Summary
मानव गुजाइश मस्तिष्क से डिटर्जेंट-अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय के संवर्धन के लिए एक संक्षिप्त आंशिक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है ।
Abstract
इस अध्ययन में, हम मानव गुजाइश मस्तिष्क से डिटर्जेंट-अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय के संवर्धन के लिए एक संक्षिप्त एकल कदम अंश प्रोटोकॉल का वर्णन । ईओण डिटर्जेंट N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) प्रभावी ढंग से solubilizes natively मस्तिष्क ऊतक में जोड़कर प्रोटीन की अनुमति neurodegenerative proteinopathies की एक विस्तृत श्रृंखला से डिटर्जेंट-अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय के संवर्धन, जैसे अल्जाइमर रोग (AD), पार्किंसंस रोग और पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस, और prion रोगों । मानव नियंत्रण और विज्ञापन गुजाइश मस्तिष्क के ऊतकों homogenized और sarkosyl की उपस्थिति में ultracentrifugation द्वारा अवसादी रोग phosphorylated ताऊ, neurofibrillary के कोर घटक सहित डिटर्जेंट-अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय को समृद्ध किया गया विज्ञापन में उलझ । वेस्टर्न सोख्ता ने एग्रीगेट phosphorylated-ताऊ और डिटर्जेंट-घुलनशील प्रोटीन, अर्ली Endosome प्रतिजन 1 (EEA1) के नियंत्रण और विज्ञापन मस्तिष्क में अंतर घुलनशीलता का प्रदर्शन किया । Proteomic विश्लेषण में भी β-amyloid (Aβ), ताऊ, snRNP70 (U1-70K) के संवर्धन का पता चला, और apolipoprotein ई (APOE) विज्ञापन मस्तिष्क के sarkosyl में अघुलनशील नियंत्रण के उन लोगों की तुलना में, पिछले ऊतक भिन्नीकरण रणनीतियों के अनुरूप . इस प्रकार, यह सरल संवर्धन प्रोटोकॉल पश्चिमी सोख्ता और कार्यात्मक प्रोटीन सह एकत्रीकरण परख से लेकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटियोमिक् को लेकर प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए आदर्श है ।
Introduction
अल्जाइमर रोग (AD), पार्किंसंस रोग (पीडी), हटिंगटन के रोग (एचडी), पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस (एस), और बारीकी से संबंधित prion रोगों जैसे Neurodegenerative रोगों के क्रमिक संचय की विशेषता proteinopathies है साथ ही संज्ञानात्मक गिरावट के साथ मस्तिष्क में डिटर्जेंट-अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय । 1 , 2 इस साझा रोग विशेषता इन neurodegenerative रोगों के एटियलजि और pathophysiology में एक केंद्रीय भूमिका निभाने के लिए सोचा है । 2 इन समुच्चय आम तौर पर बहुलक amyloid फाइबर से मिलकर बनता है, जो दोहराया प्रोटीन का प्रदर्शन पार β-संरचना की दोहराने इकाइयों से बना रहे हैं । 1 , 2 , 3 , 4 जैव रासायनिक, amyloid समुच्चय अत्यधिक रासायनिक या थर्मल विकार और solubilization,3 जो पारंपरिक जैव रासायनिक तकनीकों के माध्यम से उनकी शुद्धि, विश्लेषण और अध्ययन करने के लिए अद्वितीय चुनौतियों प्रस्तुत करने के लिए प्रतिरोधी रहे हैं । 2 , 5 , ६ , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 आश्चर्य की बात है, डिटर्जेंट-अघुलनशील प्रोटीन अंश neurodegenerativeed प्रोटीन के संचय से जुड़े रोगों के pathophysiology में ज्यादा शोध का ध्यान केंद्रित किया गया है । ६ , 12 , 13 , 14
जैव रासायनिक भिन्नीकरण तकनीक अक्सर गुजाइश मस्तिष्क homogenates से डिटर्जेंट-अघुलनशील अंश को समृद्ध करने के लिए उपयोग किया गया है. ६ , 12 , 13 , 14 सबसे आम तरीकों में से एक के buffers और डिटर्जेंट बढ़ाने के stringency के साथ ऊतक homogenates के अनुक्रमिक निष्कर्षण शामिल है, ultracentrifugation के लिए घुलनशील और अघुलनशील भागों विभाजन के बाद । एक सामान्य रूप से प्रयुक्त अनुक्रमिक भिन्नता प्रोटोकॉल6,14 एक डिटर्जेंट-मुक्त कम नमक में जमे हुए ऊतक के नमूनों की homogenization शामिल है (एलएस) बफर और परिणामी अघुलनशील छर्रों तो क्रमिक रूप से निकाले जाते हैं उच्च नमक युक्त बफ़र्स, गैर ईओण डिटर्जेंट, उच्च सुक्रोज, ईओण डिटर्जेंट और अंत में यूरिया की तरह chaotropes । ६ , 14 इस तरह के एक अनुक्रमिक आंशिक प्रोटोकॉल का एक स्पष्ट दोष पर्याप्त समय और श्रम उंहें पूरा करने के लिए आवश्यक प्रतिबद्धता है । homogenization और ultracentrifugation सहित, एक ठेठ पांच कदम आंशिक प्रोटोकॉल कई घंटे या दिन भी पूरा करने के लिए ले जा सकते हैं । 4 , ६ , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 इसके अतिरिक्त, के रूप में कई रोग प्रोटीन समुच्चय में अघुलनशील रहना सभी लेकिन कठोर शर्तों19,20 उत्पंन अंशों के अधिकांश सीमित मूल्य के हैं । इस प्रकार, कम-कड़े भिंन कदम उच्च नमक सांद्रता और गैर ईओण डिटर्जेंट का उपयोग मोटे तौर पर बेमानी हैं ।
पिछले अध्ययनों से पता चला है कि ईओण डिटर्जेंट N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) एक सरलीकृत एकल कदम डिटर्जेंट आंशिक प्रोटोकॉल के लिए एक उत्कृष्ट उंमीदवार है । 5 , ६ , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 एक denaturing डिटर्जेंट के रूप में, sarkosyl के लिए काफी कड़े है solubilizinged प्रोटीन समुच्चय बीटा से बना-amyloid (Aβ),6,11 के बिना natively तह प्रोटीन मस्तिष्क में विशाल बहुमत solubilize phosphorylated ताऊ (pTau),6 टीआर डीएनए-बाइंडिंग प्रोटीन ४३ (टीडीपी-४३),14 अल्फा-synuclein,12,13 scrapie,23 या U1 स्मॉल न्यूक्लियर ribonucleoproteins (U1 snRNPs) जैसे U1-70K । 5 , 21 , 22 के रूप में sarkosyl सर्वव्यापी anionic डिटर्जेंट सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) की तुलना में कम कठोर है, यह oligomeric उपचार का सामना नहीं कर सकता है कि एक प्रकार का प्रोटीन समुच्चय के कम मजबूत एसडीएस रूपों को बरकरार रखता है । 9
पहले, हम एक संक्षिप्त डिटर्जेंट-अंश प्रोटोकॉल है कि अधिक श्रमसाध्य अनुक्रमिक भिंन तरीके से तुलनीय परिणाम प्राप्त वर्णित है । 5 कम कड़े भिन्नीकरण चरणों को छोड़ कर, हम गुजाइश मानव मस्तिष्क से डिटर्जेंट-अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय के संवर्धन के लिए एक सतही एकल कदम भिन्नीकरण प्रोटोकॉल विकसित करने में सक्षम थे. 5 इस विस्तृत प्रोटोकॉल वर्णित के साथ साथ प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है पश्चिमी सोख्ता और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटियोमिक् कार्यात्मक प्रोटीन खुलासा और एकत्रीकरण के लिए बीज परख । 5 , ६ , 21
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Protocol
- ऊतक चयन
नोट: स्वस्थ नियंत्रण से जमे हुए गुजाइश ललाट प्रांतस्था ऊतक (Ctl) और रोग की पुष्टि की विज्ञापन मामलों एमोरी से चयनित किया गया ADRC ब्रेन बैंक ( n = 2). amyloid पट्टिका वितरण के पोस्टमार्टम neuropathological मूल्यांकन को अल्जाइमर्स के लिए रजिस्ट्री स्थापित करने के लिए कंसोर्टियम के अनुसार किया गया & #39; s रोग अर्द्ध मात्रात्मक स्कोरिंग मानदंड < सुप वर्ग = "xref" > 24 , यद्यपि Braak मचान प्रणाली के अनुसार neurofibrillary उलझन पैथोलॉजी का आकलन किया गया । < सुप वर्ग = "xref" > १६- स्वस्थ नियंत्रण (गुजाइश) से जमे हुए Ctl मस्तिष्क ऊतक प्राप्त करने और रोग की पुष्टि की विज्ञापन मामलों । सूखी बर्फ के कंटेनरों का उपयोग, संदंश और एक उस्तरा ब्लेड, एक्साइज ~ २५० प्रत्येक ऊतक नमूने पर बारदाना डिस्पोजेबल वजन नौकाओं से ग्रे मैटर के एमजी भागों, देखभाल के लिए गल से ऊतक को रोकने के लिए ले जा । प्रत्येक टुकड़ा के वजन रिकॉर्ड homogenized हो ।
- उत्पाद ~ २५० ग्रे बात के एमजी नेत्रहीन संदंश और उस्तरा का उपयोग करने के लिए बाहरी ग्रे मामले और भीतरी सफेद बात के बीच इंटरफेस का पता लगाने का निरीक्षण । सफेद पदार्थ से बचें और अधिक महत्वपूर्ण बात, किसी भी बड़े रक्त वाहिकाओं या खूनी क्षेत्रों, मेनिन्जेस, या रेशेदार मेटर. जल्दी से काम कर रहे है और अक्सर सूखी बर्फ के साथ polystyrene कंटेनरों में मस्तिष्क ऊतक के साथ वजन नाव रखने से काटने की प्रक्रिया के दौरान जमे हुए ऊतक रखो ।
- एक विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग कर प्रत्येक जमे हुए टुकड़े से एक ग्रे मैटर का सटीक वजन रिकॉर्ड । कम नमक (LS) बफ़र की मात्रा परिकलित करें (तालिका 1 देखें) dounce homogenization के लिए आवश्यक (5 मिलीलीटर/g या 20% w/
- 1x चिढ़ाने और फॉस्फेट अवरोधक कॉकटेल और बर्फ पर ठंड के साथ 10 मिलीलीटर रास बफर तैयार करें ।
- के रूप में यह गल लगभग 2 x 2 मिमी टुकड़ों में तौला ऊतक और सूखी बर्फ और पासा से नाव वजनी निकालें । बर्फ पर 2 मिलीलीटर पूर्व ठंडा dounce homogenizer ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण.
- जोड़ें 5 मिलीलीटर/जी (20% डब्ल्यू/वी) के बर्फ ठंडा कम नमक (रास) बफर के साथ 1x चिढ़ाना और फॉस्फेट अवरोधक कॉकटेल ।
- Homogenize बर्फ पर मस्तिष्क ऊतक उच्च मंजूरी के लगभग 10 स्ट्रोक का उपयोग खल ए और कम निकासी खल B. के 15 स्ट्रोक
- स्थानांतरण सभी homogenate एक 2 मिलीलीटर के लिए एक ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग कर ट्यूब । ट्यूब के साथ लैबल पर & #8220; गु & #8221; (कुल Homogenate), टिशू केस नंबर, और Homogenate मात्रा. & #160; Aliquot ०.८ एमएल में एक लेबल १.५ एमएल ट्यूब । कोई भी अतिरिक्त homogenate इसी प्रकार aliquoted और संग्रहित किया जा सकता है at-८० & #176; C.
- प्रत्येक ०.८ मिलि aliquot, add १०० & #181; L प्रत्येक 5 m NaCl और 10% (w/v) sarkosyl की सांद्रता के लिए ०.५ m और 1% w/v, क्रमशः । मिश्रण ट्यूबों अच्छी तरह से उलटा और बर्फ पर मशीन के लिए 15 min. Label ट्यूबों के साथ & #34; TH-S & #34; (कुल Homogenate-Sarkosyl) से संकेत मिलता है कि homogenates Sarkosyl-बफर ( टेबल 1 ) में हैं.
- Sonicate बर्फ पर 30% आयाम में तीन 5 एस दालों के लिए प्रत्येक ट्यूब (अधिकतम तीव्रता = ४०%) एक microtip जांच का उपयोग कर । & #160;
- homogenates एसिड (बीसीए) परख का उपयोग bicinchoninic के प्रोटीन सांद्रता निर्धारित करें < सुप वर्ग = "xref" > २५ कृती.
नोट: ऊतक के प्रति ग्राम 5 मिलीलीटर रास पर तैयार गु-S homogenates की औसत प्रोटीन एकाग्रता 15-20 मिलीग्राम/एमएल है । homogenates को तुरंत fractionated या संग्रहित किया जा सकता है-८० & #176; C तक उपयोग. - पतला गु-एस homogenates 10 मिलीग्राम/मिलीलीटर का उपयोग कर बर्फ ठंडा स़डक बफर ( तालिका 1 ) 1x को छेड़ो और फॉस्फेट अवरोधकों के साथ ।
- स्थानांतरण 5 मिलीग्राम प्रोटीन (०.५ एमएल) के प्रत्येक गु-S homogenate में ५०० & #181; एल पाली कार्बोनेट ultracentrifuge ट्यूबों और जोड़ी-संतुलन के साथ स़डक बफर । लोड ट्यूबों एक पूर्व ठंडा रोटर और ultracentrifuge में १८०,००० x g पर 30 मिनट के लिए 4 & #176; c. sarkosyl-घुलनशील supernatants (एस 1) को १.५ मिलीलीटर ट्यूबों और स्टोर पर-८० के लिए स्थानांतरण & #176; c.
नोट: (वैकल्पिक वाश) Add २०० & #181; स़डक के एल-ultracentrifuge ट्यूबों के लिए बफर डिटर्जेंट-अघुलनशील भिन्न (p1) युक्त और ultracentrifuge ट्यूबों के नीचे से छर्रों (p1) एक २०० & #181 का उपयोग कर; l पिपेट टीप. - संक्षेप पल्स-2-3 s के लिए उल्टे ट्यूबों स्पिन (& #8804; २,५०० x g ) एक microcentrifuge पर छर्रों (P1) और नीचे १.५ मिलीलीटर ट्यूबों के लिए बफर हस्तांतरण करने के लिए । pipetting अप और नीचे गोली बाधित है सुनिश्चित करने के लिए स़डक बफर में अघुलनशील छर्रों (P1) reसस्पेंड.
- जोड़ी-संतुलन, और १८०,००० पर एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए एक्स जी पर केंद्रापसारक 4 & #176; C. & #160;
- वैकल्पिक धोने supernatant (S2) और sarkosyl-अघुलनशील छर्रों (P2) में 50-75 & #181; एल यूरिया बफर ( तालिका 1 ) 1x PIC (चिढ़ाना और फॉस्फेट अवरोधक कॉकटेल) के साथ 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर solubilize को त्यागें गोली.
नोट: एसडीएस वर्षा से बचने के लिए उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान के लिए गर्म यूरिया बफर । डिटर्जेंट के प्रति संवेदनशील अनुप्रयोगों के लिए, यूरिया बफर से एसडीएस छोड़ दें और यूरिया बफर में reसस्पैंड करने से पहले कम नमक बफर में अघुलनशील गोली (P2) धोने पर विचार करें । - ०.५ मिलीलीटर ट्यूबों के लिए reसस्पैंड छर्रों (P2) स्थानांतरण और संक्षिप्त (1 s) microtip sonication 20% आयाम पर (अधिकतम तीव्रता = ४०%) पूरी तरह से solubilize छर्रों का उपयोग करें ।
- sarkosyl के प्रोटीन सांद्रता-घुलनशील (एस सी) और अघुलनशील (P2) बीसीए परख विधि का उपयोग अंश निर्धारित करते हैं । इन अंशों का तुरंत उपयोग करें या स्टोर पर-८० & #176; C जब तक use.
- western सोख्ता
ध्यान दें: पश्चिमी सोख्ता मामूली संशोधनों के साथ पहले रिपोर्ट की गई प्रक्रियाओं के अनुसार किया गया था । < सुप वर्ग = "xref" > 5 , < सुप class = "xref" > 10- तैयार ४० & #181; कुल homogenates (गु-एस) के जी नमूने, स़डक में घुलनशील (एस 1) और स़डक-अघुलनशील (P2) 1x Laemmli एसडीएस में भिन्न-पृष्ठ नमूना बफर 5 मिमी TCEP पीएच 7 के साथ । ९५ पर मशीन के नमूने & #176; ग के लिए 5 min.
- लोड नमूनों पर एक कच्चा 10-well 4-12% बीआईएस-Tris एसडीएस-PAGE gel. पहले सेंटीमीटर (10 मिनट) और १२० वी शेष के लिए ८० v पर Electrophorese (६० मिनट) या जब तक ट्रैकिंग डाई जेल के नीचे पहुंचता है ।
- विभाजित करने के लिए एक ताजा उस्तरा ब्लेड और जेल चाकू का उपयोग करें-पूर्व कास्ट जेल कैसेट खोलो । धीरे दूर कंघी और एक ताजा उस्तरा ब्लेड के साथ जेल के बहुत नीचे कट ।
- २०० & #181 में अघुलनशील छर्रों (P1) reसस्पेंड; एल स़डक-pipetting द्वारा 1x तस्वीर के साथ बफर ऊपर और नीचे ।
- अंतरण को एक ०.२ & #181; m nitrocellulose झिल्ली एक सोख्ता मशीन पर एक सूखी हस्तांतरण विधि का उपयोग (सामग्री तालिका देखें) ।
- 30 मिनट के लिए 20 के बीच के बिना बफर अवरुद्ध (bb) में झिल्ली ब्लॉक, ०.०५% 20 के बीच के साथ bb के साथ पीछा किया (bb/ ब्लॉक करने के बाद, टीबीएस/T (०.१% के बीच 20) में झिल्ली कुल्ला अतिरिक्त अवरुद्ध बफर को दूर करने के लिए 5 मिनट के लिए ।
- तैयार 1: प्राथमिक एंटीबॉडी के 1000 कमजोर पड़ने pT231, ताऊ-2 (पान ताऊ), AT8 और बी एम टी में EEA1 (०.०५% के बीच 20).
- 4 & #176 में रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में झिल्ली की मशीन परिपत्र आंदोलन के साथ; सी । 3 x 15 मिनट के लिए टीबीएस/टी में झिल्ली कुल्ला
- एक 1 के साथ झिल्ली की जांच: 20000 कमजोर पड़ने के पास-बी एम सी के पास-आईआर माध्यमिक एंटीबॉडी में ६० मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधकार में शेखर पर । टीबीएस में 3 x 10 मिनट के लिए झिल्ली कुल्ला और टीबीएस. में 2 x 5 मिनट
- उपयुक्त उत्तेजना तरंग दैर्ध्य पर एक अवरक्त इमेजिंग प्रणाली का उपयोग झिल्ली स्कैन ( जैसे ७०० एनएम (लाल चैनल) अवरक्त डाई ६८० बकरी विरोधी माउस आईजीजी के लिए (एच + एल) माध्यमिक और ८०० एनएम (ग्रीन चैनल) अवरक्त डाई के लिए ७९० गधा विरोधी खरगोश आईजीजी (एच + एल ) माध्यमिक).
- संकेत तीव्रता यों यों तो इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें और निर्माता & #39 के अनुसार densitometry माप प्रदर्शन, एस निर्देश, ऑटो पृष्ठभूमि सेटिंग सुनिश्चित करने के लिए औसत पूरी पृष्ठभूमि सेट है.
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Representative Results
संक्षिप्त एकल कदम sarkosyl-भिन्नीकरण प्रोटोकॉल नियंत्रण और विज्ञापन गुजाइश मस्तिष्क से डिटर्जेंट-अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय को समृद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (चित्रा 1). गु-एस, एस सी, S2 और P2 अंशों से प्रोटीन एसडीएस द्वारा हल किया गया-PAGE, Coomassie नीले निर्धारण बफर Coomassie शानदार नीले जी-२५० धुंधला बफर के साथ कोमल धुंधला के बाद में 15 मिनट के लिए तय की । resuspension कदम वैकल्पिक है क्योंकि S2 के अंश में प्रोटीन के undetectable स्तर थे (1.1.14 देखें) । पश्चिमी ब्लाट विश्लेषण ( चित्रा 2a और बी) स्पष्ट रूप से दर्शाता है कि विज्ञापन मस्तिष्क में, रोग उच्च आणविक-वजन phosphorylated ताऊ समुच्चय sarkosyl अघुलनशील थे, और बहुत कम pTau में बने रहे sarkosyl-घुलनशील अंश । 5 , ६ , 7 , 8 , 10 , 22 इसके विपरीत, नियंत्रण मस्तिष्क में pTau के बहुमत sarkosyl में विभाजित-घुलनशील अंश । 5 , ६ , 10 इसके विपरीत, EEA1 मुख्य रूप से दोनों नियंत्रण और विज्ञापन मस्तिष्क (चित्रा 2c) में एस 2 के अंश में विभाजन । यहां, EEA1 सबसे देशी, गैर रोग प्रोटीन है कि स्वाभाविक sarkosyl-घुलनशील है के लिए एक सामांय मार्कर के रूप में कार्य करता है5। विशेष रूप से, वहां थोड़ा घुलनशील अंश में EEA1 के लिए कम संकेत (एस एस) गु-S अंश की तुलना में, यह दर्शाता है कि EEA1 के एक छोटे से पूल की संभावना sarkosyl-अघुलनशील है, अभी तक इस विशेष एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी दाग द्वारा पता लगाने की सीमा से नीचे । यह समान रूप से संभव है कि घुलनशील अंश में EEA1 के सिग्नल की शक्ति में मामूली कमी (एस सी) गैर के कारण होता है, ultracentrifuge ट्यूबों के लिए EEA1 के विशिष्ट बंधन भी अपेक्षित परिणाम से मामूली विचलन समझा सकता है ।
मानक के लिए संक्षिप्त एकल कदम भिन्नीकरण प्रोटोकॉल (चित्रा 3ए) के खिलाफ अधिक परंपरागत बहु कदम अनुक्रमिक भिन्नीकरण पद्धति (चित्र बी) की प्रभावकारिता, sarkosyl के सापेक्ष स्तर-अघुलनशील amyloid के प्रणेता प्रोटीन (एपीपी), ताऊ (MAPT), लघु नाभिकीय ribonucleoprotein U1-70K (snRNP70) और apolipoprotein ई (APOE) की तुलना लेबल-मुक्त मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) आधारित प्रोटियोमिक् के पार परित नियंत्रण (Ctl), हल्के संज्ञानात्मक हानि (एमसीआई) और विज्ञापन से की गई मामलों से पिछले अध्ययन7,18 (चित्रा 3) । डिटर्जेंट-अघुलनशील एप्लिकेशन की माप प्रभावी ढंग से Aβ पेप्टाइड का प्रतिनिधित्व करता है, के रूप में सभी पूरी तरह से tryptic एप्लिकेशन पेप्टाइड्स पूर्ण लंबाई ६९५ अवशेषों एप्लिकेशन प्रोटीन7के Aβ क्षेत्र के लिए मैप किया मात्रा । दोनों तरीकों के साथ, sarkosyl-अघुलनशील सभी चार रोग प्रोटीन के स्तर में ऊपर की ओर की प्रवृत्ति एमसीआई और विज्ञापन मामलों में नियंत्रण के सापेक्ष, संज्ञानात्मक गिरावट और रोग बोझ के मजबूत सहसंबंध के अनुरूप. कुल मिलाकर, डिटर्जेंट-अघुलनशील अंशों (P2) में इन प्रोटीन के संवर्धन उल्लेखनीय दोनों एकल चरण18 और बहु कदम आंशिक प्रोटोकॉल7का उपयोग लगातार कर रहे थे ।
वहां रहे हैं, तथापि, दो के तरीके के बीच मामूली मतभेद है कि लाभप्रद या सटीक प्रकृति और एक व्यक्ति के प्रयोग के लक्ष्यों के आधार पर बचके साबित हो सकता है । चित्रा 3 में सारांशित तुलनात्मक proteomic डेटा विशिष्ट प्रयोगात्मक मापदंडों और अनुप्रयोगों के आधार पर उपयोग करने के लिए जो प्रोटोकॉल को सूचित कर सकते हैं. के रूप में एक उंमीद कर सकते हैं, वहां एक सामांय व्यापार-नमूना संवर्धन और पवित्रता के बीच बंद है, सरलीकृत अंशीकरण बहु कदम विधि से कम प्रोटीन हानि के साथ और अधिक समृद्ध नमूनों affording प्रोटोकॉल के साथ ।
उदाहरण के लिए, नियंत्रण अघुलनशील अंश सरलीकृत प्रोटोकॉल का उपयोग कर तैयार (चित्र 3) बहु कदम दृष्टिकोण के माध्यम से तैयार की तुलना में रोग से संबंधित प्रोटीन के थोड़ा उच्च पृष्ठभूमि स्तर प्रदर्शन. इसके विपरीत, एकल कदम अंश तकनीक कम बहुतायत प्रोटीन के लिए लाभप्रद हो सकता है के रूप में समग्र नमूना घाटा काफी कम कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, एमसीआई मामलों में sarkosyl-अघुलनशील APOE के सापेक्ष संवर्धन संक्षिप्त प्रोटोकॉल (चित्रा 3ए) के माध्यम से तैयार अघुलनशील अंशों में काफी अधिक होता है.
हालांकि दोनों दृष्टिकोण रोग में किसी भी महत्वपूर्ण वृद्धि का पालन करने के लिए पर्याप्त से अधिक कर रहे हैं-प्रासंगिक या रोग के बाद प्रोटीन समुच्चय, और अधिक कई और व्यापक भिन्नीकरण और बहु कदम दृष्टिकोण के धोने कदम एक क्लीनर उत्पन्न कर सकते हैं और अधिक विशिष्ट proteomic हस्ताक्षर । फिर भी, हमारे डेटा सत्यापित करें कि एकल कदम अंश विधि प्रकाशित निष्कर्षों के अनुरूप है कि रोग समुच्चय जैसे ताऊ neurofibrillary पेचीदा (NFTs), Aβ सजीले टुकड़े और scrapie prions (पीआरअनुसूचित जाति) sarkosyl में अघुलनशील हैं, जबकि उनके natively जोड़ समकक्षों घुलनशील रहते हैं । 5 , ६ , 7 , 8 , 10 , 11 , 23 , 26
प्रोटीन के सापेक्ष मात्रा की गणना करके कि विभाजन में डिटर्जेंट-अघुलनशील नियंत्रण के अंशों (n = 3) और विज्ञापन (n = 3) मस्तिष्क (तालिका 2), केवल ~ 10% कुल प्रोटीन पूल के sarkosyl-अघुलनशील है । जब मस्तिष्क homogenate के 5 मिलीग्राम कुल प्रोटीन (गु-एस) fractionated, १०.४% और ११.३% नियंत्रण और विज्ञापन मामलों में डिटर्जेंट-अघुलनशील अंश में proteome विभाजन, क्रमशः है । हालांकि sarkosyl-अघुलनशील प्रोटीन के विज्ञापन मस्तिष्क में समृद्ध की कुल राशि नियंत्रण से थोड़ा अधिक है, कोई महत्वपूर्ण अंतर दो समूहों (पी = 0.703) भर में मनाया गया । यह इंगित करता है कि प्रोटीन का खुलासा और एकत्रीकरण विज्ञापन मस्तिष्क में व्यापक नहीं है, बल्कि ऐसे ताऊ, Aβ और U1 snRNPs के रूप में प्रोटीन के एक संकीर्ण और विशिष्ट सबसेट तक ही सीमित है । 7 , 21 , 22
चित्र 1: Sarkosyl भिन्नीकरण योजना. (क) एक गुजाइश मानव मस्तिष्क कम नमक बफर में homogenized था, जिसके बाद sarkosyl और NaCl 1% डब्ल्यू/वी और ०.५ एम के अंतिम सांद्रता में शामिल किया गया, क्रमशः और बर्फ पर 15 मिनट के लिए मशीन । sonication के बाद, homogenates १८०,००० x जी पर ultracentrifugation द्वारा 30 sarkosyl-घुलनशील supernatant (एस सी) और sarkosyl-अघुलनशील गोली (P1) affording मिनट के लिए fractionated थे । P1 गोली था (वैकल्पिक) स़डक के साथ धोया बफर और फिर से ultracentrifugation द्वारा अवसादी अंतिम sarkosyl-अघुलनशील गोली (P2) वहन । इस P2 अंश solubilized के लिए यूरिया बफर में 30 मिनट के कमरे के तापमान पर था, 3 एक्स 5 एस sonication द्वारा एक स्वच्छ microtip जांच के बाद । (ख) प्रोटीन (20 µ G) गु-स से, एस 8, S2 (10 µ एल) और P2 अंशों एसडीएस द्वारा हल किया गया-PAGE, Coomassie नीले निर्धारण बफर Coomassie शानदार नीले जी के साथ कोमल धुंधलान के बाद में 15 मिनट के लिए तय-२५० धुंधला बफर कमरे के तापमान पर रातोंरात । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 2: phosphorylated के संवर्धन-विज्ञापन मस्तिष्क के डिटर्जेंट अघुलनशील अंश में ताऊ । (A और B) प्रोटीन (४० μg) कुल (TH-S), घुलनशील (एस सी) और अघुलनशील (P2) अंशों में ताऊ phosphorylated के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ blotted थे threonine २३१ (pT231) या AT8 (pSer202, pThr205) में रोग phospho-ताऊ प्रजातियों के संवर्धन का प्रदर्शन करने के लिए विज्ञापन मस्तिष्क के अघुलनशील अंश (P2). विज्ञापन मस्तिष्क में, उच्च आणविक भार एकत्रित ताऊ विशेष रूप से डिटर्जेंट-अघुलनशील (P2) अंश में विभाजन । (ग) EEA1 एक घुलनशील प्रोटीन मार्कर और कुल (गु-एस) और घुलनशील (एस सी) नियंत्रण और विज्ञापन मस्तिष्क के अंश के लिए रिश्तेदार लोड हो रहा है नियंत्रण के रूप में कार्य किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: एक एकल कदम या बहु कदम अंश प्रोटोकॉल का उपयोग कर रोग विज्ञापन प्रोटीन का Proteomic विश्लेषण. प्रतिनिधि sarkosyl के सापेक्ष स्तर-अघुलनशील प्रोटीन ऐप (Aβ), ताऊ, snRNP70 (U1-70K) और APOE, या तो एकल चरण (A) या बहु-चरण (B) sarkosyl का उपयोग करके परित नियंत्रण, एमसीआई और विज्ञापन मामलों में विभिन्न रोगों के बीच आंशिक दृष्टिकोण । दोनों डेटासेट के लिए, प्रोटीन स्तर पेप्टाइड वर्णक्रम के द्वारा अनुमानित किया गया था इन की पहचान प्रोटीन के मैचों (PSMs), और १०० करने के लिए अधिकतम सेट करने के लिए सामान्यीकृत. नियंत्रण, एमसीआई और विज्ञापन मामलों से PSMs (n = 5 प्रत्येक) का उपयोग एकल-सेट डेटासेट के लिए किया गया था । बहु कदम दृष्टिकोण के लिए, नियंत्रण, एमसीआई और विज्ञापन मामलों (n = 5 प्रत्येक) के दो दोहराने पूल से PSMs का विश्लेषण किया गया. त्रुटि पट्टियां मतलब ± S.E.M. के मूल्यों का संकेत है इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| 10% w/v sarkosyl समाधान: 10 g N-lauryl-sarcosine सोडियम नमक प्रति १०० एमएल के ddH2ओ (रात के RT पर हलचल) |
| कम नमक (LS) बफ़र: ५० mm HEPES pH ७.०, २५० mm सुक्रोज, 1 mm EDTA |
| Sarkosyl (स़डक) बफर: LS बफ़र + 1% (w/v) sarkosyl + ०.५ मी NaCl |
| यूरिया बफर (-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर): ५० mM Tris-एचसीएल पीएच ८.५, 8M यूरिया, 2% एसडीएस |
| 4x एसडीएस लोड हो रहा है बफर: २०० मिमी Tris-एचसीएल पीएच ६.८, ४०% ग्लिसरॉल, 8% सोडियम dodecyl suflate (एसडीएस), ०.४% bromophenol ब्लू (BPB), और 20 मिमी TCEP पीएच ७.० में ddH2हे |
| Coomassie निर्धारण बफर: ४०% मेथनॉल, ddH में 10% एसिटिक एसिड2हे |
| Coomassie शानदार नीले जी-२५० धुंधला बफर: 25% मेथनॉल, 5% एसिटिक एसिड, ०.१% Coomassie ब्लू जी-२५० ddH में2हे |
| Coomassie दाग बफर: 25% मेथनॉल, ddH में 5% एसिटिक एसिड2हे |
| 1x Tris खारा (टीबीएस): ५० mm Tris-HCl pH ७.४५, १५० mm NaCl in ddH2O |
| 1x Tris 20 के बीच (टीबीएस/ ५० mm Tris-एचसीएल पीएच ७.४५, १५० mm NaCl, ०.१% के बीच 20 के साथ खारा बफर ddH2हे |
| 1x अवरुद्ध बफर (BB): ५० मिमी Tris-एचसीएल पीएच ७.४५, १५० मिमी NaCl, 1% मालिकाना प्रोटीन (सामग्री सूची देखें), ७५० mm Methylchloroisothiazolinone में ddH2हे |
| 1x अवरुद्ध बफर के साथ ०.०५% के बीच 20 (BB/): ५० mm Tris-एचसीएल पीएच ७.४५, १५० mm NaCl, 1% स्वामित्व प्रोटीन (सामग्री सूची देखें), ०.०५% के बीच 20, ७५० mm Methylchloroisothiazolinone में ddH2O |
तालिका 1: बफ़र्स सूची ।
| नमूना | मात्रा नमूना (µ एल) | एकाग्रता (µ g/µ l) | कुल प्रोटीन (µ g) | औसत कुल प्रोटीन (µ g) और S.E.M. | % ध-एस (5 मिलीग्राम) |
| Ctl १ | ७० | ९.८९ | ६९२.३ | ||
| Ctl २ | ७० | ७.३८ | ५१६.६ | ५१८.७ (± ९९.६३) | १०.४% |
| Ctl ३ | ७० | ४.९६ | ३४७.२ | ||
| विज्ञापन 1 | ७० | ९.७७ | ६८३.९ | ||
| विज्ञापन 2 | ७० | ६.६७ | ४६६.९ | ५६७.० (± ६३.२०) | ११.३% |
| विज्ञापन 3 | ७० | ७.८६ | ५५०.२ |
तालिका 2: sarkosyl-अघुलनशील अंशों (P2) में प्रोटीन राशि । औसत पर, प्रोटीन का प्रतिशत है कि नियंत्रण के sarkosyl-अघुलनशील अंश में विभाजन (n= 3) और विज्ञापन (n= 3) मस्तिष्क १०.४% और ११.३%, क्रमशः था । नियंत्रण और विज्ञापन मस्तिष्क से sarkosyl-अघुलनशील प्रोटीन की मात्रा का कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर था, के रूप में छात्र का tपरीक्षण (p = ०.७०३) और माध्य (S.E.M.) मूल्यों के मानक त्रुटि द्वारा सबूत के रूप में ।
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Discussion
इस के साथ हम परिचय और एक संक्षिप्त एकल कदम डिटर्जेंट-आंशिक प्रोटोकॉल है कि प्रयोगात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री से लेकर अनुप्रयोगों की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू है पर चर्चा कार्यात्मक प्रोटीन के लिए प्रोटियोमिक् विश्लेषण आधारित परख और वेस्टर्न सोख्ता । 5 , ६ , 7 , अल्जाइमर, एस, हटिंगटन रोग, prion रोगों और विभिन्न tauopathies जैसे neurodegenerative proteinopathies का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जब 10 यह पद्धति शायद सबसे प्रभावी है. मूल पांच कदम अनुक्रमिक भिन्नीकरण प्रोटोकॉल की तुलना में, इस एकल कदम प्रक्रिया एक ही दिन में पूरा किया जा सकता है और बहुत समान परिणाम affords. 5 , ६ , 7 , 9 , 14 , 22
इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण पहलू अंश डिटर्जेंट के रूप में sarkosyl का उपयोग है । ट्राइटन एक्स-१०० या सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) जैसे अन्य डिटर्जेंट के साथ इसके विपरीत, sarkosyl इस कार्य के लिए अच्छी तरह से अनुकूल प्रतीत होता है; stringency और solubilizing शक्ति के संदर्भ में, यह काफी मजबूत है के लिए देशी जोड़ प्रोटीन के बहुमत solubilize जबकि डिटर्जेंट-insolubility, संरचना और रोग के समारोह प्रासंगिक प्रोटीन समुच्चय कि स्वाभाविक है संरक्षण एसडीएस के प्रति संवेदनशील । 5 , 9 इसके अतिरिक्त, एसडीएस के विपरीत, sarkosyl कम तापमान पर और उच्च नमक की स्थिति में घुलनशील रहता है ।
इस प्रोटोकॉल का एक अंय प्रमुख विशेषता ultracentrifugation के पहले दौर के बाद पहले sarkosyl अघुलनशील (P1) छर्रों के पुनर्निलंबन है । इस धो कदम प्रारंभिक छर्रों (P1) को अच्छी तरह से निकाला जा करने के लिए और किसी भी अवशिष्ट पार दूषित घुलनशील या कुल homogenate प्रोटीन की धोया, एक शुद्ध और अच्छी तरह से परिभाषित डिटर्जेंट-अघुलनशील प्रोटीन अंश वहन की अनुमति देता है । वैकल्पिक गोली (P1) resuspension और धोने कदम के बिना, अवशिष्ट घुलनशील प्रोटीन पर डिटर्जेंट-अघुलनशील अंश में किया जा सकता है, संभवतः बाद में परिणाम और प्रयोगों (यानी immunoblotting या प्रोटियोमिक् विश्लेषण) की स्थापना की ।
रोग की अघुलनशील और उच्च आणविक भार प्रकृति प्रोटीन समुच्चय (यानी ताऊ, phospho-ताऊ और Aβ प्रजातियों) पारंपरिक जैव रासायनिक तकनीकों के माध्यम से उनके अलगाव और विश्लेषण की ओर अद्वितीय चुनौतियों उपस्थित । 5 , ६ , 7 , 8 , 9 , 12 , 17 , 21 , 26 घुलनशील प्रोटीन के विपरीत, अघुलनशील समुच्चय जैसे amyloids (Aβ) और hyperphosphorylated तौ neurofibrillary उलझनों (NFTs) को गुजाइश ऊतकों से आसानी से शुद्ध नहीं किया जा सकता जैसे परंपरागत विधियों द्वारा immunoprecipitation या तेज प्रोटीन लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (FPLC) । 3 , 5 , ६ , 7 , 11 , 12 , 23 , 27 इस प्रकार, संक्षिप्त sarkosyl-आंशिक प्रोटोकॉल एक ही तकनीक है कि सतही संवर्धन और एक अपेक्षाकृत कम समय-सीमा के भीतर गुजाइश मस्तिष्क से डिटर्जेंट-अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय के अलगाव के लिए अनुमति देता है में से एक है । 5 , ६ , 8 , 13 , 15 , 17 , 21 , 27
जबकि अतिरिक्त कदम एक शुद्ध, एकत्रित प्रोटीन के समरूप नमूना को अलग करने के लिए नियोजित किया जा सकता है, sarkosyl अंश प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत कम समय प्रतिबद्धता के साथ डिटर्जेंट-अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय के सतही संवर्धन के लिए अनुमति देता है । 5 , इस परिकल्पना के समर्थन में 6 , sarkosyl-अघुलनशील proteome के proteomic अध्ययनों की पुष्टि करते हैं कि ज्ञात रोग एकत्रीकरण-प्रवण प्रोटीन विभाजन के विशाल बहुमत में sarkosyl-अघुलनशील अंश-दोनों पारंपरिक बहु-चरण में ६ , 11 , 21 साथ ही हमारे उपंयास एकल कदम भिन्नीकरण दृष्टिकोण । 5 , 7 , 9 , 10
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक डीआरएस का शुक्रिया अदा करते हैं । जिम लह और एलन Levey, न्यूरोलॉजी के एमोरी विभाग, सहायक टिप्पणियां और सुझावों के लिए । यह काम आंशिक रूप से तेजी से दवा भागीदारी अनुदान (U01AG046161-02), एमोरी अल्जाइमर रोग अनुसंधान केंद्र (P50AG025688) और एजिंग अनुदान (R01AG053960-01) पर एक राष्ट्रीय संस्थान द्वारा वित्त पोषित किया गया था N.T.S. करने के लिए इस अनुसंधान भी एमोरी तंत्रिका विज्ञान NINDS कोर सुविधाएं अनुदान, P30NS055077 के Neuropathology कोर द्वारा भाग में समर्थन किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X) | Thermo Fisher | 78441 | protease & phosphatase inhibitor cocktail |
| Sonic Dismembrator System (ultrasonicator) | Fisher Scientific | FB505110 | microtip ultrasonicator |
| Optimax TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 361545 | refrigerated ultracentrifuge |
| TLA120.1 rotor | Beckman Coulter | 362224 | ultracentrifuge rotor |
| 500 ul (8 x 34 mm) polycarbonate tubes, thickwall | Beckman Coulter | 343776 | ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor |
| 4X SDS sample buffer | Home-made | N/A | SDS-PAGE |
| TCEP solution, neutral pH | Thermo Fisher | 77720 | reducing agent |
| (TBS) blocking buffer | Thermo Fisher | 37542 | blocking buffer |
| (TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20 | Thermo Fisher | 37543 | blocking buffer and antibody diluent |
| 4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well | Thermo Fisher | NW04120BOX | precast SDS-PAGE gels |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher | B0002 | SDS-PAGE running buffer |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) | Sigma Aldrich | L5777-50G | detergent |
| Anti-Tau-2 (pan tau) antibody | Chemicon | MAB375 | antibodies |
| Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody | Millipore | MAB5450 | antibodies |
| Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8) | Thermo Fisher | MN1020 | antibodies |
| Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody | abcam | ab2900 | antibodies |
| Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A21058 | antibodies |
| Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A11374 | antibodies |
| iBlot2 Dry Blotting System | Thermo Fisher | IB21001 | Gel transfer |
| iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini | Thermo Fisher | IB23002 | Gel transfer |
References
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H.
- Ross, C. A., Poirier, M. A.
- Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).
- Hamley, I. W. The Amyloid Beta Peptide: A Chemist's Perspective. Role in Alzheimer's and Fibrillization. Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).
- Diner, I., et al. Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease. J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).
- Gozal, Y. M., et al. Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer's Disease. J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).
- Hales, C. M., et al. Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer's Disease progression. PROTEOMICS. , (2016).
- Julien, C., Bretteville, A., Planel, E. Amyloid Proteins: Methods and Protocols. Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. , Humana Press. 473-491 (2012).
- Nizhnikov, A. A., et al. Proteomic Screening for Amyloid Proteins. PLoS ONE. 9 (12), e116003 (2014).
- Seyfried, N. T., et al. Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards. J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).
- Woltjer, R. L., et al. Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including Aβ but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer's disease. FASEB J. , (2005).
- Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. Biochemical Characterization of the Core Structure of α-Synuclein Filaments. J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).
- Hasegawa, M., et al. Phosphorylated α-Synuclein Is Ubiquitinated in α-Synucleinopathy Lesions. J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130 (2006).
- Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association. FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
- Noguchi, A., et al. Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid β-Protein (Aβ) Assembly from Alzheimer Disease Brains. J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid. J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).
- Yang, L. -S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis. J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Hales, C. M., et al. U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer's disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21. Mol Neurodegener. 9 (1), 15 (2014).
- Xiong, L. -W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
- Mirra, S. S., et al. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease. Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).
- Smith, P. K., et al.
- Guo, J. L., et al. Unique pathological tau conformers from Alzheimer's brains transmit tau pathology in nontransgenic mice. J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).
- Matveev, S. V., et al. A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer's disease brain. J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).
