Summary
Ce protocole décrit comment haute résolution techniques d’imagerie comme la tomographie par cohérence optique de domaine spectral et numérisation laser ophtalmologique peut être utilisé dans les petits rongeurs, à l’aide d’un système de plate-forme d’imagerie ophtalmique, pour obtenir des informations sur épaisseur de la rétine et microgliales cellulaire distribution, respectivement.
Abstract
Tomographie en cohérence optique domaine spectral (SD-OCT) et balayage ophtalmoscopie laser (SLO) sont largement utilisés en ophtalmologie expérimentale. Dans le présent protocole, des souris exprimant le vert protéine fluorescente (gfp) sous le promoteur de Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) ont été utilisés afin d’imager la microglie cellules in vivo dans la rétine. Les microglies sont des macrophages résidant de la rétine et ont été impliqués dans plusieurs maladies de la rétine1,2,3,4,5,6. Ce protocole prévoit une approche détaillée pour la génération de rétiniens B-scans, avec SD-OCT et imagerie de distribution cellulaire microglies chez les souris Cx3cr1gfp/gfp avec SLO in vivo, en utilisant un système de plate-forme d’imagerie ophtalmique. Le protocole peut être utilisé dans plusieurs lignées de souris de journaliste. Cependant, il y a certaines limitations au protocole présenté ici. Tout d’abord, les SLO et SD-OCT, lorsqu’il est utilisé en mode haute résolution, recueillir des données à haute résolution axiale mais la résolution latérale sont plus faible (3,5 µm et 6 µm, respectivement). En outre, le niveau de mise au point et la saturation dans SLO est fortement tributaire de la sélection des paramètres et un alignement correct de l’oeil. En outre, à l’aide de dispositifs conçus pour les patients humains chez la souris est difficile en raison de la puissance optique totale plus élevée de l’oeil de la souris par rapport à le œil humain ; Ceci peut mener au latéral grossissement inexactitudes7, qui dépendent aussi du grossissement de l’objectif de la souris entre autres. Cependant, malgré cette position le balayage axial dépend de grossissement latéral, les mesures de SD-OCT axiales sont exacts8.
Introduction
En ophtalmologie expérimentale, examen de la pathologie rétinienne est généralement évaluée à l’aide de techniques histologiques. Toutefois, histologie exige euthanasie animale et peut provoquer des modifications aux propriétés réelles du tissu. SD-OCT et SLO sont régulièrement utilisées en ophtalmologie clinique pour le diagnostic et pour le suivi de plusieurs maladies de la rétine comme le œdème maculaire diabétique,9,10de la neuropathie optique ischémique antérieure ou rétinite pigmentaire11 . SD-OCT et SLO sont des techniques non invasives qui génèrent des images haute résolution de la rétine, qui sont visualisées à travers la pupille dilatée sans intervention supplémentaire. SD-OCT fournit des informations de structure rétinienne et épaisseur rétinienne en recueillant des données diffusantes pour créer des images en coupe de la rétine, alors que SLO recueille des données de fluorescence pour produire des images stéréoscopiques de contraste élevé de la rétine. De nos jours, les deux techniques sont de plus en plus utilisés en ophtalmologie expérimentale à l’aide de petits rongeurs12,13,14,15 (ou même poisson zèbre16,17) et peut fournir les informations qualitatives et quantitatives12,17,18,19,20,21.
L’accumulation de fluorophores endogènes comme lipofuscins ou la formation de drusen dans la rétine peut être visualisée par SLO comme signal fluorescent auto. Cette caractéristique rend SLO une technique précieuse pour le diagnostic et la surveillance des maladies de la rétine comme la dégénérescence maculaire liée à l’âge ou la rétinite pigmentaire22,23. En ophtalmologie expérimentale, fluorescence auto imaging (AF) peut être utilisé pour la détection des types spécifiques de cellules dans les lignées de souris journaliste. Par exemple, les souris hétérozygotes pour l’expression de la gfp sous le promoteur de Cx3cr124 sont avantageux pour in vivo visualisation des microglies dans la rétine normale et pour la recherche sur les cellules microgliales/macrophage dynamique dans la maladie de la rétine,21. Les microglies sont les macrophages résidents de la rétine, qui jouent un rôle crucial sur l’homéostasie tissulaire et la réparation des tissus après blessure1,25,26. Activation des microglies dans la rétine a été signalée dans les lésions rétiniennes, ischémie et dégénérescence, suggérant un rôle de ces cellules dans la maladie de la rétine2,3,4,5, 6.
Le but du présent protocole est de décrire une méthode relativement simple pour la mesure d’épaisseur rétinienne à l’aide de SD-OCT et imagerie rétinienne et pour la visualisation des cellules de la microglie positive gfp dans la rétine de souris Cx3cr1gfp/gfp à l’aide SLO (système Spectralis Heidelberg HRA + OCT). Ce protocole peut être utilisé pour les mesures de l’imagerie et l’épaisseur des rétines sains ou malades dans diverses lignées de souris. En outre, les analyses morphométriques peuvent être exécutées pour l’identification et la quantification des microglies numéros et l’activation des microglies dans la rétine à l’aide de SLO21. Les cellules de la microglie sont associées à des maladies dégénératives dans le système nerveux central (CNS), dont la rétine27,28,29. Ainsi, en combinant les deux méthodes utilisées dans le présent protocole, corrélation des microglies distribution et dégénérescence rétinienne peut être faite, ce qui peut faciliter la surveillance gravité de la maladie ou l’efficacité de la thérapeutique des approches in vivo.
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Protocol
dans toutes les procédures, les souris BALB/c adultes mâles et femelles qui expriment la gfp sous le promoteur de Cx3cr1 étaient utilisé 24. Souris ont été traitées conformément à la déclaration d’ARVO sur l’utilisation des animaux dans ophtalmique et Vision Research et toutes les procédures ont été approuvées par le gouvernement suisse conformément à la réglementation fédérale suisse sur le bien-être Animal. Souris ont été anesthésiés par une injection sous-cutanée de chlorhydrate de médétomidine (0,75 mg/kg) et la kétamine (45 mg/kg). Bonne anesthésie a été confirmée par la surveillance de la fréquence respiratoire et l’animal ' réflexe s contre un pincement de la queue. À la fin des expériences, les souris ont été euthanasiés avec l’inhalation de CO 2.
Remarque : effectuer chaque séance d’imagerie aussi rapidement que possible (maximum 20 min), depuis la formation de cataractes anesthésie suivant risquent d’entraver visualisation rétinienne 30.
1. Configuration du système
- allumer l’ordinateur.
- Allumez l’alimentation. Le message " module d’acquisition de départ " apparaîtra sur l’écran du périphérique contrôle panneau.
- Double-clic sur le raccourci sur le Bureau du logiciel afin d’exploiter le logiciel.
- Dans la vue de base de données, cliquez sur le " ajouter patient " icône.
- Dans la fenêtre pop-up, insérer toutes les informations nécessaires (nom, prénom, titre, date de naissance, sexe et patient-ID), puis cliquez sur " OK ". Dans la fenêtre pop la valeur de la courbure cornéenne à 2 mm et cliquez sur " OK ".
- Positionner une lentille de plafonnier 78D standard ophtalmique sans contact fente devant l’optique standard de 30 ° et la fixer en toute sécurité avec du ruban adhésif.
- S’assurer que le levier de filtre sur la gauche de l’appareil est positionné sur l’indication " A " pour permettre aux IR + OCT et AF imaging ( Figure 1).
2. Préparation de souris
- utiliser une dose de chlorhydrate de médétomidine de 0,75 mg/kg et une kétamine dose de 45 mg/kg dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4) pour préparer la solution d’anesthésie. Ainsi, pour une souris de 20 g, mélanger 15 µL de chlorhydrate de médétomidine 18 µl de la kétamine pour un volume final de 50 µL dans du PBS. Conserver la solution à 4 ° C pendant une semaine.
- Saisir la souris par la peau et appliquer une goutte de tropicamide 0,5 % + chlorhydrate de phényléphrine 2,5 % sur chaque œil pour atteindre la dilatation de la pupille.
- Garder la souris maîtrisée et avec une seringue à insuline attachée à une aiguille de 30G, injecter 50 µL de la solution d’anesthésie par voie sous-cutanée. Remettre la souris dans sa cage qui est placé au-dessus d’un coussin chauffant. Attendre 3-5 min jusqu'à ce que la souris est entièrement sous sédation. Afin d’évaluer la profondeur de l’anesthésie, pincer la queue de la souris. Vérifier le réflexe cornéen en appuyant doucement sur la cornée de souris avec un coton-tige. Si aucun réflexe positive n’est observée, passez à l’imagerie.
Remarque : Il est important de surveiller la fréquence respiratoire pendant l’anesthésie. Si la souris n’est pas entièrement sous sédation, la fréquence respiratoire augmente à un stimulus douloureux. - Hydrate la cornée de souris avec une application de 2 % hydroxypropylméthylcellulose gouttes sur chaque œil.
3. SD-OCT
- Placez un patch au réchauffement d’environ 32 ° C sur la plate-forme sur mesure fixée sur la mentonnière de l’appareil ( Figure 1).
- à l’image de le œil droit, placez votre souris sur la partie gauche de la plate-forme ( Figure 1). Faire en sorte que l’orbite droite de la souris fait face à la lentille et son corps se trouve sujette sur la partie gauche de la plate-forme.
- Verser une goutte d’hydroxypropylméthylcellulose sur le œil droit et positionner avec soin une lentille de contact perméables dioptrique + 4 gaz rigide dessus (puissance sphérique :-25.00 à +25,00 dioptries). Stocker la lentille de contact dans une solution saline équilibrée (BSS). Pour attraper la lentille, utiliser des pinces en plastique ou en silicone pour éviter tout dommage.
- Appuyez sur la zone jaune sur le coin droit de l’affichage du panneau contrôle pour démarrer le module d’acquisition (boîte verte sur la Figure 2 a). La boîte jaune deviendra verte et le menu du panneau de contrôle s’affiche sur l’écran ( Figure 2 a).
- Pour l’acquisition de B-scans, sélectionnez l’option IR + OCT sur le panneau de configuration ( Figure 2 a). Paramètres sélectionnés sont mis en surbrillance en bleu sur le panneau de commande.
- Select " Retina " sous " Application et la Structure " dans le logiciel et déplacer l’objectif vers l’oeil de la souris en utilisant le micromanipulateur sur l’appareil ( Figure 1). Avant de se concentrer sur la rétine, vérifier que l’indication " OD " est sélectionnée dans la partie inférieure gauche de l’écran. Le logiciel identifie automatiquement la gauche (OS) et le œil droit de (OD) basé sur la position de l’objectif.
Remarque : Si l’objectif est positionné sur le milieu de la plate-forme, un message d’erreur s’affiche au bas de l’écran. Dans ce cas, repositionner la souris légèrement jusqu'à ce que le logiciel reconnaît l’oeil correcte. - Avec la molette de mise au point, se concentrer sur la rétine jusqu'à ce que les gros vaisseaux sont bien visibles dans l’image de fond sur la gauche de l’écran de l’ordinateur. Déplacer la caméra en tournant le micromanipulateur gauche ou droite, de déplacer la caméra dans cette direction, ou vers la droite ou vers la gauche, pour déplacer la caméra haut ou bas, respectivement.
Remarque : Déplacer la souris sur la plate-forme ou déplacer la lentille vers le haut ou vers le bas pour atteindre la localisation privilégiée de la tête du nerf optique dans l’image infrarouge. - Tourner le bouton de sensibilité vers la gauche pour réduire ou vers la droite pour augmenter la luminosité de l’image de fond d’oeil. Lorsque la mise au point optimale est obtenue, un SD-OCT B-scan apparaîtra à droite de l’écran.
Remarque : Si le B-scan ne peut pas être visualisé en ajustant la mise au point, appuyez sur la combinaison Ctrl + Alt + Maj + O sur le clavier. Dans la fenêtre pop-up, ajuster la valeur du bras Référence jusqu'à ce que le B-scan apparaît à l’écran. - Sur le bas à droite de l’écran, choisir le balayage unique dans le menu de configuration (seule ligne dans la Figure 2 b).
- Tourner le micromanipulateur du dispositif ( Figure 1) gauche, droite, vers l’avant ou vers l’arrière (pour tourner la caméra dans cette direction) pour s’assurer que le B-scan se situe entre le haut et le bas les coins du SD-PTOM scan fenêtre.
- La valeur automatique en temps réel (ART) sur au moins 9 pour obtenir des images de haute qualité.
NOTE : ART améliore la qualité de l’image en faisant la moyenne plusieurs analyses consécutives. Le plus élevé du " ART " valeur, plus le rapport signal-bruit et donc la qualité d’image. Cependant, en augmentant la " ART " de valeur, l’acquisition de temps est également augmentée. - Presse la " acquérir " bouton ( Figure 2) sur l’écran du panneau contrôle et acquérir les images.
- Re-positionner la souris pour l’image de le œil gauche et répétez les étapes 3.2-3.12.
- Enlever les lentilles de contact avec une pince en plastique/silicone et placez-le dans le BSS.
- Hydrater la cornée de souris avec une nouvelle goutte d’hydroxypropylméthylcellulose et enlevez le surplus avec un papier de soie.
- Retirer l’optique standard 30 ° en la tournant dans le sens antihoraire.
- Monter l’objectif de 55 ° et répétez les étapes 3,4-3.12 pour chaque oeil.
4. Auto Fluorescence Imaging
- sans bouger la souris sur la plate-forme, sélectionnez IR sur le panneau de commande.
- Avec la molette de mise au point, se concentrer sur les gros vaisseaux rétiniens.
- Sur le panneau de configuration, sélectionnez AF.
- Tourner le bouton de sensibilité vers la gauche pour réduire ou vers la droite pour augmenter la luminosité de l’image.
- Presse le bouton de sensibilité et de la " ART " valeur de 67 ou plus pour obtenir la haute qualité des images.
- Lorsque l’ensemble " ART " valeur a été atteinte, appuyez sur " acquérir " sur le panneau de contrôle en vue d’acquérir l’image. Appuyez sur le bouton de sensibilité pour arrêter une moyenne. Ajuster la mise au point, afin de visualiser les différentes couches rétiniennes.
- Enlever la lentille de 55° et monter l’objectif de 102° grand champ. Suivez les étapes 4.1 – 4.6 pour les deux yeux de chaque souris et pour chaque souris.
- Click “ enregistrer des images ” sur le bord supérieur gauche de la fenêtre puis cliquez sur “ sortie ”. Pour enregistrer les images dans l’ordinateur, sélectionnez la souris dans la liste sur la partie droite de l’écran en double cliquant sur le nom de la souris. Double cliquez sur chaque image séparément et puis cliquez sur l’icône de la disquette. Enregistrer l’image sous .tif, .bmp, .jpg ou .png au dossier souhaité. Pour sortir du logiciel sur “ fichiers ” et “ sortie ”.
5. Inversion de l’anesthésie
- hydrater les yeux de souris avec une goutte d’hydroxypropylméthylcellulose et retourner la souris sur un coussin chauffant.
- Solution Atipamézole Prepare dans une dose de 2,25 mg/kg à inverser les effets sédatifs du chlorhydrate de la médétomidine. Pour une souris de 20 g, ajouter 9 µL d’atipamezol dans un volume final de 150 µL PBS. Conserver la solution à 4 ° C pendant une semaine.
- min après injection d’anesthésie (étape 2.2), injecter par voie sous-cutanée de 150 µL de solution d’Atipamézole.
- Contrôler la souris jusqu'à ce que de l’anesthésie. Lorsque la souris est entièrement récupéré (5-10 min après l’injection d’Atipamézole) remettre dans sa cage. Récupération est indiquée par la capacité de l’animal à tourner son corps quand posé sur un côté, reprise de l’activité de marche et réagit en réponse à la stimulation de l’environnementale.
6. Mesure de l’épaisseur rétinienne manuel des Images SD-OCT
- ouvrir le scan OCT en double-cliquant sur le nom de l’animal.
- Ouvrir le B-scan obtenu avec l’objectif de 30 ° ou 55 °.
- Choisissez " profil d’épaisseur ".
- Presse la " modifier les Segmentations de couche " icône ( Figure 2 b). Le logiciel identifie la limite intérieure et membrane de base automatiquement.
- Si nécessaire, corriger manuellement la position de la limite intérieure et la membrane de base. Pour ce faire, choisissez la couche à modifier par le côté gauche de l’écran, puis sur l’option de cercle rouge ( Figure 2 b). Déplacer le cercle avec le bouton de la souris enfoncée pour modifier la ligne.
- Modifier la ligne pour positionner le calque correspondant correctement. Cliquez sur " enregistrer et fermer " pour fermer la fenêtre.
Remarque : En raison de la réflectivité de la choroïde, le logiciel peut identifier la membrane de base incorrecte. Ainsi, il est préférable de la définir manuellement avant de procéder à des mesures d’épaisseur rétinienne. - Choisissez " Retina " sous la " couche " option. Un diagramme d’épaisseur rétinienne apparaîtra au bas de l’écran.
- Cliquez sur un autre poste ou sur le diagramme, ou sur le B-scan pour voir l’épaisseur rétinienne (indiqué en µm) pour la position sélectionnée.
- Mesurer l’épaisseur rétinienne à la distance souhaitée entre la tête du nerf optique et copier les valeurs dans une feuille de calcul.
- Répétez les points 5.1 à 5.9 pour chaque souris pour les 30 ° et la lentille 55 °.
- Effectuer des analyses statistiques avec le logiciel désiré.
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Representative Results
En utilisant le protocole présenté ici, SD-OCT scanne et SLO images ont été obtenues chez des souris Cx3cr1gfp/gfp dans la même session d’imagerie. Figure 3 comprend représentant SD-OCT simples scans obtenus avec un 30 ° ou 55 ° lentille (Figure 3 a) et images représentatives de SLO obtenues avec un 55 ° ou une lentille de 102 °, où les cellules de la microglie positive gfp sont visualisées. Réflectivité supérieure de la choroïde est observée dans la SD-OCT scans obtient avec les 30 ° par rapport à l’objectif de 55 °. Cependant, architecture rétinienne est clair, à la fois les 30 ° et les images de 55 ° (Figure 3, bonne image agrandie). Après corrections manuelles des limites rétiniennes (limitation interne et la membrane de base), une bonne corrélation des mesures d’épaisseur rétinienne a été observée entre les 30 o et la lentille 55 ° lors de la mesure à la même distance de la tête du nerf optique ( Figure 3; Corrélation de Pearson = 0,967, p < 0,0001). Des études antérieures ont montré que les mesures d’épaisseur rétinienne sur SD-OCT scans correspondent bien avec les ex vivo des mesures sur des coupes histologiques de rétine15,31 et donc SD-OCT peuvent être utilisés comme une technique non invasive pour des mesures d’épaisseur rétinienne. À l’aide de SLO, nous avons pu identifier les cellules de la microglie positive gfp comme signal de hyperreflective dans les images fluorescentes auto, toutefois l’objectif de 102 ° grand champ a été en mesure de couvrir une plus grande surface de le œil par rapport à l’objectif de 55 °. SLO peut également être utilisé pour le suivi de la distribution de cellules rétiniennes microglie et activation chez les souris journaliste avec un récepteur fonctionnel fractalkine (Cx3cr1gfp / + souris) dans la rétine normale ou malades12, 21,,32. La combinaison de SD-OCT avec SLO dans la même session d’imagerie peut fournir des informations sur la distribution de la microglie et activation à la dégénérescence rétinienne et pourrait être utile pour la surveillance des maladies de la rétine de souris21.
Figure 1 : image représentative de l’appareil utilisé dans la présente étude. Pour l’image de le œil droit de la souris, la souris est positionnée sur la partie gauche de la plate-forme sur mesure avec son orbite droite face à la lentille et son corps allongé sujettes sur la partie gauche de la plate-forme. La hauteur de la plate-forme peut être ajustée en tournant vers la droite (pour abaisser la plate-forme) ou vers la gauche (pour soulever la plate-forme) « l’ajustement de repos de menton ». Le levier de filtre doit être positionné sur « A » pour permettre une imagerie IR + OCT et AF. Avec la molette de mise au point (non visible sur la figure), l’expérimentateur peut changer l’orientation du scanner. Le micromanipulateur peut servir à correctement s’illuminera et aligner la rétine pour des images de haute qualité. L’objectif peut être déplacé vers le haut, bas, droite ou à gauche de la poignée de l’appareil photo. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Illustration de panneau de commande de l’appareil. (A) sur la partie gauche de l’affichage du panneau contrôle les modes d’acquisition peuvent être sélectionnés (infrarouge, IR ; fluorescence auto, AF ou angiographie de vert d’indocyanine, ICGA ; combinés ou non avec la tomographie en cohérence optique, OCT). Sur la partie centrale du panneau de la valeur d’acquisition peut être choisie (intensité de l’analyse d’image, de section ou de volume IF). Le champ de vision est déterminé par la lentille chargée. Avec le bouton de sensibilité, la luminosité de l’image IR ou AF peut être ajustée. En appuyant sur le bouton de sensibilité, le logiciel va commencer en moyenne les images obtenues en IR ou AF pour fournir une image de haute qualité. Illustration (B) du menu modèle acquisition. (C) résumé des fonctions utilisées dans le logiciel avec l’icône correspondante. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : OCT scanne et auto images fluorescentes de la rétine de souris Cx3cr1gfp/gfp . (A) B-scans de la rétine de souris obtenue avec un 55 ° (panneau supérieur) ou un objectif de 30 ° (panneau inférieur). Les grossissements des cases jaunes sont présentés sur le panneau de droite. (B) les Images des cellules de la microglie positive gfp dans la rétine de souris Cx3cr1gfp/gfp obtenus avec un 55 ° et une lentille de 102 ° (gauche et droite de panneaux, respectivement). (C) des mesures d’épaisseur rétinienne, mesurée sur la même distance de la tête du nerf optique, le SD-OCT analyses provenant de l’objectif de 30 ° et 55 °. Une bonne corrélation a été observée entre les deux lentilles (corrélation de Pearson = 0,967). Barreaux de l’échelle : 200 µm, 100 µm sur images grossies de SD-OCT (A, panneau de droite). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le présent article montre un protocole pour l’acquisition de B-scans rétiniens et l’imagerie de gfp microglie positive distribution dans la rétine de souris dans la même session d’imagerie. SD-OCT et SLO sont de plus en plus utilisés dans des modèles animaux de la maladie de la rétine à fournir des informations d’altérations rétiniennes fois10,14,17,18,21. Avec ce protocole, Cx3cr1gfp/gfp ou Cx3cr1gfp / + rétine de souris peut être photographiée de façon non invasive et de l’épaisseur de la rétine peut se renseigner. C’est extrêmement important dans des modèles expérimentaux de maladie de la rétine, où la gravité de la maladie change au fil du temps ou lorsque des traitements thérapeutiques sont testés. En outre, le protocole décrit comment les lignées de souris journaliste peuvent être utilisées pour l’imagerie in vivo de cellules fluorescentes dans la rétine.
Toutefois, le protocole présenté ici a quelques limitations. Tout d’abord, l’imagerie de la rétine de souris dans des dispositifs conçus pour les humains peut être difficile en raison de la puissance optique totale plus élevée de l’oeil de la souris, qui peut conduire au latéral grossissement inexactitudes7. Toutefois, les mesures de SD-OCT axiales sont exacts8. En outre, examen de suivi chez la souris à l’aide de l’option « définir la référence » du logiciel est assez difficile en raison de la position pas fixe de la souris sur la plate-forme et longitudinale imagerie de la rétine de souris peut donc être difficile. Alignement longitudinal de le œil est possible en positionnant le nerf optique dans le centre de l’image infrarouge et ensuite acquérir les images souhaitées. Afin de corriger la rotation de le œil, alignements manuelles des images SD-OCT fr visage peuvent être réalisées après acquisition et appliquent sur les mesures d’épaisseur tel que décrit ailleurs33. Outre le système d’imagerie utilisé dans le présent protocole, autres systèmes d’imagerie ont également été développés offrent un angle plus grand et une plus grande surface rétinienne sans l’utilisation de la lentille de contact peut l’image. Par exemple les OPTOS peut couvrir une plus grande surface rétinienne mais avec une plus grande variabilité d’image par rapport à l’appareil utilisé dans la présente étude34. Malgré ces limites, le présent protocole peut être utilisé dans plusieurs modèles expérimentaux de la maladie de la rétine. Les informations qui peuvent être obtenues incluent altérations épaisseur rétinienne (gonflement, atrophie), détection de décollement de la rétine ou la présence de hyperreflective points marqués au fluorophore cellules et l’augmentation ou la diminution de leur nombre.
Combinaison des deux méthodes chez les souris hétérozygotes pour l’expression de Cx3cr1 (Cx3cr1gfp / +), qui ont un récepteur fonctionnel fractalkine, permet à l’expérimentateur de détecter simultanément en vivo modifications d’intégrité rétinienne en temps réel et possible microglia accumulation dans le voisinage des anomalies rétiniennes (p. ex., rétinal, gonflement, atrophie rétinienne) au cours de la maladie de la rétine ou de blessures. En outre, en appliquant l’analyse morphométrique, état d’activation de la microglie peut être évaluée selon la taille de soma et complexité des microglies traite21. Dans les maladies de la rétine, tels qu’occlusion de la veine rétinienne, activation et accumulation des microglies/macrophages sur sites atrophiques rétiniennes ont été observés27. Par ailleurs, chez les souris défectueux du gène Nr2e3 (nucléaire récepteurs sous-famille 2 groupe E membre 3), un modèle murin de la héréditaire récessif amélioré syndrome de sensibilité S-cône (ESCS), la couche nucléaire externe pliage (rosettes) peut être observée au début jours après la naissance.
Fait intéressant, les cellules de la microglie se trouvent à l’intérieur les rosettes et il a été suggéré que les microglies pourraient contribuer à la dégénérescence des photorécepteurs observés dans les rétines de ces souris35,36. Puisque l’activation des microglies ont été impliqués au cours de diverses maladies de la rétine et parfois est accompagnée d’altérations en architecture rétinienne10,27,37,38 , la combinaison de SD-OCT et SLO peut révéler des corrélations entre l’activation de la microglie et dégénérescence rétinienne. Malgré certaines difficultés, le présent protocole peut fournir de telles informations longitudinalement, et il serait donc utile pour la corrélation entre les dommages rétiniens avec cellules microgliales distribution/activation et pour la surveillance du traitement thérapeutique efficacité,21.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention de la Swiss National Science Foundation (FNS ; #320030_156019). Les auteurs ont bénéficié du soutien non financier Heidelberg Engineering GmBH, Allemagne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spectralis Imaging system (HRA+OCT) | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | ophthalmic imaging platform system |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | Version 1.9.13.0 |
| 78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lens | Volk Optical Inc., Ohio, USA | V78C | |
| Spectralis wide angle 55° lens | Heidelberg Engineering, Germany | 50897-002 | |
| ultra widefield 102° lens | Heidelberg Engineering, Germany | 50117-001 | |
| medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor) | Provet AG, Lyssach, Switzerland | Swissmedic Nr. 50'590 - ATCvet: QN05CM91 | anesthetic/analgesic |
| ketamine 50mg/ml (Ketalar) | Parke-Davis, Zurich, Switzerland | 72276388 | anesthetic |
| tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix) | ISPI, Bern, Switzerland | N/A | pupil dilation |
| Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mm | B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Straße, Germany | 9151125 | |
| hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%) | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | N/A | |
| +4 dpt rigid gas permeable contact lens | Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY | N/A | Base Curve: 7.20 to 8.40 mm Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm Power: -25.00 to +25.00 Diopters |
| balanced salt solution (BSS) | Inselspital, Bern, Switzerland | N/A | |
| silicon forceps | N/A | N/A | |
| atipamezole 5 mg/mL (Antisedan) | Provet AG, Lyssach, Switzerland | N/A | α2 adrenergic receptor antagonist |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA | N/A | statistical analysis software |
References
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