefaling, før den placeres i overføringsbuffer. Anbring overgangskassens åbne kassette i en flad skål med overføringsbuffer.
    2. Placer svampen og 1-2 lag filterpapir på bagsiden af ​​kassetten. Fjern boblerne.
    3. Placer gelen på filterpapiret. Angiv gelens orientering ved at klippe et hjørne af gelen og / eller membranen.
    4. Placer membranen på toppen af ​​gelen. Fjern alle bobler.
    5. Placer filterpapir og en svamp oven på membranen. Fjern alle bobler i denne sandwich.
    6. Luk kassetten og læg den i kassetteholderen på overføringssættet.
    7. Overfør proteinerne ved 25 V i ca. 12-18 timer.

4. Immunoblotting

  1. Forberedelse.
    1. Forbered en Ponceau-flade (500 ml) ved tilsætning af 25 mlEddikesyre og 0,5 g Ponceau S til 475 ml H20; Opbevares ved stuetemperatur (kan genanvendes).
    2. Fremstil Tris-pufret saltvand (TBS) med 200 mM NaCl, 25 mM Tris-Base og 2,7 mM KCI. Juster pH til 8,0 og opbevar ved stuetemperatur.
    3. Forbered TBS-tween (TBST) ved at tilsætte 0,5 ml / L Tween 20 til TBS; Opbevares ved stuetemperatur.
    4. Klargør mælkefaststoffer / TBST ved at opløse 5 g mælkefaststoffer i 100 ml TBST. Opbevares ved 4 ° C og brug inden for 3 dage.
    5. Forbered BSA / TBST ved at opløse 3 g bovint serumalbumin (BSA, fraktion V) i 100 ml TBST. Opbevares ved 4 ° C og brug inden for 3 dage.
  2. Protokol.
    1. Når overførslen er færdig, placer membranen i Ponceau S opløsning for at visualisere alle overførte proteiner. Mærker markørernes position på membranen med en blyant og dokumenterer Ponceau-S-farvet membran ved fotografi eller scanning.
    2. Vask membranen 3 gange i 10 minutter hver wiTBS under forsigtig omrøring.
    3. Blok membranen med mælkefaststoffer / TBST i 1-2 timer ved stuetemperatur eller natten over i et koldt rum med mild omrøring.
    4. Vask membranen i 10 minutter med TBST under forsigtig omrøring.
    5. Inkuber med primært antistof natten over i det kolde rum under forsigtig omrøring. Fortynd antistoffet ( fx 1: 1000 for anti-ATP5A og -NDUFB6) i BSA / TBST.
      BEMÆRK: De fleste antistoffer giver et bedre signal på membraner fra native geler, når de inkuberes natten over.
    6. Vask membranen i 10 minutter med TBST under forsigtig omrøring.
    7. Inkuber med sekundært antistof i mindst 60 minutter ved stuetemperatur, uden forsigtig omrøring. Fortynd antistoffet (1: 5000 til 1: 50.000) i mælkefaststoffer / TBST.
    8. Vask membranen 3 gange i 10 minutter ved stuetemperatur med TBST-uhørt blid omrøring.
    9. Under den sidste vask skal du forberede det forbedrede kemoluminescens (ECL) substrat i henhold til instruktionerne fra manufacturer.
    10. Inkuber membranen med ECL-substrat ved hjælp af instruktioner fra producenten.
    11. Registrér signalet på filmen ved hjælp af instruktioner fra producenten af ​​ECL-substratet.

5. Elektroeluution

  1. Forberedelse.
    1. Fremstill en elueringsbuffer af 25 mM tricin, 3,75 mM imidazol (pH 7,0 ved 4 ° C) og 5 mM 6-aminohexansyre.
      BEMÆRK: Brug altid handsker, mens du håndterer elektrolytteren og membranhætten for at forhindre forurening med eksterne proteiner.
  2. På dagen før elektroeluteren anvendes til naturlig elektroeluering skal du udføre følgende:
    1. Sug membrankapslerne (cut-off: 3,5 kDa) i elueringsbuffer i 1 time ved 60 ° C. Overfør kappen til frisk elueringsbuffer og blød dem i 12 timer eller længere i køleskabet.
      BEMÆRK: En afskærende molekylvægt på 3,5 kDa forhindrer tab af små pRoteiner, der let kan dissociere fra proteinkomplekset af interesse.
    2. Vask elektrolyttermodulet, glasrørene, tanken og låget grundigt med ethanol. Skyl med vand og lad udstyret tørre.
  3. På dagen for oprindelig elektroelution skal du gøre følgende.
    1. Placer en frit i bunden (frostet) af hvert glasrør, der skal anvendes. Hvis det er nødvendigt, anbring glasrøret i elueringsbuffer og skub fritteren fra indersiden til bunden af ​​røret.
    2. Skub glasrøret med frit i modulet på elektroelederen. Våd røret med elueringsbuffer og skub glasrøret på plads. Sørg for, at glasrørets toppe er lige med hulrummet.
    3. Luk de tomme grommets med propper.
    4. Anbring en våd membranhætte i bunden af ​​silikone adapteren og fyld adapteren med elueringsbuffer. Sæt langsomt bufferen i adapteren op og ned for at fjerne eventuelle luftbobler omkring dialysemembranen. </ Li>
    5. Skub den bufferfyldte adapter til bunden af ​​glasrøret. Fjern alle bobler, der vises på frit i glasrøret.
    6. Fyld hvert glasrør med elueringsbuffer.
    7. Placer de udskårne bånd på BN PAGE i glasrørene (se trin 1.2.9.3). Skær store stykker i mindre stykker. Sørg for, at fyldehøjden i glasrøret er omkring 1 cm.
    8. Anbring hele modulet i tanken.
    9. Tilsæt ca. 600 ml kold elueringsbuffer til tanken. Sørg for, at silicium-adapterkapslerne er i bufferen for at forhindre bobler i dialysemembranen.
    10. Anbring en omrøringsstang i bunden af ​​tanken.
      BEMÆRK: Omrøring forhindrer bobler i at klæbe til bunden af ​​dialysemembranen.
    11. Eliminer proteinerne i 4 timer ved 350 V i et koldt rum.
    12. Efter elueringen er afsluttet, fjern elektroeluter modulet fra buffertanken og læg den i en vask eller skål.
    13. Hvis en stopper blev brugt, skal du fjerne den for at trækkeI det øvre bufferkammer. Ellers skal du bruge en stor pipette til at fjerne bufferen.
    14. Fjern bufferen fra hvert glasrør og kassér. Sørg for, at silikone adapteren forbliver på plads, og at væsken under fritiden ikke forstyrres eller rystes.
    15. Fjern forsigtigt siliconeadapteren sammen med membranhætten fra bunden af ​​glasrøret. Pipetter indholdet (ca. 400 μL) af silikonehætten i en mikrotube. Med en anden 200 μl elueringsbuffer skylles siliciumdækslet og tilsættes til mikrotuben. Gentag for alle glasrør.
    16. Da membranhætterne kan genbruges, bevares membranhætterne ved at placere dem i elueringsbuffer indeholdende 0,5 mg / ml natriumazid. Køle dem.
      BEMÆRK: Eluatet har lav proteinkoncentration og kan koncentreres ved anvendelse af en centrifugalfilterindretning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at visualisere mitokondrielle superkomplekser blev frisk isoleret mitokondrier fra mus anvendt 17 , 18 . Mitokondrielle superkomplekser er følsomme over for gentagne cyklusser om frysning og optøning, hvilket fører til deres opløsning, selv om dette kan være acceptabelt for nogle forskere. Hvis frysning er nødvendigt til opbevaring, for at sikre de bedste resultater, skal prøver ikke undergå mere end en cyklus med frysning og optøning.

For at visualisere mitokondrie ETC-komplekserne med BN PAGE blev 100 μg protein fra isolerede hjerte mitokondrier på en 4-10% gel ( Figur 1A ). Coomassie-pletten i påfyldnings- og katodepufferen er tilstrækkelig til at mærke proteinkomplekserne under løbetidet. Superkomplekser vises efter at have øget kontrasten digitalt (ikke vist). For CN PAGE, to prøver på 20 μg oF-protein fra isolerede mitochondrier blev påført på en 3-8% CN-gel og adskilt ( figur 1B ). CN PAGE blev farvet med Coomassie og destrueret for at visualisere proteinkomplekserne. Efter at have øget kontrasten digitalt optrådte flere proteinkomplekser med en molekylvægt større end monomeren af ​​Cx-I ( Figur 1B , højre). De anvendte koncentrationer af AAB tilladt for de største superkomplekser for kun at komme ind i gelen fra brønden. En gel, der slutter med en gradient på mindre end 3% AAB, er imidlertid ikke stabil nok til at manipulere til overførsel eller til udskæring af et bånd eller bane. Derudover opretholder den lave koncentration af AAB i de øvre dele af 3-8% CN gelerne en vis mobilitet af proteinkomplekserne, hvilket er vigtigt, hvis man overvejer naturlig elektroeluering 19 .

Monomerer og superkomplekser af Cx-I og monomerer, dimerer og superkomplekser af CXV er enzymatisk aktive og kan visualiseres af IGA ( figur 1C- F ). Analyserne viser, at Cx-I og Cx-V i isolerede hjerte mitokondrier er til stede i proteinkomplekser, der er større end deres respektive monomerer. I IGA-analysen for Cx-I oxideres NADH, og elektroner overføres for at reducere nitroblue tetrazolium. Dette resulterer i en lokaliseret blå farve ved molekylvægten af ​​Cx-I-monomerer og Cx-I-holdige respirasomer / superkomplekser ( figur 1C ). Aktiviteten af ​​Cx-V vurderes ud fra F1-underenhedens evne til at hydrolyse ATP og kan gøres ved anvendelse af CN eller BN-geler ( figur 1D- F ). Den ADP, der genereres fra denne reaktion, interagerer med bly og resulterer i et hvidt bundfald i niveauet af Cx-V-monomerer, dimerer, syntasomer og subkomplekser (sandsynligvis den uassocierede F1-del af Cx-V). Bemærk at oligomycin eliminerer lAbeling af disse bands, bekræfter at de indeholder Cx-V ( Figur 1E ).

For alle de her beskrevne eksperimenter blev det zwitterioniske detergent, lauryl maltosid, anvendt i en koncentration på 2 μg / 1 μg protein, hvilket er den højest mulige koncentration, som bevarer superkomplekserne, samtidig med at der opnås konsistente og reproducerbare resultater ( figur 1F ). Effektiviteten af ​​laurylmaltosid afhænger imidlertid af lotnummeret, opbevaringsbetingelserne og alderen. Således er den nøjagtige koncentration, der anvendes i et laboratorium, ikke nødvendigvis den samme som beskrevet i manuskripter. Den korrekte koncentration af detergent vil solubilisere membranerne, men holde komplekserne og superkomplekserne intakte og skal bestemmes ved anvendelse af forskellige koncentrationer af laurylmaltosid ( figur 1F ). For CN PAGE blev en samlet prøvevolumen på 40 μl pr. Brønd forberedtRedigeres her, hvilket resulterer i et protein / detergentforhold på 1 μg / 2 μg eller et detergent / buffer-forhold på 1 μg / 1 μl (lig med 1,9 mM). Fra 40 μl blev 30 μl påført pr. Brønd af mini-gelen; De resterende blev brugt som en alikvot til påvisning af VDAC, en belastningskontrol ( figur 2D ).

Til immunblotting foretrækkes CN for BN PAGE fordi proteinerne ikke er fyldt med Coomassie, hvilket kan interferere med påvisning af antistoffer. Figur 2 viser påvisningen af ​​superkomplekser indeholdende Cx-I- og Cx-V-proteinerne NDUFB6 og ATP5A fra isolerede hjerte-, lever- og hjerne-mitokondrier. Ponceau S mærkning efter overførsel og før immunblotting kan anvendes til at markere molekylvægtmarkørerne og for at kontrollere proteinindlæsning ( Figur 2A ). Dette vil visualisere monomerer af proteinkomplekserne af ETC på nitrocellulOse membraner, men Ponceau S mærkning er ikke altid tilstrækkelig til visualisering af mitokondrielle superkomplekser ( Figur 2A ), som kan opnås ved immunoblotting.

Cx-I samles ikke i dimerer og tetramerer i sig selv, men danner stadig større molekylvægt-superkomplekser med Cx-III og Cx-IV 14 , 20 , 21 . Her viser anvendelse af et antistof mod NDUFB6 at prøven fra hjertet indeholdt mere Cx-I monomer og højmolekylære superkomplekser (topbånd), som mitokondrier fra leveren eller hjernen ( figur 2B ). Mængden af ​​mellomstore respirasom-superkomplekser var også meget højere i hjertet end i de andre væv ( figur 2B ).

Ved anvendelse af anti-ATP5A-antistoffer,Monomerer af Cx-V kan påvises i mitokondrier fra alle væv, mens et særskilt mønster af bånd, der er repræsentative for dimerer (D) og større superkomplekser (SC), som er tydeligt synlige i hjerte mitokondrier, ikke er så fremtrædende i lever- og hjerne mitokondrier ( Figur 2C ). Overeksponering (1 min mod 20 s) af immunoblot viser adskillige Cx-V-holdige superkomplekser, som kunne repræsentere tetramer og syntasomer ( figur 2C ). Disse mønstre af Cx-V-indeholdende proteinkomplekser i hjerte-, lever- og hjerne mitokondrier viser forskelle, der kan være vævsspecifikke og endnu ikke blevet udforsket.

Proteinindlæsning af disse blots kan efterfølges af Ponceau S-farvning og VDAC-detektion af ovennævnte alikvot ved SDS PAGE som vist i figur 2D .

Ikke alle antiboDyser er egnede til at detektere et protein inden for den kvaternære eller tertiære struktur af et proteinkompleks efter native PAGE. For at overvinde dette problem kan hele og delvise baner fra den oprindelige gel monteres på en denatureringsgel for en anden dimension (2D geler, se Reference 13 for en demonstration). 2D elektroforese er et værdifuldt værktøj til visualisering af proteiner i et supramolekylært kompleks. Som vist i figur 2 er superkomplekser imidlertid til stede i variable mængder, og signalet fra individuelle proteiner fra superkomplekser kan være svært at visualisere i den anden denatureringsdimension. For at overvinde dette problem blev elektroelueringen af ​​proteinkomplekser fra native geler anvendt her. Dette isolerer superkompleksbånd fra flere baner for at give mere materiale til videre undersøgelse.

Ved anvendelse af elektroelution er kun det interesserede bånd, som er blevet identificeret af IGA og / eller visualiseret på en BN PAGE, excseret; Proteinerne fra dette stykke gel renses yderligere ved eluering fra gelen. Figur 3A viser en bane af en BN PAGE, fra hvilken bånd der repræsenterer monomeren blev udskåret til elektroeluering. For at vurdere monomerens Cx-V-aktivitet efter elektroeluering blev eluatet påført på en anden CN PAGE. Eluatet af monomeren indeholder stadig enzymatisk aktivt Cx-V, men subkomplekser fremgår også ( figur 3B ). Sølvfarvning af eluatet efter native CN PAGE ( Figur 3C ) eller denaturerende SDS PAGE ( Figur 3D ) indikerer tilstedeværelsen af ​​proteiner i eluatet, og immunoblotting mod ATP5A indikerer tilstedeværelsen af ​​Cx-V i begge prøver ( Figur 3D ).

figur 1
Figur 1: Visualisering af MitochOndrial superkomplekser. ( A ) To baner med en 4-10% BN maxi-gel, med prøver af isolerede hjerte mitokondrier. Alikvoter af den samme prøve blev kørt i begge baner ved 100 μg protein pr. Brønd. Monomererne af proteinkomplekser I, II, III, IV og V i ETC er tydeligt synlige og mærkes til højre for gelen. ( B ) To prøver af hjerte mitokondrier (1 og 2, 20 μg protein / bane) blev separeret på en CN PAGE og visualiseret ved Coomassie-farvning. SC angiver superkompleksernes position efter forstørrelse og digital forstærkning af den øverste del af gelen (området er angivet med røde pile). ( C ) 20 μg mitochondrialprotein blev separeret på en 3-8% CN PAGE og blev behandlet for Cx-I IGA. Forstørrede og digitalt forbedrede billeder demonstrerer bånd af Cx-I reaktionsprodukt. ( D ) 20 μg mitochondrialprotein blev separeret på en 3-8% BN PAGE og behandlet for Cx-V IGA. Magnifi Ed og digitalt forbedrede billeder demonstrerer bånd af Cx-V reaktionsprodukt. ( E ) 50 μg mitokondrieprotein blev separeret på en 5-15% CN PAGE og behandlet for Cx-V IGA uden (-) og med (+) 5 μg / ml oligomycin (Oligo). ( F ) Mitokondrielt protein (20 μg / bane) blev solubiliseret med 2 - 6 μg lauryl maltosid / 1 μg protein som angivet på toppen af ​​gelen og adskilt på en 3-8% CN-gel efterfulgt af Cx- V IGA. Alle billeder blev fotograferet med enten et lysbord ( A - C ) eller en sort overflade ( D - F ). Kamera specifikationer findes i materialetabellen. Placeringen af ​​molekylvægtmarkørerne (MW) er angivet på venstre side af alle paneler. Forkortelser: D = dimerer; F1 * = subkompleks af Cx-V; LM = lauryl maltosid; M = molekylvægtmarkør; M = monomerer; SC = superkomplekser.G1large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2
Figur 2: Påvisning af mitokondrielle superkomplekser ved immunoblotting. 20 μg protein fra hjertet (H), lever (Li) og hjerne (B) mitochondrier blev separeret på en 3-8% CN PAGE og overført til nitrocellulosemembran. ( A ) Ponceau S-farvning af membranen indikerer tilstedeværelsen af ​​proteinkomplekser og molekylvægtmarkører (m). Den blå pil peger på toppen af ​​gelen. ( B ) Cx-I-proteinet, NDUFB6, blev immunomærket på blottet vist i (A) (1 min eksponeringstid). ( C ) Cx-V blev visualiseret med anti-ATP5A-antistof (20 s og 1 min-eksponering som angivet). De røde pile i (B) og (C) angiver området forstørret og digitalt forbedret til visuaLisering af Cx-I- og Cx-V-holdige superkomplekser, og den blå pil peger på toppen af ​​gelen. ( D ) Ponceau S og immunomærkning af VDAC-alikvoten af ​​hvert ekstrakt anvendt i (A), (B) og (C), som blev adskilt ved SDS PAGE og overført til nitrocellulose. Forkortelser: M = monomerer af Cx-I eller Cx-V, D = dimere af Cx-V, SC = superkomplekser indeholdende Cx-I eller Cx-V. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3: Elektroeluution af Cx-V. ( A ) BN PAGE af en mitochondrial prøve. Det boxede band repræsenterer monomeren af ​​Cx-V, der blev udskåret og elektroelueret. ( B ) Eluatet blev underkastet CN PAGE, og efterfølgende IGA for Cx-V demonstrerer monomerer (M)Og subkomplekser indeholdende F1 af Cx-V. ( C ) Sølvfarvning af CN PAGE af eluatet demonstrerer monomerer (M). ( D ) Sølvfarvning (venstre panel) og immunblot for ATP5A (højre panel) af et denaturerende natriumdodecylsulfat (SDS) PAGE af eluatet indikerer tilstedeværelsen af ​​Cx-V. For SDS PAGE henvises der til protokoller udgivet andetsteds. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En funktionel ETC er nødvendig for mitokondrisk ATP generering. ETC's komplekser kan danne to typer superkomplekser: respirasomer (Cx-I, -III og -IV) 1 og syntasomerne (Cx-V) 2 . Samlingen af ​​hvert kompleks er påkrævet for en intakt ETC, mens organisationen af ​​ETC i superkomplekser antages at øge den samlede ETC-effektivitet 5 , 22 . Hvordan disse superkomplekser samles og demonteres, forstås ikke godt, men de her fremlagte protokoller muliggør en bedre forståelse af disse processer.

Den største udfordring ved at studere ETC-samling er størrelsen af ​​disse proteinkomplekser. For eksempel kan mitokondrie respirasomer bestå af Cx-I (ca. 880 kDa) og et eller flere molekyler Cx-III (460 kDa) og Cx-IV (200 kDa, aktiv som dimer), hvilket resulterer i en superkompleks med en molekylær Vægt på ca.2000 kDa. Derudover har Cx-V en molekylvægt på ca. 600 kDa, men det har vist sig at samle sig i dimerer, tetramerer, oligomerer og bånd af dimerer 7 , 23 , hvilket resulterer i superkomplekser med en molekylvægt på mindst 2.000 kDa. I betragtning af den enorme størrelse af disse superkomplekser er flere delvist beslægtede tilgange traditionelt blevet brugt til at identificere og karakterisere disse superkomplekser, af dette laboratorium og af andre 8 , 14 , 24 .

Dette arbejde har vist teknikken for native gel PAGE, hvor aktive proteinkomplekser ekstraheres forsigtigt fra mitokondriamembranen ved brug af milde vaskemidler. Komplekserne migrerer i gelerne primært på grund af deres størrelse og egenladning (CN PAGE) eller på grund af størrelsen og negativ ladning af proteinbundet Coomassie blue (BN PAGE). Disse geler kan farves ved anvendelse af COomassieblå ( f.eks. I CN-geler) eller sølvfarve ( f.eks. I BN og CN PAGE) for at afsløre proteiner.

Lauryl maltosid blev anvendt til de eksperimenter, der blev demonstreret her, fordi dette vaskemiddel fungerede mest pålideligt. Alternativt kan digitonin anvendes til ekstraktion af proteinkomplekser 12 . Data fra mitokondrier isoleret fra voksne hjerter, lever og hjerner er blevet vist her, men disse teknikker er blevet udført på embryonale og voksne hjertehomogenater 8 . Andre har udført denne teknik ved anvendelse af isolerede mitokondrier fra dyrkede celler 24 . Når der anvendes vævshomogenater eller dyrkede celler med et højt DNA-indhold, kan det imidlertid være nyttigt at tilsætte en nuklease for at forhindre striber under elektroforese 25 .

Aktiviteten af ​​de forskellige komplekser kan analyseres direkte i gelen som vist her for Cx-I og Cx-V og tecHniques er også tilgængelige for at undersøge aktiviteterne i Cx-II, -III og -IV 12 . Imidlertid skal analysen af ​​disse IGA'er gøres nøje. For det første kunne den enzymatiske reaktion skyldes ikke-ETC-enzymer eller ufuldstændigt sammensatte komplekser. For eksempel er det rutinemæssigt at udføre Cx-V IGA med en parallel gel, der er blevet behandlet med oligomycin for at inhibere intakt Cx-V ( figur 3 ). Derudover kan andre NADH-oxidaser tegne sig for Cx-1 in-gel-aktivitet. Man kan udføre en parallel IGA i nærvær af en Cx-I-hæmmer, såsom rotenon. Imidlertid blev i figur 1 anvendt isolerede mitokondrier, så cytoplasmatiske NADH-oxidaser ikke var til stede; Således repræsenterer data sandsynligvis Cx-I-indeholdende monomerer og superkomplekser. Derudover er kvantificeringen af ​​disse resultater mulig ved at måle signalintensiteten af ​​båndene på fotografier eller scanninger. Ulemper med denne tilgang indbefatter forskellene mellem ogInden for geler, reaktionsproduktets mobilitet, manglende evne til at kvantificere produktet tilstrækkeligt i hele dybden af ​​gelen og den potentielle ikke-linearitet af reaktionen 27 . For at overvinde sidstnævnte har nogle foreslået at opnå reaktionshastigheder ved hjælp af serielle fotografier, men det er ikke blevet testet her.

Proteinet i native geler kan også overføres til membraner, og båndets proteinsammensætning kan undersøges ved immunoblotting (demonstreret her) eller 2D PAGE (demonstreret i reference 13 ). Monomerer af ETC-komplekserne er traditionelt blevet identificeret ved deres overflod i native geler af isolerede mitokondrier, deres placering i gelen og deres position i forhold til det molekylære markørprotein ( figur 1 ). Endvidere hjælper mærkning af efterfølgende immunblots med antistoffer specifikke for underenheder af forskellige komplekser at identificere komplekset og sammensætningenAf superkomplekser. Derfor identificerer anti-NDUFB6 og -ATP5A monomerer af og superkomplekser, der indeholder henholdsvis Cx-1 og Cx-V som vist her. Antistoffer mod Cx-II til IV kan anvendes til samme formål. I nogle tilfælde kan antistoffer, der virker godt i denatureringsgeler, muligvis ikke fungere godt i native geler på grund af det faktum, at nogle antistoffer er specifikke for denatureret protein, eller at en epitop kan maskeres af andre proteiner i et indfødt kompleks.

Den nøjagtige bestemmelse af molekylvægten af ​​disse superkomplekser er vanskelig, da de fleste tilgængelige molekylvægtmarkører ligger under størrelsen af ​​Cx-V-monomerer. Migrering af proteinkomplekser i en nativ gel afhænger af størrelsen, den egentlige ladning og det anvendte vaskemiddel 28 . I eksemplerne her blev monomerer af komplekserne identificeret baseret på geler, markører og immunoblotting. Dimere af Cx-V blev identificeret baseret på relativ migration sammenlignet med monomerer af Cx-I og -V og på immunblotting. Alt andet end monomererne og dimerne i geler, IGA'er og immunoblotter anses for at være superkomplekser.

Native immunoblots kan også kvantificeres for superkomplekser ved at analysere båndtæthed under anvendelse af standardteknikker. Denne metode blev ikke vist her, men en ny offentliggørelse viser denne teknik 8 . Normalisering af proteinindlæsning kan udføres ved anvendelse af den Ponceau-røde farvning af banen eller ved at lagre en prøve af mitokondrieekstrakten for at måle VDAC-båndets densitet på en denaturerende immunoblot ( figur 2A og D ). Endvidere er undersøgelsen af ​​forholdet mellem superkomplekser og monomerer i samme immunoblot en anden måde at kvantificere båndtætheden på, men man skal være forsigtig med at tage billeder på forskellige tidspunkter under blotudvikling, så båndene ikke er overbelastede.

Endelig kan bånd fra native geler blive elektroelueret for at generere purifieD, aktive proteinkomplekser, der kan samle sig i højere ordenskomplekser og kan anvendes til yderligere undersøgelser af kompleks funktion. Cx-V-monomerer blev for eksempel elektroelueret og rekonstitueret i liposomer for at demonstrere den elektriske funktionalitet 29 . En alternativ tilgang til naturlig elektroelution elueres ved passiv diffusion i den omgivende buffer 16 , men dette er langsomt sammenlignet med nativ elektroeluering. Endelig opretholder et stort problem med elektroelution den enzymatiske funktion af det elektroeluerede proteinkompleks, da komplekset kan dissociere under rensning. Derfor vil enhver analyse af funktion efter isolering ved denne teknik skulle testes stringent.

Ved at kombinere disse protokoller med enzymatiske analyser og iltforbrugsmålinger, som proberer funktionen af ​​individuelle ETC-komplekser og aktiviteten af ​​hele ETC 30 og andre methOds, såsom den krystallografiske 31 og elektronmikroskopiske 32 evaluering af strukturen af ​​komplekser og superkomplekser, kan et komplekere billede af ETC's indre virkninger fremkomme. Vi er tættere på at forstå, hvordan komplekserne samles, hvordan elektroner strømmer ned i kæden, og hvordan protoner pumpes over membranen for at generere gradienten og derefter strømme tilbage til matrixen gennem Cx-V for at generere ATP. Utvivlsomt vil disse teknikker blive yderligere raffineret for at give yderligere detaljer om strukturen, funktionen og den dynamiske regulering af ETC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra American Heart Association Founders Affiliate [12GRNT12060233] og Strong Children's Research Center ved University of Rochester.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protean II mini-gel chamber Biorad 1658004 Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis
Protean XL maxi-gel Biorad 1653189 Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis
Gradient maker, Hoefer SG15 VWR 95044-704 Pouring mini-gel gradients
Gradient maker, maxi-gel VWR GM-100 Pouring maxi-gel gradients
Transfer kit Biorad 1703930 Complete set to wet transfer of proteins onto membranes
Electroeluter model 422 Biorad 1652976 Electroelution of proteins from native or SDS PAGES
Glass plates Biorad 1653308 Short plates
Glass plates Biorad 1653312 Spacer plates
Glass plates Biorad 1651823 Inner plates
Glass plates Biorad 1651824 Outer Plates
Power supply Biorad 1645070 Power supply suitable for native electrophoresis
ECL-Western  Thermo Scientific 32209 Chemolumniscense substrate
SuperSignal-West Dura Thermo Scientific 34075 Enhanced chemolumniscense substrate
Film/autoradiography film GE Health care 28906845 Documentation of Western blots
Film processor CP1000 Agfa NC0872640
Canon Power Shot 640  Canon NA Taking photos to document gels, membranes and blots.
Canon Power Shot 640 Camera hood  Canon shielding camera for photos being taken on a light table
Acrylamide/bisacrylamide Biorad 1610148 40% pre-mixed solution
Glycine Sigma G7403
SDS (sodium dodecyl sulfate) Invitrogen 15525-017
Tris-base Sigma T1503 Buffer
Tricine Sigma T0377
Sodium deoxychelate Sigma D66750 Detergent
EDTA Sigma E5134
Sucrose Sigma S9378
MOPS Sigma M1254 Buffer
Imidazole Sigma I15513 Buffer
Lauryl maltoside Sigma D4641 Detergent
Coomassie G250 Biorad 161-0406
Aminohexanoic acid Sigma O7260
Native  molecular weight kit GE Health care  17-0445-01 High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis.
Name Company Catalog Number Comments
NADH Sigma N4505
Nitroblue tetrazolium Sigma N6639
Tris HCl Sigma T3253
ATP   Sigma A2383
Name Company Catalog Number Comments
Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2): Sigma 228621
Oligomycin Sigma O4876
Name Company Catalog Number Comments
Ponceau S Sigma P3504
anti-ATP5A Abcam ab14748 antibody to ATP synthase subunit ATP5A
anti-NDUFB6 Abcam ab110244 antibody to Cx-1 subunit NDUFB6
anti-VDAC Calbiochem 529534 antibody to VDAC
ECL HRP linked antibody GE Health Care NA931V secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC
Blocking reagent Biorad 170-6404
BSA
sodium chloride Sigma S9888
potassium chloride Sigma P9541
EGTA Sigma E3889
Name Company Catalog Number Comments
Silver staining Kit Invitrogen LC6070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lenaz, G., Genova, M. L. Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation. Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).
  2. Saks, V., et al. Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells. J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).
  3. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
  4. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  5. Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
  6. Hahn, A., et al. Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology. Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).
  7. Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).
  8. Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes. PloS one. 9 (11), e113330 (2014).
  9. Genova, M. L., Lenaz, G. The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging. Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).
  10. Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
  11. Kuter, K., et al. Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).
  12. Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes. Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).
  13. Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. (48), (2011).
  14. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  15. Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III. Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).
  16. Giorgio, V., et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).
  17. Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria. J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).
  18. Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia. Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).
  19. Schagger, H. Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).
  20. Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
  21. Schafer, E., et al. Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).
  22. Wittig, I., Schagger, H. Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes. Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).
  23. Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).
  24. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  25. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  26. Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).
  27. Glancy, B., Balaban, R. S. Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).
  28. Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).
  29. Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).
  30. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain. J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).
  31. Zickermann, V., et al. Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I. Science. 347 (6217), 44-49 (2015).
  32. Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. Structure of mammalian respiratory complex I. Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).

Tags

Biochemistry Mitochondria elektron transportkæde respirasomer syntasomer klar native elektroforese in-gel assays elektroelution
Analyse af superkomplekser af den mitokondrieelektron transportkæde med indfødte elektroforese, in-gel analyser og elektrolysering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beutner, G., Porter Jr., G. A.… More

Beutner, G., Porter Jr., G. A. Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution. J. Vis. Exp. (124), e55738, doi:10.3791/55738 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter