העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות
Summary
פרוטוקול fractionation מקוצר העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות מתואר.
Abstract
במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול מקוצרת fractionation צעד אחר צעד העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות. ? הנוזל יוניים לאוריל-N-sarcosine (sarkosyl) solubilizes ביעילות באופן מקורי מקופל חלבונים ברקמת המוח המאפשר את העשרת של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מתוך מגוון רחב של proteinopathies ניווניות, כגון מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון, נוירודגנרטיביות ומחלות פריון. לשליטת האדם ורקמות המוח לאחר המוות לספירה היו הומוגני, sedimented על ידי ultracentrifugation בנוכחות sarkosyl להעשיר אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס כולל פיפטות phosphorylated טאו, מרכיב מרכזי neurofibrillary קשרים לספירה. סופג המערב הפגינו המסיסות דיפרנציאלית של טאו phosphorylated צבור, החלבון דטרגנט מסיסים, מוקדם 1 אנטיגן אנדוזום (EEA1) ב AD המוח ובקרה. ניתוח פרוטיאומיה מבנית גם גילה העשרה של β-עמילואיד (Aβ), טאו, snRNP70 (U1 – 70 K), ו אפוליפופרוטאין E (ספקיות) ב sarkosyl-לא מסיס שברים של המוח לספירה בהשוואה לאלו של שליטה, בקנה אחד עם אסטרטגיות fractionation רקמות הקודם . לפיכך, פרוטוקול העשרה פשוטה זה הינו אידיאלי עבור מגוון רחב של יישומים ניסיוני החל סופג המערבי חלבון פונקציונלי צבירת שיתוף מבחני פרוטאומיקס מבוססי ספקטרומטר מסה.
Introduction
מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון (HD), נוירודגנרטיביות (ALS) ומחלות של פריון הקשורים קשר הדוק הן proteinopathies מאופיין על ידי הצטברות הדרגתית של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס במוח. עם ליווי קוגניטיבית לסרב. 1 , 2 תכונה פתולוגית משותפת זו הוא חשב לשחק תפקיד מרכזי אטיולוגיה, פתופיזיולוגיה של אלה מחלות ניווניות. 2 אגרגטים אלה בדרך כלל מורכבים של סיבי עמילואיד פולימריים, אשר מורכבים של חוזרות יחידות של חלבונים misfolded מפגין צלב β-מבנה. 1 , 2 , 3 , 4 . מבחינה ביוכימית, אגרגטים עמילואיד הם עמידים מאוד בפני דנטורציה כימי או תרמי ו- solubilization,3 אשר מציג אתגרים ייחודיים על טיהור שלהם, ניתוח וללמוד באמצעות טכניקות מסורתיות הביוכימי. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 באופן לא מפתיע, השבר לא מסיס-אבקת חלבון הייתה המוקד של מחקרים רבים לתוך הפתופיזיולוגיה של מחלות ניווניות הקשורות ההצטברות של חלבונים misfolded. 6 , 12 , 13 , 14
טכניקות fractionation הביוכימי כבר נעזרו לעיתים קרובות כדי להעשיר את השבר דטרגנט-לא מסיס מן המוח לאחר המוות homogenates. 6 , 12 , 13 , 14 באחת השיטות הנפוצות ביותר כרוך החילוץ רציפים של רקמת homogenates עם מאגרי וחומרי ניקוי של הגדלת לכתחילה, ואחריו ultracentrifugation מחיצות שברים מסיסים ובחלקם לא מסיסים. נפוץ fractionation רציפים פרוטוקול6,14 מערבת את המגון דגימות רקמה קפוא במאגר מלח נמוכה ללא דטרגנט (האם), כדורי לא מסיסים תוצאות ואז מופקים באופן רציף עם מאגרי המכילה מלח גבוהה, חומרי ניקוי ללא יונית, סוכרוז גבוהה, דטרגנטים יוניים, ולבסוף chaotropes כמו שתנן. 6 , 14 חסרון ברור מהפרוטוקולים fractionation רציפים הוא זמן ניכר ומחויבות לעבודה הדרושה כדי להשלים אותם. כולל המגון ultracentrifugation, פרוטוקול טיפוסי fractionation חמישה צעדים יכולה לקחת כמה שעות או אפילו ימים כדי להשלים. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 . בנוסף, אגרגטים חלבון פיפטות רבים נותרים מסיסים בסך הכל, אבל ה19,החריפה תנאים20 רוב השברים שנוצר הם בעלי ערך מוגבל. כך, המדרגות fractionation פחות מחמירים ניצול ריכוז המלח גבוה ודטרגנטים ללא יונית הם במידה רבה מיותר.
מחקרים קודמים הראו כי הנוזל יוניים לאוריל-N-sarcosine (sarkosyl) הוא מועמד מצוין עבור פרוטוקול fractionation דטרגנט מפושטת של צעד אחר צעד. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 כמו חומר ניקוי denaturing, sarkosyl היא מחמירה מספיק כדי solubilize הרוב המכריע של חלבונים מקופלים מקורי במוח ללא solubilizing אגרגטים חלבון misfolded המורכב בטא עמילואיד (Aβ),6,11 טאו phosphorylated (pTau),6 זפת DNA מחייב חלבון 43 (TDP-43),14 אלפא-synuclein,12,13 scrapie,23 או U1 קטן הגרעין ribonucleoproteins (U1 snRNPs) כגון U1 – 70 K. 5 , 21 , 22 כמו sarkosyl הוא פחות מחמירים יותר סולפט dodecyl בכל מקום anionic נתרן דטרגנט (מרחביות), שומרת על צורות oligomeric פחות חזקים של אגרגטים חלבון misfolded שלא יכול לעמוד טיפול מרחביות. 9
בעבר, תיאר לנו פרוטוקול דטרגנט-fractionation מקוצר להשיג תוצאות להשוות מתודולוגיות fractionation רציפים יותר מפרך. 5 על-ידי השמטת את השלבים fractionation מחמירים פחות, הצלחנו לפתח פרוטוקול נתיישב fractionation צעד אחר צעד העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות. 5 פרוטוקול מפורט זה המתוארים בזאת הוא גם מתאים למגוון רחב של יישומים ניסיוני החל סופג המערבי, מבחני מבוססי ספקטרומטר מסה פרוטאומיקס חלבון פונקציונלי misfolding, צבירת זריעה. 5 , 6 , 21
Protocol
Representative Results
Discussion
בזאת אנו להציג ולדון פרוטוקול דטרגנט-fractionation צעד אחר צעד מקוצר הרלוונטיים למגוון רחב של יישומים ניסיוני ועד ניתוח פרוטאומיקס מסה ספקטרומטר מבוססי חלבונים פונקציונליים misfolding מבחני אפילו השחרת המערבי. 5 , 6 , 7 , 10 מתודולוג…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים ד”ר ג’ים בורסי, אלן Levey, היחידה לנוירולוגיה של אמורי, על הערות מועילות והצעות. עבודה זו מומן בחלקו על ידי האצת שותפות רפואה המענק (U01AG046161-02), אמורי האלצהיימר של מרכז המחקר של המחלה (P50AG025688) ואת הלאומי להזדקנות הענק (R01AG053960-01) ל- N.T.S. מחקר זה גם נתמך בחלקה על ידי הגרעין Neuropathology של המענק אמורי Neuroscience NINDS הליבה מתקנים, P30NS055077.
Materials
| Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X) | Thermo Fisher | 78441 | protease & phosphatase inhibitor cocktail |
| Sonic Dismembrator System (ultrasonicator) | Fisher Scientific | FB505110 | microtip ultrasonicator |
| Optimax TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 361545 | refrigerated ultracentrifuge |
| TLA120.1 rotor | Beckman Coulter | 362224 | ultracentrifuge rotor |
| 500 ul (8x34mm) polycarbonate tubes, thickwall | Beckman Coulter | 343776 | ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor |
| 4X SDS sample buffer | Home-made | N/A | SDS-PAGE |
| TCEP solution, neutral pH | Thermo Fisher | 77720 | reducing agent |
| (TBS) blocking buffer | Thermo Fisher | 37542 | blocking buffer |
| (TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20 | Thermo Fisher | 37543 | blocking buffer and antibody diluent |
| 4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well | Thermo Fisher | NW04120BOX | precast SDS-PAGE gels |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher | B0002 | SDS-PAGE running buffer |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) | Sigma Aldrich | L5777-50G | detergent |
| 1.5 ml polypropylene Pellet Pestle | Kimble Chase | 749521-1500 | homogenization tool |
| cordless motor for Pellet Pestle | Kimble Chase | 749540-0000 | homogenization tool |
| Anti-Tau-2 (pan tau) antibody | Chemicon | MAB375 | antibodies |
| Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody | Millipore | MAB5450 | antibodies |
| Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8) | Thermo Fisher | MN1020 | antibodies |
| Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody | abcam | ab2900 | antibodies |
| Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A21058 | antibodies |
| Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A11374 | antibodies |
| iBlot2 Dry Blotting System | Thermo Fisher | IB21001 | Gel transfer |
| iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini | Thermo Fisher | IB23002 | Gel transfer |
References
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease. Science. 296 (5575), 1991 (1991).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).
- Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).
- Hamley, I. W. The Amyloid Beta Peptide: A Chemist’s Perspective. Role in Alzheimer’s and Fibrillization. Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).
- Diner, I., et al. Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease. J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).
- Gozal, Y. M., et al. Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer’s Disease. J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).
- Hales, C. M., et al. Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer’s Disease progression. PROTEOMICS. , (2016).
- Julien, C., Bretteville, A., Planel, E., Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. . Amyloid Proteins: Methods and Protocols. , 473-491 (2012).
- Nizhnikov, A. A., et al. Proteomic Screening for Amyloid Proteins. PLoS ONE. 9 (12), e116003 (2014).
- Seyfried, N. T., et al. Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards. J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).
- Woltjer, R. L., et al. Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including Aβ but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. FASEB J. , (2005).
- Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. Biochemical Characterization of the Core Structure of α-Synuclein Filaments. J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).
- Hasegawa, M., et al. Phosphorylated α-Synuclein Is Ubiquitinated in α-Synucleinopathy Lesions. J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130 (2006).
- Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association. FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
- Noguchi, A., et al. Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid β-Protein (Aβ) Assembly from Alzheimer Disease Brains. J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer’s disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer’s β-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid. J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).
- Yang, L. -. S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis. J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Hales, C. M., et al. U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer’s disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21. Mol Neurodegener. 9 (1), 15 (2014).
- Xiong, L. -. W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
- Mirra, S. S., et al. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer’s Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer’s disease. Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Guo, J. L., et al. Unique pathological tau conformers from Alzheimer’s brains transmit tau pathology in nontransgenic mice. J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).
- Matveev, S. V., et al. A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer’s disease brain. J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).
