Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

في فيفو التصوير من "الفئران مراسل" Cx3cr1التجارة والنقل/التجارة والنقل مع المجالات الطيفية الضوئية التماسك التصوير المقطعي وفحص تنظير العين الليزر

Published: November 11, 2017 doi: 10.3791/55984
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Ophthalmology and Department of Clinical Research, Bern University Hospital and University of Bern

Summary

ويصف هذا البروتوكول عالية الدقة كيف تقنيات التصوير مثل التصوير المقطعي التماسك الضوئية المجال الطيفي وفحص تنظير العين الليزر يمكن أن تستخدم في القوارض الصغيرة، باستخدام نظام منصة تصوير العيون، للحصول على معلومات حول ميكروجليال وسمك الشبكية خلية التوزيع، على التوالي.

Abstract

التصوير المقطعي بالتماسك الضوئية المجال الطيفي (SD--أكتوبر) والمسح الضوئي الليزر تنظير العين (سلوفاكيا) تستخدم على نطاق واسع في طب العيون التجريبية. في هذا البروتوكول، الأخضر الفئران معربا عن بروتين فلوري (بروتينات فلورية خضراء) تحت مروج Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1التجارة والنقل/التجارة والنقل) واستخدمت صورة microglia الخلايا في الجسم الحي في الشبكية. Microglia الضامة المقيمين من الشبكية وقد تورط في عدة أمراض الشبكية1،2،3،4،،من56. يوفر هذا البروتوكول نهجاً مفصلة لجيل من الشبكية ب-عمليات المسح، مع التنمية المستدامة، تشرين الأول/أكتوبر، وتصوير microglia خلية التوزيع في الفئران Cx3cr1التجارة والنقل/التجارة والنقل مع سلوفاكيا في فيفو، باستخدام نظام منصة تصوير العيون. يمكن استخدام البروتوكول في العديد من خطوط الماوس مراسل. ومع ذلك، توجد بعض القيود على البروتوكول المعروضة هنا. أولاً، كل من سلوفاكيا والتنمية المستدامة، تشرين الأول/أكتوبر، عند استخدامها في وضع عالي الاستبانة، وجمع البيانات مع ارتفاع القرار المحوري ولكن القرار الأفقي أدنى (3.5 ميكرون و 6 ميكرومتر، على التوالي). وعلاوة على ذلك، مستوى التركيز والتشبع في سلوفاكيا تعتمد اعتماداً كبيرا على اختيار المعلمة والمحاذاة الصحيحة للعين. بالإضافة إلى ذلك، استخدام أجهزة مصممة للمرضى البشرية في الفئران صعبة بسبب قوة العين الماوس الضوئية مجموع أعلى مقارنة بالعين البشرية؛ هذا يمكن أن يؤدي إلى الوحشي التكبير المغالطات7، التي تعتمد أيضا على نسبة التكبير بالعدسة الماوس بين أمور أخرى. ومع ذلك، وبالرغم من هذا الموقف المسح المحوري مرهون بالتكبير الأفقي، القياسات SD--أكتوبر المحوري دقيقة8.

Introduction

في طب العيون التجريبية، يتم عادة تقييم الفحص الباثولوجي الشبكية باستخدام تقنيات نسيجية. ومع ذلك، علم الأنسجة يتطلب يوثانيزيشن الحيوانية وقد يسبب تغيير في الخصائص الفعلية للأنسجة. SD--أكتوبر وسلوفاكيا بشكل روتيني وتستخدم في طب العيون السريري لأغراض التشخيص والرصد لعدة أمراض الشبكية مثل السكري وذمة بقعيه9أو اعتلال الأعصاب البصرية الدماغية الأمامية10التهاب الشبكية الصباغي11 . SD--أكتوبر وسلوفاكيا هي تقنيات غير الغازية التي تولد صور عالية الاستبانة للشبكية، التي هي تصور عن طريق التلميذ المتوسعة دون أي تدخل آخر. SD--أكتوبر معلومات البنية الشبكية وسمك الشبكية عن طريق جمع البيانات باكسكاتيرينج لإنشاء الصور المقطعية الشبكية، بينما سلوفاكيا يجمع البيانات الأسفار لإنتاج صور عالية التباين مجسمة الشبكية. في الوقت الحاضر، تستخدم بشكل متزايد في طب العيون تجريبية باستخدام القوارض الصغيرة12،13،،من1415 (أو16،الزرد حتى17) كلا التقنيات ويمكن تقديم كل المعلومات النوعية والكمية12،17،،من1819،،من2021.

يمكن تصور تراكم fluorophores الذاتية مثل ليبوفوسسينس أو تشكيل دروسين في الشبكية بسلوفاكيا كإشارة السيارات الفلورسنت. هذه الميزة يجعل سلوفاكيا تقنية قيمة لتشخيص ورصد الأمراض الشبكية مثل البقعي المرتبطة بالسن أو التهاب الشبكية الصباغي22،23. في طب العيون التجريبية، يمكن استخدام صف السيارات التصوير (بالعربية) للكشف عن أنواع الخلايا المحددة في خطوط الماوس مراسل. على سبيل المثال، الفئران متخالف للتعبير عن التجارة والنقل تحت مروج Cx3cr124 مفيدة للتصور في فيفو خلايا microglial في الشبكية العادي والتحقيق في microglia/بلعم الديناميات في أمراض الشبكية21. Microglia هي الضامة المقيم الشبكية، التي تلعب دوراً حاسما في التوازن الأنسجة وإصلاح الأنسجة عند الإصابة1،،من2526. وأفيد في إصابة الشبكية، الاسكيمية، وانحطاط، يشير إلى دور هذه الخلايا في أمراض الشبكية2،3،،من45، Microglia التنشيط في شبكية العين 6.

ويهدف هذا البروتوكول وصف طريقة بسيطة نسبيا لتصوير الشبكية، وقياس سمك الشبكية باستخدام SD، تشرين الأول/أكتوبر، والتصور للتجارة والنقل microglia إيجابية الخلايا في Cx3cr1التجارة والنقل/التجارة والنقل الماوس الشبكية باستخدام سلوفاكيا (نظام "سبيكتراليس هايدلبرغ" HRA + OCT). ويمكن استخدام هذا البروتوكول لقياسات التصوير وسمك شبكية العين سليمة أو مريضة في خطوط الماوس المختلفة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء تحليل شكلي للتعرف على والتحديد الكمي لأرقام microglia و microglia التنشيط في الشبكية باستخدام سلوفاكيا21. Microglia الخلايا المرتبطة بالأمراض التنكسية في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، بما في ذلك الشبكية27،،من2829. وهكذا، من خلال الجمع بين الطريقتين المستخدمة في هذا البروتوكول، يمكن إجراء ارتباط توزيع microglia وتنكس الشبكية، التي يمكن أن تيسر رصد شدة المرض أو النهج فعالية علاجية في فيفو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

في جميع الإجراءات، بالب/ج الفئران الذكور والإناث الكبار الذين يعربون عن التجارة والنقل تحت مروج Cx3cr1 كانت تستخدم 24. الفئران يعاملون وفقا "البيان آرفو" "استخدام الحيوانات" في أوفثالميك وأبحاث الرؤية ووافق جميع الإجراءات من الحكومة السويسرية وفقا "اللوائح الاتحادية السويسرية" شأن "الرفق بالحيوان". تم تخديره الفئران الحقن تحت الجلد ميديتوميديني هيدروكلوريد (0.75 مغ/كغ) والكيتامين (45 مغ/كغ). وأكد التخدير المناسب رصد معدل التنفس والحيوان ' منعكس s ضد قرصه ذيل. في نهاية هذه التجارب، وقد euthanized الفئران مع استنشاق أول أكسيد الكربون 2.

ملاحظة: أداء كل دورة التصوير، في أسرع وقت ممكن (20 دقيقة كحد أقصى)، ومنذ تشكيل الساد التخدير التالية قد يعيق التصور الشبكية 30-

1-"تكوين نظام"

  1. تشغيل الكمبيوتر-
  2. تشغيل إمدادات الطاقة. الرسالة " ابدأ الحصول على الوحدة النمطية " سوف تظهر على شاشة لوحة التحكم الخاصة بالجهاز-
  3. انقر نقراً مزدوجاً فوق اختصار سطح المكتب للبرنامج لتشغيل البرنامج-
  4. على عرض قاعدة البيانات، انقر فوق " إضافة المريض " رمز-
  5. في إطار منبثق، أدخل جميع المعلومات اللازمة (اسم العائلة، الاسم الأول، والعنوان، وتاريخ الميلاد، والجنس، ومعرف المريض)، وانقر فوق " طيب ". على نافذة البوب تعيين انحناء القرنية إلى 2 مم، ثم انقر فوق " طيب "-
  6. ضع عدسة د 78 مصباح قياسي شق عدم الاتصال العيون أمام البصرية القياسية 30 °، وربط ذلك بأمان مع الشريط.
  7. تأكد من أن يتم وضع ذراع عامل التصفية على الجهة اليسرى الجهاز على الإشارة إلى " A " للسماح للأشعة تحت الحمراء + أكتوبر والتصوير ( الشكل 1) بالعربية-

2. إعداد الماوس

  1. استخدام جرعة هيدروكلوريد ميديتوميديني 0.75 ملغ/كغ والكيتامين جرعة من 45 مغ/كغ في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS، درجة الحموضة 7.4) لإعداد حل التخدير. وهكذا، ماوس ز 20، مزيج 15 ميليلتر من هيدروكلوريد ميديتوميديني مع 18 ميليلتر من الكيتامين إلى وحدة تخزين نهائي من 50 ميليلتر في برنامج تلفزيوني. تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
  2. أمسك الماوس بالقفا وتطبيق قطره واحدة من تروبيكاميدي 0.5% + فينيليفريني هيدروكلوريد 2.5% في كل عين لتحقيق تمدد التلميذ.
  3. الاحتفاظ بالماوس ضبط النفس، ومع حقنه الأنسولين تعلق بإبرة ز 30، 50 ميليلتر من الحل التخدير حقن تحت الجلد. وضع الماوس مرة أخرى في قفصة التي يتم وضعها فوق وسادة تدفئة. الانتظار 3-5 دقائق حتى الماوس هو مخدراً تماما. لتقييم عمق مخدر، قرصه ذيل الماوس. تحقق منعكس القرنية بلمس القرنية الماوس مع مسحه القطن بلطف. إذا كان يتم ملاحظة لا رد فعل إيجابي، تواصل مع التصوير-
    ملاحظة: من المهم رصد معدل التنفس أثناء التخدير. إذا لم يتم مخدراً الماوس تماما، سوف تزيد معدل التنفس عند حافزا مؤلمة.
  4. هيدرات قطرات القرنية الماوس مع تطبيق هيدروكسيبروبيلميثيلسيلولوسي 2% على كل عين-

3. SD--أكتوبر

  1. وضع تصحيح الاحترار حوالي 32 درجة مئوية على منصة مصنوعة خصيصا تعلق على بقية الذقن للجهاز ( الشكل 1).
  2. الصورة في العين اليمنى، ضع الماوس على الجزء الأيسر من النظام الأساسي ( الشكل 1). التأكد من أن يواجه المدار الصحيح للماوس العدسة والهيئة يكمن عرضه في الجزء الأيسر من المنهاج.
  3. تطبيق قطره هيدروكسيبروبيلميثيلسيلولوسي على العين اليمنى وموقف الديوبتر + 4 جامدة غاز نفاذية اتصال عدسة بعناية على أنها (قوة كروية:-25.00 إلى +25.00 ديوبتر). تخزين العدسات اللاصقة في حل متوازن الملح (BSS). للاستيلاء على العدسة، استخدام الملقط من البلاستيك أو السيليكون لتفادي الضرر.
  4. اضغط على المربع الأصفر في الزاوية اليمنى من شاشة لوحة التحكم بدء تشغيل الوحدة النمطية اقتناء (الصندوق الأخضر في الشكل 2 ألف). المربع الأصفر سوف يتحول إلى اللون الأخضر وسوف تظهر قائمة لوحة التحكم على الشاشة ( الشكل 2A).
  5. للحصول على فحص ب، حدد خيار الأشعة تحت الحمراء + أكتوبر على لوحة التحكم ( الشكل 2A). يتم تمييز الإعدادات المحددة باللون الأزرق على لوحة التحكم-
  6. تحديد " الشبكية " تحت " التطبيق وهيكل " في البرمجيات وتحرك العدسة نحو العين الماوس باستخدام في ميكرومانيبولاتور على الجهاز ( الشكل 1). قبل التركيز على شبكية العين، تحقق من أن الإشارة إلى " OD " المحددة في الجزء الأيسر السفلي من الشاشة. يحدد البرنامج تلقائياً في اليسار (نظام التشغيل) والعين اليمنى (OD) استناداً إلى موضع الهدف.
    ملاحظة: إذا تم وضع الهدف في وسط المنصة، سوف تظهر رسالة خطأ في الجزء السفلي من الشاشة. وفي هذه الحالة، إعادة وضع الماوس قليلاً حتى البرمجيات تسلم العين الصحيحة.
  7. مع مقبض التركيز، التركيز على شبكية العين حتى السفن الكبيرة التي يتم رؤيتها بوضوح في صورة النظارة على الجهة اليسرى شاشة الكمبيوتر. تحريك الكاميرا بتحويل ميكرومانيبولاتور اليسار أو اليمين، تحريك الكاميرا في هذا الاتجاه، أو اتجاه عقارب الساعة أو عكس اتجاه عقارب الساعة، لتحريك الكاميرا أعلى أو لأسفل، على التوالي.
    ملاحظة: قم بتغيير موضع الماوس على المنصة أو تحريك العدسة صعودا أو هبوطاً لتحقيق التعريب المفضل رأس العصب البصري في صورة الأشعة تحت الحمراء-
  8. أدر حساسية عكس اتجاه عقارب الساعة لتخفيض أو عكس اتجاه عقارب الساعة لزيادة سطوع الصورة النظارة. عندما يتحقق التركيز الأمثل، للتنمية المستدامة-أكتوبر ب-مسح سوف تظهر على يمين الشاشة-
    ملاحظة: إذا كان لا يمكن تصور ب-المسح الضوئي عن طريق ضبط التركيز، اضغط تركيبة على لوحة المفاتيح Ctrl + Alt + Shift + O. في النافذة المنبثقة، قم بضبط قيمة الذراع مرجع حتى ب-الفحص يظهر على الشاشة.
  9. في أسفل يمين الشاشة، اختر مسح واحد من قائمة نمط (سطر واحد في الشكل 2)-
  10. تشغيل ميكرومانيبولاتور للجهاز ( الشكل 1)، اليسار، اليمين، إلى الأمام أو الخلف (لتشغيل الكاميرا في هذا الاتجاه) لضمان أن ب-المسح الضوئي يقع بين الجزء العلوي والسفلي أركان التنمية المستدامة-OCT تفحص النافذة.
  11. تعيين القيمة تلقائياً في الوقت الحقيقي (الفن) على الأقل 9 للحصول على صور ذات جودة عالية-
    ملاحظة: فن يحسن جودة الصورة بحساب متوسط مسح متتالية عدة. أعلى " الفن " القيمة، وكلما زادت نسبة الإشارة إلى الضجيج، ومن ثم جودة الصورة. ومع ذلك، عن طريق زيادة " الفن " القيمة، واكتساب كما يتم زيادة الوقت.
  12. صحفي " الحصول على " زر ( الشكل 2) على شاشة لوحة التحكم واقتناء الصور.
  13. إعادة وضع مؤشر الماوس صورة العين اليسرى وكرر الخطوات 3.2-3.12.
  14. إزالة العدسات اللاصقة مع الملقط البلاستيك/السليكون ووضعه داخل BSS.
  15. هيدرات القرنية الماوس مع قطره جديدة من هيدروكسيبروبيلميثيلسيلولوسي وإزالة الزائدة مع ورقة الأنسجة.
  16. إزالة الألياف البصرية القياسية 30 ° بالتناوب من عكس اتجاه عقارب الساعة.
  17. جبل العدسة 55 ° وكرر الخطوات 3.4-3.12 لكل عين-

4. السيارات Fluorescence التصوير

  1. دون تحريك الماوس على النظام الأساسي، حدد الأشعة تحت الحمراء في لوحة التحكم.
  2. مع مقبض التركيز، التركيز على الأوعية الشبكية الكبيرة.
  3. في "لوحة التحكم" حدد AF.
  4. أدر حساسية عكس اتجاه عقارب الساعة للحد أو عكس اتجاه عقارب الساعة لزيادة سطوع الصورة.
  5. اضغط مقبض حساسية وتعيين " الفن " القيمة إلى 67 أو أكثر للحصول على نوعية عالية من الصور.
  6. عند المجموعة " الفن " تم التوصل إلى القيمة، اضغط على " الحصول على " في لوحة التحكم للحصول على الصورة. اضغط مقبض حساسية مرة أخرى التوقف عن المتوسط. ضبط التركيز، تصور مختلف طبقات الشبكية.
    7. إزالة العدسة 55°
  7. وجبل عدسة 102° الميدانية على نطاق واسع. اتبع الخطوات 4.1 – 4.6 لكلتا العينين لكل الماوس والماوس كل.
  8. انقر فوق “ حفظ الصور ” على الحد العلوي الأيسر من النافذة ثم انقر فوق “ الخروج ”. لحفظ الصور في جهاز الكمبيوتر، حدد الماوس من القائمة الموجودة في الجزء الأيمن من الشاشة بالنقر المزدوج على اسم الماوس. انقر نقراً مزدوجاً فوق كل صورة على حدة، وثم انقر على أيقونة القرص المرن. حفظ الصورة ك.tif أو.bmp أو.jpg أو.png في المجلد الذي تريده. لإنهاء برنامج الصحافة “ ملف ” و “ الخروج ”.

5. عكس التخدير

  1. هيدرات عيون الماوس مع قطره واحدة من هيدروكسيبروبيلميثيلسيلولوسي والعودة الماوس على لوحة تدفئة.
  2. تحضير أتيباميزولي الحل في جرعة من 2.25 مغ/كغ لعكس آثار المسكنات هيدروكلوريد ميديتوميديني. ماوس ز 20، إضافة 9 ميليلتر من أتيباميزول في وحدة تخزين نهائي من 150 ميليلتر PBS. تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
  3. دقيقة بعد حقن التخدير (الخطوة 2، 2)، ضخ 150 ميليلتر من حل أتيباميزولي تحت الجلد.
  4. رصد الماوس حتى التعافي من التخدير. عندما يكون الماوس تماما المستردة (5-10 دقيقة بعد الحقن أتيباميزولي) وضعه مرة أخرى في قفصة. تتم الإشارة إلى الانتعاش بقدرة الحيوان على تحويل الهيئة عندما وضعت على جانب واحد، استعادت يمشي النشاط، والاستجابة استجابة للتحفيز البيئي.

6. دليل "قياس سمك الشبكية" من "صور" التنمية المستدامة، تشرين الأول/أكتوبر

  1. فتح الفحص OCT بالنقر المزدوج على اسم الحيوان.
  2. فتح ب-المسح الضوئي التي تم الحصول عليها مع عدسة 30 ° أو 55 °-
  3. اختيار " الشخصية سمك ".
  4. صحفي " "تحرير طبقة الانقسامات" " الرمز ( الشكل 2). البرنامج تلقائياً يحدد الحد الداخلي وقاعدة الغشاء.
  5. إذا لزم الأمر، يدوياً تصحيح موقف الحد الداخلي وقاعدة الغشاء. للقيام بذلك، اختر الطبقة إلى تعديل من الجانب الأيسر من الشاشة، ومن ثم خيار دائرة حمراء ( الشكل 2). تحرك الدائرة مع زر الماوس الضغط لتعديل الخط.
  6. تعديل الخط موقف الطبقة المقابلة بشكل صحيح. انقر فوق " حفظ وإغلاق " للخروج من النافذة-
    ملاحظة: سبب انعكاسية المشيمية، البرنامج قد تحدد الغشاء القاعدة بشكل غير صحيح. وهكذا، فمن الأفضل لتعريفه يدوياً قبل المتابعة إلى قياسات سمك الشبكية.
  7. اختيار " الشبكية " تحت " طبقة " الخيار. رسم تخطيطي لسمك الشبكية سوف تظهر في الجزء السفلي من الشاشة.
  8. فوق في موضع آخر أما على الرسم التخطيطي أو ب-المسح الضوئي لعرض سمك الشبكية (المشار إليها في ميكرومتر) للمنصب المحدد.
  9. قياس سماكة الشبكية في المسافة المطلوبة من رأس العصب البصري ونسخ القيم في جدول بيانات.
  10. كرر الخطوتين 5.1-5.9 للماوس كل 30 ° والعدسة 55 °.
  11. إجراء تحليل إحصائي بالبرامج المطلوب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باستخدام بروتوكول المعروضة هنا، يمسح SD، تشرين الأول/أكتوبر وتم الحصول على صور سلوفاكيا من الفئران Cx3cr1التجارة والنقل/التجارة والنقل في نفس جلسة التصوير. ويشمل الرقم 3 الممثل SD--أكتوبر مسح واحد حصل 30 ° أو عدسة 55 ° (الشكل 3A) وممثل سلوفاكيا الصور التي تم الحصول عليها مع ° 55 أو عدسة 102 °، حيث يتم تصور الخلايا microglia الإيجابية في التجارة والنقل. ويلاحظ انعكاسية أعلى من المشيمية في SD-OCT الأشعة التي تم الحصول عليها مع 30 ° بالمقارنة مع العدسة 55 °. هندسة الشبكية غير واضحة في 30 ° والصور 55 ° (الشكل 3، صور مكبرة الحق). بعد التصحيحات اليدوية لحدود الشبكية (الحد الداخلي وقاعدة غشاء)، لوحظ علاقة جيدة من قياسات سمك الشبكية بين 30 س والعدسة 55 ° عند قياس في نفس المسافة من رأس العصب البصري ( الشكل 3؛ ارتباط بيرسون = 0.967، ف < 0.0001). وقد أظهرت الدراسات السابقة أن قياسات سمك الشبكية في التنمية المستدامة، تشرين الأول/أكتوبر بمسح ربط جيدا مع القياسات السابقين فيفو على المقاطع الشبكية النسيجي15،31 وبالتالي التنمية المستدامة، تشرين الأول/أكتوبر يمكن أن تستخدم كأسلوب غير الغازية لقياسات سمك الشبكية. استخدام سلوفاكيا، نحن يمكن التعرف على بروتينات فلورية خضراء microglia إيجابية الخلايا كإشارة هايبرريفليكتيفي في الصور الفلورية السيارات، مهما كانت عدسة 102 ° ميدانية واسعة قادرة على تغطية مساحة النظارة أكبر مقارنة بالعدسة 55 °. سلوفاكيا يمكن أن تستخدم أيضا لرصد توزيع الخلايا microglia الشبكية والتنشيط في الفئران مراسل مع مستقبل وظيفي فراكتالكيني (Cx3cr1التجارة والنقل/+ الفئران) في الشبكية العادي أو المريضة12، 21،32. الجمع بين تشرين الأول/أكتوبر SD مع سلوفاكيا في نفس جلسة التصوير يمكن أن توفر معلومات عن توزيع microglia والتنشيط عند تنكس الشبكية، ويمكن أن تكون مفيدة لرصد أمراض الشبكية في الفئران21.

Figure 1
رقم 1: صورة تمثيلية للجهاز المستخدم في هذه الدراسة. الصورة في العين اليمنى من الماوس، يتم وضع الماوس على الجزء الأيسر من منصة مصنوعة خصيصا مع مدارها الحق تواجه العدسة وهيئتها الكذب عرضه في الجزء الأيسر من منهاج العمل. ارتفاع المنصة يمكن تعديلها عن طريق تحويل اتجاه عقارب الساعة (إلى انخفاض المنصة) أو عكس اتجاه عقارب الساعة (لرفع منهاج العمل) "تعديل بقية الذقن". يجب وضع ذراع عامل التصفية إلى "A" للسماح للتصوير بالأشعة تحت الحمراء + أكتوبر و AF. مع مقبض التركيز (غير مرئية على هذا الرقم)، المجرب يمكن تغيير التركيز من الماسح الضوئي. يمكن استخدامها في ميكرومانيبولاتور لإلقاء الضوء بشكل صحيح ومحاذاة الشبكية لصور ذات جودة عالية. الهدف يمكن نقل أعلى، أسفل، يمين، أو تركت بالتعامل مع الكاميرا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: رسم توضيحي للوحة التحكم الخاصة بالجهاز- (أ) في الجزء الأيسر من شاشة لوحة التحكم يمكن تحديد طرق اكتساب (الأشعة تحت الحمراء، الأشعة تحت الحمراء؛ والسيارات الأسفار، AF أو الأوعية إيندوسيانيني الخضراء، إيكجا؛ مجتمعة أو لا مع التصوير المقطعي التماسك البصري، أكتوبر). في الجزء الأوسط من لوحة يمكن اختيار الإعداد اقتناء (كثافة بمسح الصورة أو القسم أو وحدة التخزين إذا كان). يتحدد مجال الرؤية بالعدسة المحملة. يمكن ضبط سطوع الصورة الأشعة تحت الحمراء أو AF مع مقبض حساسية. عن طريق الضغط على مفتاح حساسية، سيبدأ البرنامج في المتوسط الصور التي تم الحصول عليها في الأشعة تحت الحمراء أو بالعربية لتقديم صورة عالية الجودة. (ب) رسم توضيحي لاكتساب نمط القائمة. (ج) ملخص للدالات المستخدمة في البرنامج مع الرمز المطابق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: أكتوبر يمسح والسيارات الصور الفلورية من شبكية العين الماوس Cx3cr1التجارة والنقل/التجارة والنقل - (أ) ب-فحص الشبكية الماوس الحصول عليها مع ° 55 (اللوحة العلوية) أو عدسة 30 ° (أسفل اللوحة). يتم عرض أعلى تكبير المربعات الصفراء في اللوحة اليسرى. (ب) صور للتجارة والنقل microglia إيجابية الخلايا في شبكية العين الفئران Cx3cr1التجارة والنقل/التجارة والنقل التي تم الحصول عليها مع ° 55 وعدسة 102 ° (اليسار والحق الألواح، على التوالي). (ج) قياسات سمك الشبكية، تقاس على نفس المسافة من رئيس العصب البصري، بشأن التنمية المستدامة، تشرين الأول/أكتوبر بمسح المستمدة من العدسة 30 درجة و 55 درجة. ولوحظ وجود علاقة جيدة بين اثنين من العدسات (ارتباط بيرسون = 0.967). تغيير حجم أشرطة: 200 ميكرومتر، 100 ميكرومتر على تضخيم SD--أكتوبر الصور (أ من لوحة اليمنى). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هذه المادة يوضح بروتوكول لاقتناء الشبكية ب-المسح والتصوير للتجارة والنقل التوزيع microglia الإيجابية في الشبكية الماوس في نفس جلسة التصوير. يتزايد استخدام SD، تشرين الأول/أكتوبر وسلوفاكيا في نماذج حيوانية من أمراض الشبكية لتوفير معلومات للتعديلات الشبكية عبر الوقت10،،من1417،،من1821. مع هذا البروتوكول، Cx3cr1التجارة والنقل/التجارة والنقل أو Cx3cr1التجارة والنقل/+ الشبكية الماوس يمكن تصويرها غير إينفاسيفيلي، ويمكن الحصول على معلومات عن سمك الشبكية. هذا له أهمية حاسمة في نماذج تجريبية مرض الشبكية، حيث شدة المرض يتغير مع مرور الوقت، أو عندما يتم اختبار العلاجات العلاجية. وعلاوة على ذلك، البروتوكول يصف كيف يمكن أن تستخدم خطوط الماوس مراسل للتصوير في فيفو الفلورسنت الخلايا في شبكية العين.

ومع ذلك، البروتوكول المعروضة هنا على بعض القيود. أولاً، تصوير الشبكية الماوس في الأجهزة المصممة للبشر قد تكون صعبة بسبب أعلى إجمالي القوة البصرية للعين الماوس، والذي يمكن أن يؤدي إلى تضخم أخطاء7الوحشي. ومع ذلك، تكون القياسات SD--أكتوبر محورية دقيقة8. بالإضافة إلى ذلك، فحص المتابعة في الفئران باستخدام الخيار "تعيين إشارة" من البرنامج صعب بسبب الموقف غير ثابت من الماوس على المنصة والتصوير الطولي لشبكية العين الماوس يمكن بالتالي تحديا. ويمكن تحقيق المحاذاة طولية من العين العصب البصري لتحديد المواقع في وسط الصورة الأشعة تحت الحمراء، وثم الحصول الصور المطلوبة. بغية تصحيح لدوران العين، يمكن أن يؤديها بعد اكتساب التحالفات دليل الصور الوجه أون SD، تشرين الأول/أكتوبر وتنطبق على قياسات سمك كما هو موضح في مكان آخر من33. بالإضافة إلى نظام التصوير المستخدمة في هذا البروتوكول، نظم التصوير الأخرى كما وضعت التي توفر زاوية أكبر ويمكن صورة منطقة شبكية أكبر دون استخدام العدسات اللاصقة. البصري على سبيل المثال يمكن أن تغطي سطح شبكية أكبر لكن مع تقلب صورة أكبر مقارنة بالجهاز المستخدم في هذا الدراسة34. وعلى الرغم من هذه القيود، ويمكن استخدام هذا البروتوكول في عدة نماذج تجريبية لمرض الشبكية. تتضمن المعلومات التي يمكن الحصول عليها التعديلات سمك الشبكية (تورم وضمور)، والكشف عن انفصال الشبكية، أو وجود النقاط هايبرريفليكتيفي والخلايا المسماة فلوروفوري والزيادة أو النقصان من أعدادهم.

الجمع بين الطريقتين في الفئران متخالف للتعبير عن Cx3cr1 (Cx3cr1التجارة والنقل/+)، التي لها مستقبل وظيفي فراكتالكيني، تمكن المجرب للكشف في وقت واحد في فيفو تعديلات سلامة الشبكية في الوقت الحقيقي واحتمال تراكم microglia محيط شذوذ الشبكية (مثلاً، تورم الشبكية ضمور الشبكية) خلال الشبكية المرض أو الإصابة. وعلاوة على ذلك، بتطبيق تحليل شكلي، يمكن تقييم حالة التنشيط microglia استناداً إلى حجم سوما وتعقيد microglia العمليات21. في أمراض الشبكية، مثل انسداد الوريد، لوحظت التنشيط وتراكم microglia/الضامة على المواقع الشبكية ضامر27. وعلاوة على ذلك، في الفئران المعيبة للجينات Nr2e3 (النووية مستقبلات الفصيلية 2 مجموعة ه الأعضاء 3)، نموذج الفأر من ريسيسيفيلي الموروثة تعزيز متلازمة الحساسية S-المخروط (بتوليدا)، الطبقة الخارجية النووية قابلة للطي (مأخذ) يمكن ملاحظتها في وقت مبكر يوما بعد الولادة.

من المثير للاهتمام، يمكن العثور على خلايا microglia داخل مأخذ وقد أشير إلى أن microglia قد تسهم في انحطاط photoreceptors التي لوحظت في شبكية العين من هذه الفئران35،36. منذ تنشيط microglia قد تورطت في مجموعة متنوعة من الأمراض الشبكية وأحيانا مصحوبا بتغييرات في البنية الشبكية10،،من2737،38 ، الجمع بين التنمية المستدامة، تشرين الأول/أكتوبر وسلوفاكيا يمكن أن تكشف عن العلاقات المتبادلة بين microglia التنشيط وتنكس الشبكية. ورغم بعض التحديات، هذا البروتوكول يمكن أن توفر مثل هذه المعلومات طوليا، وهكذا سيكون قيماً للترابط بين الضرر الشبكية مع microglia التوزيع/التنشيط ورصد المعاملة العلاجية 21من الفعالية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل على منحة من "مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية" (سنسف؛ #320030_156019). المؤلفون بتأييد الاستدانة من GmBH الهندسية هايدلبرغ، ألمانيا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectralis Imaging system (HRA+OCT) Heidelberg Engineering, Germany N/A ophthalmic imaging platform system
Heidelberg Eye Explorer Heidelberg Engineering, Germany N/A Version 1.9.13.0
78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lens Volk Optical Inc., Ohio, USA V78C
Spectralis wide angle 55° lens Heidelberg Engineering, Germany 50897-002
ultra widefield 102° lens Heidelberg Engineering, Germany 50117-001
medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor) Provet AG, Lyssach, Switzerland Swissmedic Nr. 50'590 - ATCvet: QN05CM91 anesthetic/analgesic
ketamine 50mg/ml (Ketalar) Parke-Davis, Zurich, Switzerland 72276388 anesthetic
tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix) ISPI, Bern, Switzerland N/A pupil dilation
Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mm B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Straße, Germany 9151125
hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%) OmniVision, Neuhausen, Switzerland N/A
+4 dpt rigid gas permeable contact lens Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY N/A Base Curve: 7.20 to 8.40 mm
Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm
Power: -25.00 to +25.00 Diopters
balanced salt solution (BSS) Inselspital, Bern, Switzerland N/A
silicon forceps N/A N/A
atipamezole 5 mg/mL (Antisedan) Provet AG, Lyssach, Switzerland N/A α2 adrenergic receptor antagonist
GraphPad Prism 7 GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA N/A statistical analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Madeira, M. H., Boia, R., Santos, P. F., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Contribution of microglia-mediated neuroinflammation to retinal degenerative diseases. Mediators Inflamm. , 673090 (2015).
  2. Ng, T. F., Streilein, J. W. Light-induced migration of retinal microglia into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (13), 3301-3310 (2001).
  3. Langmann, T. Microglia activation in retinal degeneration. J Leukoc Biol. 81 (6), 1345-1351 (2007).
  4. Joly, S., et al. Cooperative phagocytes: resident microglia and bone marrow immigrants remove dead photoreceptors in retinal lesions. Am J Pathol. 174 (6), 2310-2323 (2009).
  5. Arroba, A. I., Alvarez-Lindo, N., van Rooijen, N., de la Rosa, E. J. Microglia-mediated IGF-I neuroprotection in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (12), 9124-9130 (2011).
  6. Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Exp Eye Res. 81 (6), 700-709 (2005).
  7. Geng, Y., et al. Optical properties of the mouse eye. Biomed Opt Express. 2 (4), 717-738 (2011).
  8. Lozano, D. C., Twa, M. D. Development of a rat schematic eye from in vivo biometry and the correction of lateral magnification in SD-OCT imaging. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6446-6455 (2013).
  9. Vaz-Pereira, S., et al. Optical Coherence Tomography Features Of Active And Inactive Retinal Neovascularization In Proliferative Diabetic Retinopathy. Retina. 36 (6), 1132-1142 (2016).
  10. Kokona, D., Haner, N. U., Ebneter, A., Zinkernagel, M. S. Imaging of macrophage dynamics with optical coherence tomography in anterior ischemic optic neuropathy. Exp Eye Res. , (2016).
  11. Makiyama, Y., et al. Macular cone abnormalities in retinitis pigmentosa with preserved central vision using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. PLoS One. 8 (11), e79447 (2013).
  12. Paques, M., et al. High resolution fundus imaging by confocal scanning laser ophthalmoscopy in the mouse. Vision Res. 46 (8-9), 1336-1345 (2006).
  13. Joshi, R., et al. Spontaneously occurring fundus findings observed using confocal scanning laser ophthalmoscopy in wild type Sprague Dawley rats. Regul Toxicol Pharmacol. 77, 160-166 (2016).
  14. Muraoka, Y., et al. Real-time imaging of rabbit retina with retinal degeneration by using spectral-domain optical coherence tomography. PLoS One. 7 (4), e36135 (2012).
  15. Fischer, M. D., et al. Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography. PLoS One. 4 (10), e7507 (2009).
  16. Bell, B. A., et al. Retinal vasculature of adult zebrafish: in vivo imaging using confocal scanning laser ophthalmoscopy. Exp Eye Res. 129, 107-118 (2014).
  17. Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
  18. Huber, G., et al. Spectral domain optical coherence tomography in mouse models of retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5888-5895 (2009).
  19. Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative Analysis of Mouse Retinal Layers Using Automated Segmentation of Spectral Domain Optical Coherence Tomography Images. Transl Vis Sci Technol. 4 (4), 9 (2015).
  20. Sim, D. A., et al. A simple method for in vivo labelling of infiltrating leukocytes in the mouse retina using indocyanine green dye. Dis Model Mech. 8 (11), 1479-1487 (2015).
  21. Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma. J Vis Exp. (99), e52731 (2015).
  22. Acton, J. H., Cubbidge, R. P., King, H., Galsworthy, P., Gibson, J. M. Drusen detection in retro-mode imaging by a scanning laser ophthalmoscope. Acta Ophthalmol. 89 (5), e404-e411 (2011).
  23. Greenstein, V. C., et al. Structural and functional changes associated with normal and abnormal fundus autofluorescence in patients with retinitis pigmentosa. Retina. 32 (2), 349-357 (2012).
  24. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  25. Wang, X., et al. Requirement for Microglia for the Maintenance of Synaptic Function and Integrity in the Mature Retina. J Neurosci. 36 (9), 2827-2842 (2016).
  26. Ebneter, A., Casson, R. J., Wood, J. P., Chidlow, G. Microglial activation in the visual pathway in experimental glaucoma: spatiotemporal characterization and correlation with axonal injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (12), 6448-6460 (2010).
  27. Ebneter, A., Kokona, D., Schneider, N., Zinkernagel, M. S. Microglia Activation and Recruitment of Circulating Macrophages During Ischemic Experimental Branch Retinal Vein Occlusion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 944-953 (2017).
  28. Lin, Y. L., Potter-Baker, K. A. Using theoretical models from adult stroke recovery to improve use of non-invasive brain stimulation for children with congenital hemiparesis. J Neurophysiol. , (2017).
  29. Combadiere, C., et al. CX3CR1-dependent subretinal microglia cell accumulation is associated with cardinal features of age-related macular degeneration. J Clin Invest. 117 (10), 2920-2928 (2007).
  30. Bermudez, M. A., et al. Time course of cold cataract development in anesthetized mice. Curr Eye Res. 36 (3), 278-284 (2011).
  31. Toth, C. A., et al. A comparison of retinal morphology viewed by optical coherence tomography and by light microscopy. Arch Ophthalmol. 115 (11), 1425-1428 (1997).
  32. Ebneter, A., Kokona, D., Jovanovic, J., Zinkernagel, M. S. Dramatic Effect of Oral CSF-1R Kinase Inhibitor on Retinal Microglia Revealed by In Vivo Scanning Laser Ophthalmoscopy. Transl Vis Sci Technol. 6 (2), 10 (2017).
  33. Gabriele, M. L., et al. Reproducibility of spectral-domain optical coherence tomography total retinal thickness measurements in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (12), 6519-6523 (2010).
  34. Nakao, S., et al. Wide-field laser ophthalmoscopy for mice: a novel evaluation system for retinal/choroidal angiogenesis in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5288-5293 (2013).
  35. Wang, N. K., et al. Origin of fundus hyperautofluorescent spots and their role in retinal degeneration in a mouse model of Goldmann-Favre syndrome. Dis Model Mech. 6 (5), 1113-1122 (2013).
  36. Wang, N. K., et al. Cellular origin of fundus autofluorescence in patients and mice with a defective NR2E3 gene. Br J Ophthalmol. 93 (9), 1234-1240 (2009).
  37. Thanos, S. Sick photoreceptors attract activated microglia from the ganglion cell layer: a model to study the inflammatory cascades in rats with inherited retinal dystrophy. Brain Res. 588 (1), 21-28 (1992).
  38. Hughes, E. H., et al. Generation of activated sialoadhesin-positive microglia during retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (5), 2229-2234 (2003).

Tags

الشبكية، Microglia، والتصوير المقطعي التماسك البصري، المسح الضوئي الليزر تنظير العين، في فيفو التصوير، وطب العيون، الطب، 129 قضية
<em>في فيفو</em> التصوير من "الفئران مراسل" <em>Cx3cr1<sup>التجارة والنقل/التجارة والنقل</sup> </em> مع المجالات الطيفية الضوئية التماسك التصوير المقطعي وفحص تنظير العين الليزر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kokona, D., Jovanovic, J., Ebneter,… More

Kokona, D., Jovanovic, J., Ebneter, A., Zinkernagel, M. S. In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy. J. Vis. Exp. (129), e55984, doi:10.3791/55984 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter