Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Vivo Tayf alanlı optik Koherens tomografi ve lazer Ophthalmoscopy tarama Cx3cr1gfp/gfp muhabir farelerin görüntüleme

Published: November 11, 2017 doi: 10.3791/55984
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Ophthalmology and Department of Clinical Research, Bern University Hospital and University of Bern

Summary

Bu protokolü nasıl yüksek çözünürlüklü spektral etki alanı optik Koherens tomografi gibi görüntüleme teknikleri açıklar ve lazer ophthalmoscopy tarama bir oftalmik görüntüleme platformu üzerinde bilgi edinme sistemiyle küçük Rodents yararlı olabilir dağıtım, hücre sırasıyla retina kalınlığı ve mikroglial.

Abstract

Spektral etki alanı optik Koherens tomografi (SD-Ekim) ve tarama lazer ophthalmoscopy (SLO), deneysel Oftalmoloji yaygın olarak kullanılır. Mevcut protokolünde ifade fareler yeşil flüoresan protein (gfp) Cx3cr1 organizatörü altında (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) microglia hücreleri vivo retina görüntü için kullanıldı. Microglia retina ikamet makrofajlar vardır ve birkaç retina hastalıkları1,2,3,4,5,6' karıştığı olmuştur. Bu iletişim kuralı retina B-bir oftalmik görüntüleme platformu sistemi kullanarak inceden inceye gözden geçirmek, SD-Ekim ve microglia hücre dağıtım SLO vivo içindeile Cx3cr1gfp/gfp farelerde görüntüleme ile üretimi için detaylı bir yaklaşım sağlar. İletişim kuralı birkaç muhabir fare satırlarında kullanılabilir. Ancak, burada sunulan protokolü için bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, SLO hem SD-Ekim, yüksek çözünürlüklü modunda kullanıldığında yüksek Aksiyel çözünürlük ama yanal çözünürlük ile veri toplama düşüktür (3,5 µm ve 6 µm, sırasıyla). Ayrıca, SLO odak ve doygunluk düzeyinde son derece parametre seçimi ve doğru hizalama göz bağlıdır. Ayrıca, insan hasta farelerde yüksek toplam optik güç fare göz nedeniyle zorlu için tasarlanan aygıt kullanarak insan gözünün karşılaştırıldığında; Bu büyütme yanlışlıklar7, lateral hangi da büyütme diğerleri arasında fare objektif tarafından bağlı yol açabilir. Ancak, eksenel tarama pozisyon karşın yanal büyütme bağlıdır, eksenel SD-Ekim ölçümleri doğru8.

Introduction

Deneysel Oftalmoloji retina patoloji incelenmesi genellikle histolojik teknikler kullanılarak değerlendirilir. Ancak, Histoloji hayvan euthanization gerektirir ve değişiklik doku güncel özellikler için neden olabilir. SD-Ekim ve SLO rutin klinik Oftalmoloji tanı amaçlı ve diyabetik makula ödemi9, anterior iskemik optik nöropati10veya retinitis pigmentosa11 gibi birkaç retina hastalıkları izleme kullanılır . SD-Ekim ve SLO daha fazla müdahale olmadan dilate pupil aracılığıyla görüntülenmiştir retina, yüksek çözünürlüklü görüntüler oluşturmak non-invaziv teknikler vardır. SD-Ekim SLO retina stereoskopik yüksek kontrastlı görüntüler üretmek için Floresans veri toplarken retina, kesitsel görüntüler oluşturmak için gelmekte veri toplayarak retina yapısı ve retina kalınlık bilgi sağlar. Günümüzde, her iki tekniğin de giderek daha küçük kemirgen12,13,14,15 (ya da bile Zebra balığı16,17) kullanarak deneysel Oftalmoloji kullanılır ve olabilir hem nitel ve nicel bilgi12,17,18,19,20,21sağlar.

Lipofuscins gibi endojen fluorophores birikimi ya da retina drusen oluşumu bu SLO tarafından auto floresan sinyali olarak görüntülenmeyecektir. Bu özellik, tanı ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu veya retinitis pigmentosa22,23gibi retina hastalıkları izleme için değerli bir tekniği SLO yapar. Deneysel Oftalmoloji içinde görüntüleme (AF) otomatik Floresans belirli hücre tipleri muhabir fare satırlarındaki tespiti için kullanılabilir. Örneğin, fare heterozigoz gfp Cx3cr124 organizatörü altında bir ifade için in vivo görselleştirme mikroglial hücrelerinin normal retina ve microglia/makrofaj incelenmesi için avantajlı olan Dynamics retina hastalığı21. Microglia doku homeostazı ve doku onarımı yaralanma1,25,26üzerine çok önemli bir rol oynamak retina, ikamet makrofajlar vardır. Microglia harekete geçirmek içinde retina retina yaralanma, iskemi ve dejenerasyonu retina hastalığı2,3,4,5, bu hücrelerinde bir rolü düşündüren, bildirilmiştir 6.

Amacı mevcut protokolü, retina görüntüleme ve SD-Ekim kullanarak ve retina kalınlık ölçüm yapılmasına ve görselleştirme Cx3cr1gfp/gfp fare retina kullanarak gfp olumlu microglia hücreler için nispeten basit bir yöntem tarif etmektir SLO (Heidelberg Spectralis HRA + OCT sistemi). Bu iletişim kuralı çeşitli fare satırlarındaki sağlıklı ya da hasta retina görüntüleme ve kalınlığı ölçümleri için yararlı olabilir. Ayrıca, xarakteristikaları analizleri tanıma ve miktar microglia sayı ve microglia harekete geçirmek SLO21kullanarak retina içinde gerçekleştirilir. Merkezi sinir sistemi (MSS), dejeneratif hastalıklar ve retina27,28,29dahil ile ilişkili Microglia hücrelerdir. Böylece, mevcut protokolünde kullanılan iki yöntem birleştirerek, microglia dağıtım ve retina dejenerasyonu yapılabilir, hangi izleme hastalık şiddeti kolaylaştırabilir veya tedavi edici etkinliği içinde vivoyaklaşıyor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

tüm yordamlarda kullanılan 24 kim gfp Cx3cr1 organizatörü altında hızlı BALB/c yetişkin erkek ve dişi fareler vardı. Fareler ARVO açıklamaya göre Ophthalmic ve vizyon araştırma hayvanlar kullanımı için tedavi edildi ve tüm yordamları hayvan refah İsviçre Federal düzenlemelerini göre İsviçre hükümetinin kabul edildi. Fareler medetomidine hidroklorid (0.75 mg/kg) ve ketamin (45 mg/kg) subkutan enjeksiyon tarafından anestezi. Uygun anestezi olduğunu doğruladı solunum hızı ve hayvan izleyerek ' s refleks bir kuyruk tutam karşı. Deney sonunda, CO 2 inhalasyon ile fareler euthanized.

Not: görüntüleme her oturum (en fazla 20 dk) olabildiğince hızlı bir şekilde gerçekleştirmek, katarakt oluşumu beri aşağıdaki anestezi retina görselleştirme 30 engel olabilir.

1. sistem yapılandırması

  1. bilgisayarı açın.
  2. Güç kaynağı açın. İleti " başlangıç Alım modülü " aygıtın Denetim Masası ekranda görünecektir.
  3. Çift yazılımı çalıştırmak için yazılımın masaüstü kısayolunu tıklatın.
  4. Veritabanı görünümü'nü tıklatın " hasta eklemek " simgesi.
  5. Açılan pencerede, gerekli tüm bilgileri ekle (Soyadı, adı, başlık, doğum tarihinizi, seks ve hasta-ID) ve'ı tıklatın " Tamam ". Pop penceresinde kornea eğriliği için 2 mm ve'ı tıklatın " ok ".
  6. 78 D standart oftalmik temassız slit lamba camı standart 30 ° optik önünde konumlandırın ve güvenli bir şekilde bant ile tutturmak.
  7. Filtre kolu cihazın soldaki gösterge üzerinde konumlandırılmış emin olun " A " IR + OCT ve AF ( şekil 1) görüntüleme izin verecek.

2. Fare hazırlık

  1. Kullanım 0.75 mg/kg ve bir ketamin medetomidine hidroklorid doz doz 45 mg/kg fosfat tamponlu tuz çözeltisi (anestezi çözüm hazırlamak için PBS, pH 7,4) içinde. Böylece, bir 20 g fare için ketamin son hacmiyle 50 µL PBS 18 µL medetomidine hidroklorid 15 µL karıştırın. Bir hafta kadar çözüm 4 ° C'de depolayın.
  2. Fare scruff ile kavramak ve Gözbebeklerin büyümesinden elde etmek için her göz tropicamide %0,5 + phenylephrine hidroklorid %2.5 bir damla uygulamak.
  3. Fareyi kontrol altında tutmak ve anestezi çözüm 50 µL subkutan insülin şırınga 30 G iğne için bağlı bir enjekte. Geri Isıtma yastığını yerleştirilir onun kafes içinde fare koymak. Fare tamamen uyuşturulmuş kadar 3-5 dk bekleyin. Anestezi derinliği değerlendirmek için fare kuyruk tutam. Kornea refleksi yavaşça fare kornea bir pamuk bez ile dokunarak kontrol edin. Olumlu hiçbir refleks görülmektedir, görüntüleme ile devam.
    Not: Anestezi sırasında solunum hızı izlemek önemlidir. Fare tamamen uyuşturulmuş değil, solunum hızı acı bir uyarıcı artacaktır.
  4. % 2 hydroxypropylmethylcellulose bir uygulama ile fare kornea damla her göz kulak hidrat.

3. SD-Ekim

  1. cihazın çene kalan ( şekil 1) bağlı özel yapım platformunda yaklaşık 32 ° c ısınma bir yama yerleştirin.
  2. Sağ gözü görüntü platformu ( şekil 1) sol tarafında fare yerleştirin. Fareyi sağ yörüngesini objektif yüzleri ve onun beden platformun sol tarafında yüzükoyun yatıyor olun.
  3. Hydroxypropylmethylcellulose bir damla sağ gözü üzerinde uygulamak ve dikkatle 4 diyoptri katı gaz geçirgen kontakt lens üzerinde konumlandırın (küresel güç:-25.00 +25.00 diyoptriden için). Kontakt lens dengeli tuz solüsyonu (BSS) depolar. Objektif kapmak için zarar görmemesi için plastik veya silikon forseps kullanın.
  4. Sarı kutu satın alma modülü ( şekil 2A üzerinde yeşil kutu) başlatmak için Denetim Masası görüntü sağ köşesinde tuşuna basın. Sarı kutu yeşile döndürür ve kontrol paneli menüsünden-ecek gözükmek üstünde belgili tanımlık perde ( şekil 2A).
  5. B-inceden inceye gözden geçirmek edinimi için kontrol panelindeki ( şekil 2A) IR + OCT seçeneğini belirleyin. Seçili ayarları kontrol panelindeki mavi vurgulanır.
  6. Select " Retina " altında " uygulama ve yapısı " yazılım ve hareket objektif fare göz doğru micromanipulator istimal belgili tanımlık aygıt ( şekil 1). Retina odaklanan önce şuna bir göstergesi " OD " ekranın sol alt tarafında seçilir. Tanımlar yazılımı otomatik olarak (OS) sol ve sağ (OD) gözü temel amacı konumuna.
    Not: amaç platform ortasına konumlandırdıysanız, bir hata iletisi ekranın altında görüntülenir. Yazılım doğru göz tanıyana kadar bu durumda fare biraz yeniden konumlandırmak.
  7. Kadar büyük damarları açıkça içinde fundus imge bilgisayar ekranın sol üstünde görülür odak topuzu ile retina üzerinde odaklanmak. Micromanipulator sol veya kamera bu yönde taşımak için sağa veya saat yönünde veya saat yönünün tersine, kamera taşımak için sırasıyla yukarı veya aşağı doğru çevirerek kamera taşımak.
    Not: platform üzerinde fareyi yeniden konumlandırmak veya kızılötesi görüntü optik sinir kafasından tercih edilen lokalizasyonu ulaşmak için objektif yukarı veya aşağı taşımak.
  8. Hassasiyet topuzu azaltmak için saat yönünün tersine veya fundus görüntü parlaklığını artırmak için saat yönünde çevir. Ne zaman en iyi odak elde bir SD-Ekim B-tarama ekranın sağ tarafta görünür.
    Not: B-inceden inceye gözden geçirmek odak noktası ayarlayarak görüntülenir olamaz, klavye kombinasyonu Ctrl + Alt + üst karakter + O tuşlarına basın. B-inceden inceye gözden geçirmek ekranda görünene kadar açılan pencerede başvuru kol değerini ayarlayın.
  9. ( şekil 2B tek satırda) desen menüsünden tek tarama ekranın sağ altta seçin.
  10. Micromanipulator ( şekil 1) cihazın sol, sağ, ileri veya geri (kamerayı bu yönde için) açmak B-inceden inceye gözden geçirmek üstü ve altı arasında bulunan olmasını sağlamak için pencere köşeleri, SD-Ekim tarama.
  11. Ayarla otomatik gerçek zamanlı (sanat) değeri yüksek kalitede görüntü elde etmek için en az 9.
    Not: Sanat çeşitli ardışık taramaları sayı ortalaması alınarak görüntü kalitesini artırır. Yüksek " sanat " değer, daha yüksek sinyal gürültü oranı ve böylece görüntü kalitesi. Ancak, artırarak " sanat " değeri, edinme zaman da artırdı.
  12. Basın " elde " düğmesini ( Şekil 2) kontrol paneli ekranında ve görüntüleri.
  13. Fareyi sol göz görüntü ve adımları 3.2-3.12 tekrar yeniden konumlandırma.
  14. Plastik/silikon Forseps ile Kontakt lens çıkarın ve BSS yerleştirin.
  15. Hydroxypropylmethylcellulose taze bir damla ile fare kornea hidrat ve kağıt mendil ile aşırı kaldırmak.
  16. Standart 30 ° optik Saat yönünün tersine çevirerek kaldırmak.
  17. 55 ° objektif mount ve adımları 3.4-3.12 her göz için yineleyin.

4. Floresans Imaging otomatik

  1. platform üzerinde fareyi hareket olmadan, IR kontrol panelinden seçin.
  2. Odak topuzu ile büyük retina damarları üzerinde odaklanmak.
  3. Kontrol panelinden seçin AF.
  4. Hassasiyet topuzu azaltmak için saat yönünün tersine çevirmek veya görüntü parlaklığını artırmak için saat yönünde.
  5. Hassasiyet topuzu basın ve ayarla " sanat " değeri 67 veya yüksek kalite elde etmek için daha fazla resim için.
  6. Ne zaman set " sanat " değer ulaştı, basın " elde " görüntü elde etmek için kontrol panelindeki. Durdurmayı yeniden ortalama hassasiyet topuzu tuşuna basın. Farklı retina Katmanlar görselleştirmek için odağı ayarlayın.
  7. 55 ° objektif kaldırmak ve geniş alan 102 ° objektif mount. 4.1 adımları izleyin – 4,6 her fare ve her iki gözde her fare için.
  8. Tıklama “ görüntüleri kaydetmek ” pencere ve ardından sol üst kenarının üzerinde “ çıkmak ”. Görüntülerin bilgisayara kaydetmek için fareyi ekranın sağ tarafında yanında çift tıkırtı üstünde belgili tanımlık fare ad listeden. Çift ayrı ayrı her resmin üzerine tıklayın ve floppy disk simgesine tıklayın. Resmi olarak .tif, .bmp, .jpg veya .png, istediğiniz klasöre kaydedin. Yazılım basın çıkmak için “ dosya ” ve “ çıkmak ”.

5. Anestezi ters

  1. hydroxypropylmethylcellulose bir damla fare gözlerle hidrat ve fare bir Isıtma yastığı iade.
  2. Hazırla atipamezole çözüm medetomidine hidroklorid yatıştırıcı etkileri tersine çevirmek için 2.25 mg/kg dozda. 20 g fare için 150 µL PBS son bir hacim içinde atipamezol 9 µL ekleyin. Bir hafta kadar çözüm 4 ° C'de depolayın.
  3. sonra anestezi enjeksiyonu (Adım 2.2), enjekte atipamezole çözüm 150 µL subkutan min.
  4. Anestezi kurtarma kadar fare izleyin. Fare tam olarak kurtarılan (5-10 dk sonra atipamezole enjeksiyon) ne zaman geri, kafese. Kurtarma bir tarafta koydu onun beden açmak için yetenek hayvan simgesiyle yürüyüş etkinliği ve yanıt olarak çevre stimülasyon tepki yeniden kazanmak.

6. El ile retina kalınlık ölçüm SD-Ekim görüntülerden

  1. OCT inceden inceye gözden geçirmek belgili tanımlık hayvan adını çift tıklatarak açın.
  2. 30 ° veya 55 ° lens ile elde edilen B tarama açık.
  3. Seç " kalınlığı profil ".
  4. Basın " düzenleme katman Segmentations " simgesi ( şekil 2B). Yazılımı otomatik olarak iç sınırlama tanımlar ve temel membran.
  5. Gerekirse, el ile düzeltin iç sınırlama pozisyon ve baz membran. Bunu yapmak için ekran ve ardından kırmızı daire seçeneği ( şekil 2B) sol taraftan değiştirilecek katman'ı seçin. Hareket satırı değiştirin için fare düğmesini daireyle basmış.
  6. İlgili katman doğru şekilde konumlandırmak için satırı değiştirin. ' I tıklatın " kaydedin ve kapatın " pencereden çıkmak için.
    Not: koroid yansıtırlık nedeniyle, belgili tanımlık bilgisayar yazılımı temel membran yanlış tespit edebilir. Böylece, retina kalınlığı ölçümleri geçmeden önce el ile tanımlamak için tercih edilir.
  7. Seç " Retina " altında " katman " seçeneği. Bir diyagramı retina kalınlığı ekranın altında görüntülenir.
  8. Seçili pozisyon için ya diyagram üzerinde ya da taramasında B-retina kalınlığı (µm gösterilen) görüntülemek için farklı bir konumda tıklatın.
  9. Optik sinir başı istenilen mesafe içinde retina kalınlık ölçümü ve elektronik tablodaki değerleri kopyalamak.
  10. 5.1-5,9 her fare 30 ° ve 55 ° lens için için adımlar yineleyin.
  11. İstenen yazılım ile istatistiksel analiz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada sunulan iletişim kuralını kullanarak, SD-Ekim tarar ve SLO görüntüleri Cx3cr1gfp/gfp fareler aynı görüntüleme oturumunda elde edilmiştir. Şekil 3 temsilcisi SD-Ekim 30 ° veya bir 55 ° lens (şekil 3A) ve temsilcisi SLO görüntüleri ile elde edilen tek inceden inceye gözden geçirmek nerede gfp olumlu microglia hücreleri görselleştirildiği 55 ° veya bir 102 ° lens ile elde içerir. Koroid daha yüksek yansıtırlık SD-Ekim gözlenen taramaları elde ile 30 ° 55 ° objektif ile karşılaştırıldığında. Ancak, retina mimari 30 ° ve 55 ° görüntüler (şekil 3, doğru büyütülmüş resimler) açıktır. Retina sınırları el ile düzeltme sonra (iç sınırlama ve baz membran), iyi bir korelasyon retina kalınlık ölçüm 30 o ve 55 ° objektif arasında optik sinir başı ( aynı mesafe ölçme gözlenmiştir Şekil 3 c; Pearson korelasyon 0.967, p = < 0.0001). Önceki çalışmalar SD-Ekim taramaları ilişkili retina kalınlık ölçümler ex vivo ölçümleri histolojik retina bölümleri15,31 ve böylece SD-Ekim ile iyi bir non-invaziv teknik olarak kullanılabileceğini göstermiştir Retina kalınlığı ölçümleri için. Geniş alan 102 ° lens 55 ° objektif ile karşılaştırıldığında daha büyük bir fundus alanı kapsayacak şekilde mümkün ancak SLO kullanarak, biz gfp olumlu microglia hücreleri otomatik floresan görüntülerde hyperreflective sinyal olarak tanımlayabilir. SLO de kullanılan retina microglia hücreleri dağıtım ve fonksiyonel fractalkine reseptör ile muhabir farelerde harekete geçirmek izlemek için (Cx3cr1gfp / + fareler) normal ya da hastalıklı retina12, 21,32. SD-Ekim SLO ile birlikte aynı görüntüleme oturumda microglia dağıtım ve retina dejenerasyonu üzerine harekete geçirmek hakkında bilgi sağlayabilir ve fareler21retina hastalıkları izlemek için yararlı olabilir.

Figure 1
Şekil 1: mevcut çalışmada kullanılan cihazın temsili resim. Fare sağ gözü görüntü için fareyi ısmarlama platformu sol tarafında objektif ve platformun sol tarafında eğilimli yalan onun beden karşı karşıya doğru yörüngesi ile yerleştirilir. Platform yüksekliği (platform düşürmek için) saat yönünde çevirerek tarafından ayarlanan veya (platform yukarı kaldırın için) saat yönünün tersine olabilir "çene dinlenme ayarlama". Filtre kolu IR + OCT ve AF görüntüleme izin vermek için "A" konumlandırılmalıdır. Odak düğmesi (şekil üzerinde görünmeyen) deneyci odak tarayıcının değiştirebilirsiniz. Micromanipulator doğru aydınlatmak ve yüksek kaliteli görüntüler için retina hizalamak için kullanılabilir. Amaç taşındı yukarı, aşağı, sağ veya kamera tanıtıcıyla yaptı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: illüstrasyon cihazın kontrol panelinin. (A)Alım modları seçili Denetim Masası görüntü sol kısmında (kızılötesi, IR; otomatik Floresans, AF veya indocyanine yeşil anjiyografi, ICGA; kombine veya optik Koherens tomografi, OCT ile değil). Panelinin orta kısmı satın alma ayarı (Eğer görüntü, bölüm veya birim taramaları yoğunluğu) seçilebilir. Görüş alanı yüklü objektif tarafından belirlenir. Hassasiyet topuzu ile IR veya AF görüntünün parlaklığı ayarlanabilir. Hassasiyet topuzu basarak, belgili tanımlık bilgisayar yazılımı yüksek kaliteli görüntü sağlamak için IR veya AF içinde elde edilen görüntüleri ortalama başlayacaktır. (B) Alım desen menü Illustration. (C) Özeti karşılık gelen simgeyi yazılımıyla kullanılan fonksiyonların. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: OCT tarar ve floresan Cx3cr1gfp/gfp fare retina görüntülerini auto. (A)B-taranmasını 55 ° (üst paneli) ya da bir 30 ° lens (alt paneli) ile elde edilen fare retina. Yüksek büyütme sarı kutuları sağ panelde sunulmaktadır. Retina 55 ° ve (sol ve sağ kapı aynası, sırasıyla) 102 ° lens ile elde edilen Cx3cr1gfp/gfp farelerin gfp olumlu microglia hücrelerinin (B) görüntüler. (C) retina kalınlığı ölçümleri, optik sinir başı 30 ° ve 55 ° objektiften türetilmiş SD-Ekim taramalar aynı mesafe ölçülür. İyi bir korelasyon arasında iki lens gözlenmiştir (Pearson korelasyon 0.967 =). Ölçek çubukları: 200 µm, 100 µm büyütülmüş SD-Ekim görüntülerde (bir, doğru kapı aynası). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mevcut madde retina B-inceden inceye gözden geçirmek toplama ve görüntüleme gfp olumlu microglia dağıtım fare retina görüntüleme aynı oturumda bir iletişim kuralı gösterir. SD-Ekim ve SLO giderek retina hastalığı hayvan modellerinde saat10,14,17,18,21üzerinde retina değişikliklerini bilgi sağlamak için kullanılır. Bu iletişim kuralı, Cx3cr1gfp/gfp ile ya da Cx3cr1gfp / + fare retina non-invaziv görüntüsü ve retina kalınlığı bilgi elde edilebilir. Bu hastalık şiddeti zamanla değiştiği veya tedavi tedaviler test edilirken retina hastalığı deneysel modellerinde, kritik önemlidir. Ayrıca, protokol nasıl muhabir fare satırları retina floresan hücreleri vivo içinde görüntüleme için kullanılabilir açıklar.

Ancak, burada sunulan Protokolü bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, insanlar için tasarlanmış aygıtlar fare retinada görüntüleme yüksek toplam optik güç büyütme yanlışlıklar7yan yol açabilir fare göz nedeniyle zor olabilir. Ancak, eksenel SD-Ekim ölçümleri doğru8vardır. Ayrıca, takip sınav belgili tanımlık bilgisayar yazılımı "başvuru oluşturun" seçeneğini kullanarak farelerde platform üzerinde fareyi sabit değil konumu nedeniyle oldukça zordur ve böylece fare retina boyuna görüntüleme zor olabilir. Boyuna hizalama gözün Optik siniri kızılötesi görüntü ortasına konumlandırma ve istediğiniz görüntüleri elde etme elde edilebilir. Göz rotasyon için düzeltmek için SD-Ekim tr yüz görüntüleri manuel hizalamaları edinme sonra gerçekleştirilebilir ve başka bir yerde33açıklandığı gibi kalınlığı ölçümleri için geçerlidir. Mevcut protokolünde kullanılan görüntüleme sistemi yanı sıra diğer görüntüleme sistemleri de daha büyük bir açı sağlayan ve Kontakt lens kullanımı olmadan daha büyük bir retina alanı olabilir görüntü geliştirilmiştir. Optos örneğin daha büyük bir retina yüzeyine kapsar ancak mevcut kullanılan aygıt kıyasla daha büyük görüntü değişkenliği ile34çalışma. Bu sınırlamaları rağmen mevcut Protokolü deneysel retina hastalığının modellerinde kullanılabilir. Retina kalınlık değişiklikler (şişme, atrofi), retina dekolmanı tespiti veya hyperreflective nokta ve fluorophore etiketli hücreleri ve artış veya azalma sayıları elde edilebilir bilgi içerir.

Heterozigoz farelerde iki yöntem Cx3cr1 bir ifade için kombinasyonu (Cx3cr1gfp / +), hangi-si olmak bir fonksiyonel fractalkine reseptör sağlar aynı anda vivo algılamaya deneyci Retina bütünlük içinde gerçek zamanlı ve olası microglia birikimi retina bozuklukları (örneğin, şişme, retina retina atrofisi) civarında retina hastalık veya yaralanma sırasında değişikliklere. Ayrıca, xarakteristikaları analiz uygulayarak, microglia harekete geçirmek durum soma boyutuna göre tespit edilebilir ve microglia karmaşıklığını21işler. Retinal ven oklüzyonu gibi retina hastalıklarında harekete geçirmek ve microglia/makrofajlar retina atrofik sitelerde birikimi27gözlenmiştir. Ayrıca, farelerde Nr2e3 gen (nükleer reseptör alt familya 2 grup E üye 3) kusurlu, recessively devralınan bir fare modeli S-koni duyarlılık Sendromu (ESCS) gelişmiş, (rozet) katlanır dış nükleer tabaka, erken görülebilir Doğum sonrası gün.

İlginçtir, microglia hücre-ebilmek bulunmak içinde rozet ve o microglia photoreceptors bu fareler35,36retina içinde gözlenen dejenerasyonu katkıda sürülmüştür. Efendim, karıştığı microglia aktivasyonu bu yana çeşitli retina hastalıkları ve bazen değişiklikler retina mimari10,27,37,38 eşlik ediyor , SD-Ekim ve SLO microglia harekete geçirmek ve retina dejenerasyonu arasındaki ilişkiler ortaya çıkarabilir. Bazı zorlukları rağmen mevcut Protokolü boyuna böyle bilgiler sağlayabilir ve böylece değerli retina hasar microglia dağıtım/harekete geçirmek ile korelasyon ve tedavi tedavisi izleme etkinliği21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (SNSF; #320030_156019) bir grant tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Heidelberg Engineering GmBH, Almanya kelimelerinde destek aldı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectralis Imaging system (HRA+OCT) Heidelberg Engineering, Germany N/A ophthalmic imaging platform system
Heidelberg Eye Explorer Heidelberg Engineering, Germany N/A Version 1.9.13.0
78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lens Volk Optical Inc., Ohio, USA V78C
Spectralis wide angle 55° lens Heidelberg Engineering, Germany 50897-002
ultra widefield 102° lens Heidelberg Engineering, Germany 50117-001
medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor) Provet AG, Lyssach, Switzerland Swissmedic Nr. 50'590 - ATCvet: QN05CM91 anesthetic/analgesic
ketamine 50mg/ml (Ketalar) Parke-Davis, Zurich, Switzerland 72276388 anesthetic
tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix) ISPI, Bern, Switzerland N/A pupil dilation
Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mm B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Straße, Germany 9151125
hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%) OmniVision, Neuhausen, Switzerland N/A
+4 dpt rigid gas permeable contact lens Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY N/A Base Curve: 7.20 to 8.40 mm
Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm
Power: -25.00 to +25.00 Diopters
balanced salt solution (BSS) Inselspital, Bern, Switzerland N/A
silicon forceps N/A N/A
atipamezole 5 mg/mL (Antisedan) Provet AG, Lyssach, Switzerland N/A α2 adrenergic receptor antagonist
GraphPad Prism 7 GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA N/A statistical analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Madeira, M. H., Boia, R., Santos, P. F., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Contribution of microglia-mediated neuroinflammation to retinal degenerative diseases. Mediators Inflamm. , 673090 (2015).
  2. Ng, T. F., Streilein, J. W. Light-induced migration of retinal microglia into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (13), 3301-3310 (2001).
  3. Langmann, T. Microglia activation in retinal degeneration. J Leukoc Biol. 81 (6), 1345-1351 (2007).
  4. Joly, S., et al. Cooperative phagocytes: resident microglia and bone marrow immigrants remove dead photoreceptors in retinal lesions. Am J Pathol. 174 (6), 2310-2323 (2009).
  5. Arroba, A. I., Alvarez-Lindo, N., van Rooijen, N., de la Rosa, E. J. Microglia-mediated IGF-I neuroprotection in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (12), 9124-9130 (2011).
  6. Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Exp Eye Res. 81 (6), 700-709 (2005).
  7. Geng, Y., et al. Optical properties of the mouse eye. Biomed Opt Express. 2 (4), 717-738 (2011).
  8. Lozano, D. C., Twa, M. D. Development of a rat schematic eye from in vivo biometry and the correction of lateral magnification in SD-OCT imaging. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6446-6455 (2013).
  9. Vaz-Pereira, S., et al. Optical Coherence Tomography Features Of Active And Inactive Retinal Neovascularization In Proliferative Diabetic Retinopathy. Retina. 36 (6), 1132-1142 (2016).
  10. Kokona, D., Haner, N. U., Ebneter, A., Zinkernagel, M. S. Imaging of macrophage dynamics with optical coherence tomography in anterior ischemic optic neuropathy. Exp Eye Res. , (2016).
  11. Makiyama, Y., et al. Macular cone abnormalities in retinitis pigmentosa with preserved central vision using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. PLoS One. 8 (11), e79447 (2013).
  12. Paques, M., et al. High resolution fundus imaging by confocal scanning laser ophthalmoscopy in the mouse. Vision Res. 46 (8-9), 1336-1345 (2006).
  13. Joshi, R., et al. Spontaneously occurring fundus findings observed using confocal scanning laser ophthalmoscopy in wild type Sprague Dawley rats. Regul Toxicol Pharmacol. 77, 160-166 (2016).
  14. Muraoka, Y., et al. Real-time imaging of rabbit retina with retinal degeneration by using spectral-domain optical coherence tomography. PLoS One. 7 (4), e36135 (2012).
  15. Fischer, M. D., et al. Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography. PLoS One. 4 (10), e7507 (2009).
  16. Bell, B. A., et al. Retinal vasculature of adult zebrafish: in vivo imaging using confocal scanning laser ophthalmoscopy. Exp Eye Res. 129, 107-118 (2014).
  17. Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
  18. Huber, G., et al. Spectral domain optical coherence tomography in mouse models of retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5888-5895 (2009).
  19. Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative Analysis of Mouse Retinal Layers Using Automated Segmentation of Spectral Domain Optical Coherence Tomography Images. Transl Vis Sci Technol. 4 (4), 9 (2015).
  20. Sim, D. A., et al. A simple method for in vivo labelling of infiltrating leukocytes in the mouse retina using indocyanine green dye. Dis Model Mech. 8 (11), 1479-1487 (2015).
  21. Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma. J Vis Exp. (99), e52731 (2015).
  22. Acton, J. H., Cubbidge, R. P., King, H., Galsworthy, P., Gibson, J. M. Drusen detection in retro-mode imaging by a scanning laser ophthalmoscope. Acta Ophthalmol. 89 (5), e404-e411 (2011).
  23. Greenstein, V. C., et al. Structural and functional changes associated with normal and abnormal fundus autofluorescence in patients with retinitis pigmentosa. Retina. 32 (2), 349-357 (2012).
  24. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  25. Wang, X., et al. Requirement for Microglia for the Maintenance of Synaptic Function and Integrity in the Mature Retina. J Neurosci. 36 (9), 2827-2842 (2016).
  26. Ebneter, A., Casson, R. J., Wood, J. P., Chidlow, G. Microglial activation in the visual pathway in experimental glaucoma: spatiotemporal characterization and correlation with axonal injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (12), 6448-6460 (2010).
  27. Ebneter, A., Kokona, D., Schneider, N., Zinkernagel, M. S. Microglia Activation and Recruitment of Circulating Macrophages During Ischemic Experimental Branch Retinal Vein Occlusion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 944-953 (2017).
  28. Lin, Y. L., Potter-Baker, K. A. Using theoretical models from adult stroke recovery to improve use of non-invasive brain stimulation for children with congenital hemiparesis. J Neurophysiol. , (2017).
  29. Combadiere, C., et al. CX3CR1-dependent subretinal microglia cell accumulation is associated with cardinal features of age-related macular degeneration. J Clin Invest. 117 (10), 2920-2928 (2007).
  30. Bermudez, M. A., et al. Time course of cold cataract development in anesthetized mice. Curr Eye Res. 36 (3), 278-284 (2011).
  31. Toth, C. A., et al. A comparison of retinal morphology viewed by optical coherence tomography and by light microscopy. Arch Ophthalmol. 115 (11), 1425-1428 (1997).
  32. Ebneter, A., Kokona, D., Jovanovic, J., Zinkernagel, M. S. Dramatic Effect of Oral CSF-1R Kinase Inhibitor on Retinal Microglia Revealed by In Vivo Scanning Laser Ophthalmoscopy. Transl Vis Sci Technol. 6 (2), 10 (2017).
  33. Gabriele, M. L., et al. Reproducibility of spectral-domain optical coherence tomography total retinal thickness measurements in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (12), 6519-6523 (2010).
  34. Nakao, S., et al. Wide-field laser ophthalmoscopy for mice: a novel evaluation system for retinal/choroidal angiogenesis in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5288-5293 (2013).
  35. Wang, N. K., et al. Origin of fundus hyperautofluorescent spots and their role in retinal degeneration in a mouse model of Goldmann-Favre syndrome. Dis Model Mech. 6 (5), 1113-1122 (2013).
  36. Wang, N. K., et al. Cellular origin of fundus autofluorescence in patients and mice with a defective NR2E3 gene. Br J Ophthalmol. 93 (9), 1234-1240 (2009).
  37. Thanos, S. Sick photoreceptors attract activated microglia from the ganglion cell layer: a model to study the inflammatory cascades in rats with inherited retinal dystrophy. Brain Res. 588 (1), 21-28 (1992).
  38. Hughes, E. H., et al. Generation of activated sialoadhesin-positive microglia during retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (5), 2229-2234 (2003).

Tags

Tıp sayı: 129 Microglia retina optik Koherens tomografi tarama lazer ophthalmoscopy in vivo görüntüleme göz hastalıkları,
<em>Vivo</em> Tayf alanlı optik Koherens tomografi ve lazer Ophthalmoscopy tarama <em>Cx3cr1<sup>gfp/gfp</sup> </em> muhabir farelerin görüntüleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kokona, D., Jovanovic, J., Ebneter,… More

Kokona, D., Jovanovic, J., Ebneter, A., Zinkernagel, M. S. In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy. J. Vis. Exp. (129), e55984, doi:10.3791/55984 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter