Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

I Vivo Imaging for Cx3cr1gfp/gfp Reporter mus Spectral domener Optical Coherence tomografi og skanning Laser Ophthalmoscopy

Published: November 11, 2017 doi: 10.3791/55984
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Ophthalmology and Department of Clinical Research, Bern University Hospital and University of Bern

Summary

Denne protokollen beskriver hvordan høyoppløselig Bildeteknikker som spectral domene optical coherence tomografi og skanning laser ophthalmoscopy kan benyttes i små gnagere, bruker en ophthalmica tenkelig plattform system, for å få informasjon på netthinnen tykkelse og microglial celle distribusjon, henholdsvis.

Abstract

Spectral domene optical coherence tomografi (SD-oktober) og skanning laser ophthalmoscopy (SLO) er mye brukt i eksperimentell Oftalmologi. I den nåværende protokollen, mus uttrykke grønn fluorescerende protein (gfp) under arrangøren av Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) ble brukt til å image microglia celler i vivo i netthinnen. Microglia er bosatt makrofager av netthinnen og har vært innblandet i flere retinal sykdommer1,2,3,4,5,6. Denne protokollen gir en detaljert tilnærming for generering av netthinnen B-skanner med SD-oktober og avbilding av microglia celle distribusjon i Cx3cr1gfp/gfp mus med SLO i vivo, bruker en ophthalmica tenkelig plattform system. Protokollen kan brukes i flere reporter musen linjer. Det er imidlertid noen begrensninger for protokollen presenteres her. Først både SLO og SD-oktober, når den brukes i høy oppløsning modus, samle inn data med aksial høyoppløselig men lateral oppløsningen er lavere (3,5 µm og 6 µm, henholdsvis). Videre er nivået fokus og metning i SLO svært avhengig av parameteren valg og riktig justering av øyet. I tillegg bruker enheter designet for menneskelige pasienter i mus er utfordrende på grunn av høyere totale optisk makt av musen øyet forhold til det menneskelige øyet; Dette kan føre til lateral forstørrelse unøyaktigheter7, hvilke er også avhengig av forstørrelsen av musen linsen blant andre. Men til tross for at aksial skanningen posisjon er avhengig av lateral forstørrelse, aksial SD-oktober målingene er nøyaktig8.

Introduction

I eksperimentelle Oftalmologi beregnes undersøkelse av netthinnen patologi vanligvis ved hjelp av histologiske teknikker. Men histology krever dyr euthanization og kan forårsake endring i faktiske egenskapene av vev. SD-oktober og SLO brukes rutinemessig i klinisk Oftalmologi for diagnose og for overvåking av flere retinal sykdommer som diabetiker macula ødem9, anterior iskemiske fiberoptisk nevropati10eller retinitis pigmentosa11 . SD-oktober og SLO er ikke-invasiv teknikker som genererer høyoppløselige bilder av netthinnen, som er visualisert gjennom utvidede eleven uten ytterligere inngrep. SD-oktober gir informasjon av netthinnen struktur og retinal tykkelse ved å samle backscattering data for å opprette tverrsnitt bilder av netthinnen, mens SLO samler fluorescens data å produsere stereoskopisk bilder med høy kontrast av netthinnen. I dag er begge teknikkene blir stadig mer brukt i eksperimentell Oftalmologi bruker små gnagere12,13,14,15 (eller selv sebrafisk16,17) og kan gi både kvalitativ og kvantitativ informasjon12,17,18,19,20,21.

Akkumulering av endogene fluorophores som lipofuscins eller dannelsen av drusen i netthinnen kan visualiseres SLO som automatisk fluorescerende signal. Denne funksjonen gjør SLO en verdifull teknikk for diagnose og overvåking av netthinnen sykdommer som aldersrelatert makuladegenerasjon eller retinitis pigmentosa22,23. I eksperimentelle Oftalmologi, kan auto fluorescens imaging (AF) brukes for påvisning av spesifikke celletyper reporter musen linjer. For eksempel er mus heterozygote for uttrykket av gfp under bak Cx3cr124 fordelaktig for i vivo visualisering av microglial celler i normal netthinnen og etterforskning av microglia/macrophage dynamikken i netthinnen sykdom21. Microglia er det bosatt makrofager av netthinnen, som spiller en avgjørende rolle på vev homeostase og reparasjon av vev på skade1,25,26. Microglia aktivisering i netthinnen har rapportert retinal skade, iskemi og degenerasjon, antyder en rolle i disse cellene i netthinnen sykdom2,3,4,5, 6.

Målet med den nåværende protokollen er å beskrive en relativt enkel metode for retinal imaging og måling av netthinnen tykkelse ved hjelp av SD-oktober og visualisering av gfp positive microglia celler i Cx3cr1gfp/gfp musen netthinnen hjelp SLO (Heidelberg Spectralis HRA + OCT system). Denne protokollen kan benyttes for bildebehandling og tykkelse mål av sunn eller syke Netthinne i ulike musen linjer. I tillegg kan morphometric analyser utføres for identifikasjon og kvantifisering av microglia og microglia aktivisering i netthinnen bruker SLO21. Microglia celler er forbundet med degenerative sykdommer i sentralnervesystemet (CNS), inkludert de Netthinne27,28,29. Dermed, ved å kombinere de to metodene brukes i stede protokollen, korrelasjon av microglia distribusjon og retinal degenerasjon kan gjøres, som kan forenkle overvåking sykdommens alvorlighetsgrad eller effekten av terapeutisk tilnærminger i vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

i alle prosedyrer, BALB/c voksne mannlige og kvinnelige mus som uttrykker gfp under arrangøren av Cx3cr1 ble brukt 24. Mus ble behandlet etter ARVO erklæringen for bruk av dyr i Ophthalmic og visjon forskning og alle prosedyrer ble godkjent fra den sveitsiske regjeringen i henhold til føderale sveitsiske regelverket på Animal Welfare. Mus var anesthetized ved en subcutaneous injeksjon av medetomidine hydroklorid (0.75 mg/kg) og ketamin (45 mg/kg). Riktig anestesi ble bekreftet av respirasjonsfrekvens og dyr ' s refleks mot halen knipe. På slutten av eksperimenter, mus var euthanized med CO 2 innånding.

Merk: utføre hver tenkelig økt så raskt som mulig (maksimum 20 min), siden cataract formasjon følgende anestesi kan hemme retinal visualisering 30.

1. systemkonfigurasjonen

  1. slå på datamaskinen.
  2. Slår på strømforsyningen. Meldingen " Start oppkjøpet modul " vises på skjermen til enheten kontrollpanelet.
  3. Dobbeltklikk på programvaren skrivebordssnarveien til å drifte programvaren.
  4. Klikk på visningen databasen det " legge til " ikon.
  5. Sett all nødvendig informasjon i popup-vinduet (etternavn, fornavn, tittel, fødselsdato, kjønn, og pasienten-ID) og klikk " ok ". I vinduet pop set ryggsøylens hornhinnen til 2 mm og klikk " ok ".
  6. Plasserer en 78D standard ophthalmica kontaktløs slit lampe lens foran standard 30 ° optikk og feste det trygt med tape.
  7. Kontroller at filteret spaken på venstre for enheten er plassert på indikasjon " A " å tillate både IR + OCT og AF imaging ( figur 1).

2. Musen forberedelse

  1. Bruk en medetomidine hydroklorid dose 0.75 mg/kg og en ketamin dose 45 mg/kg i fosfat-bufret saltvann (PBS, pH 7.4) å forberede anestesi løsning. Dermed for 20 g mus, bland 15 µL av medetomidine hydrochloride med 18 µL av ketamin til et endelig antall 50 µL i PBS. Lagre løsningen på 4 ° C i opptil en uke.
  2. Hold musen av scruff og Påfør en dråpe tropicamide 0,5% + phenylephrine hydroklorid 2,5% på hvert øye å oppnå elev dilatasjon.
  3. Holder musen behersket, og med en insulin sprøyten festet til en 30G nål, injisere 50 µL av anestesi løsningen subcutaneously. Sett musen tilbake i buret sitt som er plassert over en varmeputen. Vent 3-5 minutter til musen er fullt bedøvet. For å vurdere bedøvende dybde, knip halen av musen. Sjekk det hornhinnen refleks ved å forsiktig trykke musen hornhinnen med en bomullspinne. Hvis ingen positive reflex er observert, fortsetter du med avbilding.
    Merk: Det er viktig å overvåke respirasjonsfrekvens under anestesi. Hvis musen ikke er helt bedøvet, respirasjonsfrekvens vil øke ved en smertefull stimulans.
  4. Hydrat musen hornhinnen med bruk av 2% hydroxypropylmethylcellulose dråper på hvert øye.

3. SD-oktober

  1. plasserer en oppvarming oppdatering av ca 32 ° C på skreddersydde plattformen festet på enhetens haken resten ( figur 1).
  2. Bilde høyre øye, plassere musen på venstre del av plattformen ( figur 1). Sikre at rett bane musen ansikter linsen og kroppen utsatt på den venstre delen av plattformen.
  3. Påfør en dråpe hydroxypropylmethylcellulose på høyre øye, og Plasser en 4 diopter stive gass permeabel kontaktlinser på den (sfærisk makt:-25.00 å +25.00 diopter). Lagre kontakten linsen i balansert salt løsning (BSS). For å fange linsen, bruke plast eller silisium tang for å unngå skade.
  4. Trykk den gule boksen til høyre for kontrollpanelet å starte modulen Kjøp (grønne boksen på figur 2A). Den gule boksen bli grønn og kontrollpanelet vises på skjermen ( figur 2A).
  5. For oppkjøpet av B-skanner, velger du alternativet IR + OCT på kontrollpanelet ( figur 2A). Valgte innstillingene er markert med blått på kontrollpanelet.
  6. Velg " netthinnen " under " program og strukturen " i programvaren og flytte linsen mot musen øyet bruker micromanipulator på enheten ( figur 1). Før fokusere på netthinnen, kontroller at indikasjon " OD " er valgt i den venstre nederste del av skjermen. Programvaren automatisk identifiserer venstre (OS) og høyre (OD) øye basert på plasseringen av målet.
    Merk: Hvis målet er plassert på midten av plattformen, vises en feilmelding på bunnen av skjermen. I så fall re Plasser musen litt til programvaren gjenkjenner riktig øyet.
  7. Med fokus knotten, fokusere på netthinnen til store fartøyene er tydelig i fundus bildet til venstre på skjermen. Flytte kameraet ved å slå micromanipulator venstre eller høyre, flytte kameraet i den retningen eller med eller mot klokken, å flytte kameraet opp eller ned, henholdsvis.
    Merk: Flytte musen på plattformen eller flytte linsen oppover eller nedover til oppnå den foretrukne lokaliseringen av synsnerven hodet i infrarød bildet.
  8. Slå følsomhet knotten mot klokken for å redusere eller med klokken for å øke fundus bildet. Når optimal fokus er oppnådd, en SD-oktober B-scan vises til høyre på skjermen.
    Merk: Hvis B-skanningen kan visualiseres ved å justere fokus, trykk kombinasjonen Ctrl + Alt + SKIFT + O på tastaturet. I hurtigvinduet justere verdien av referanse armen til B-skanningen vises på skjermen.
  9. På nederst til høyre på skjermen, velger du enkelt skanningen menyen mønster (én linje i figur 2B).
  10. Slå micromanipulator av enheten ( figur 1) venstre, høyre, fremover eller bakover (Hvis du vil aktivere kameraet i den retningen) for å sikre at B-skanningen ligger mellom øvre og nedre hjørner av SD-oktober skanne vinduet.
  11. Setter automatisk Real-Time (ART) verdien til minst 9 å få høykvalitetsbilder.
    Merk: ART forbedrer bildekvaliteten ved å beregne flere påfølgende skanninger. Høyere den " ART " verdi, jo høyere signal-til-støy-forhold og dermed bildekvaliteten. Men ved å øke den " ART " verdi, det overtakende gang også økes.
  12. Trykk på " erverve " ( figur 2) på skjermbildet Kontrollpanel og bildene.
  13. Flytte musen for å image venstre øye og Gjenta trinnene 3.2-3.12.
  14. Fjerne kontakten linsen med plast/silisium tang og plasser den i BSS.
  15. Hydrat musen hornhinnen med en frisk dråpe hydroxypropylmethylcellulose og fjerne overflødig med en papir.
  16. Fjerne standard 30 ° optikk ved å rotere det mot klokken.
  17. Montere 55 ° linsen og Gjenta trinnene 3.4-3.12 for hvert øye.

4. Auto fluorescens Imaging

  1. uten å bevege musen på plattformen, Velg IR kontrollpanelet.
  2. Med fokus knotten, fokus på store retinal fartøyene.
  3. På kontrollpanelet velger AF.
  4. Vri følsomhet-knotten mot klokken for å redusere eller klokken for å øke lysstyrken i bildet.
  5. Trykk følsomhet knotten og sette den " ART " verdi til 67 eller flere få høykvalitets bilder.
  6. Når sett " ART " verdien er nådd, trykk " erverve " på kontrollpanelet å anskaffe bildet. Trykk følsomhet-knappen igjen for å stoppe snitt. Justere fokus, for å visualisere ulike retinal lag.
  7. Fjerne 55° linsen og Monter bredt felt 102° linsen. Fremgangsmåten 4.1 – 4.6 for begge øynene hver mus og hver musen.
  8. Klikk “ lagre bilder ” på venstre øvre kantlinje i vinduet og klikk “ avslutte ”. Hvis du vil lagre bildene på datamaskinen, velger du musen fra listen på høyre del av skjermen ved å dobbeltklikke på musen navnet. Dobbeltklikk på hvert bilde separat, og klikk deretter på ikonet diskett. Lagre bildet som TIF, BMP, jpg eller png på ønsket mappe. Avslutte programvare pressen “ filen ” og “ avslutte ”.

5. Anestesi reversering

  1. hydrat musen øynene med en dråpe hydroxypropylmethylcellulose og returnere musen på en varmeputen.
  2. Forberede atipamezole løsning i en dose på 2,25 mg/kg å reversere beroligende effekten av medetomidine hydroklorid. For 20 g mus, legge 9 µL av atipamezol i en endelig mengde 150 µL PBS. Lagre løsningen på 4 ° C i opptil en uke.
  3. min etter anestesi injeksjon (trinn 2.2), injisere 150 µL atipamezole løsning subcutaneously.
  4. Dataskjerm musen til utvinning fra anestesi. Når musen er fullstendig gjenopprettet (5-10 min etter atipamezole injeksjon) sette den tilbake i buret sitt. Gjenoppretting er indikert av muligheten for dyr å slå sin kropp når lagt på den ene siden gjenvinne gå aktivitet og reagerer som svar til miljømessige stimulering.

6. Manuell Retinal tykkelse måling fra SD-oktober bilder

  1. Åpne OCT skanningen ved å dobbeltklikke på navnet på dyret.
  2. Åpne B-skanningen med 30 ° eller 55 ° linsen.
  3. Velg " tykkelse profil ".
  4. Trykk på " Rediger lag Segmentations " ikon ( figur 2B). Programvaren automatisk identifiserer indre begrensende og base membran.
  5. Eventuelt manuelt rette plasseringen av indre begrensende og base membran. Velg laget som skal endres fra venstre side av skjermen og deretter alternativet rød sirkel ( figur 2B) gjør. Flytt sirkelen med museknappen presset til å endre linjen.
  6. Endre linjen for å plassere den tilsvarende lag riktig. Klikk " lagre og Lukk " å lukke vinduet.
    Merk: På grunn av Reflektivitet av akkord, programvaren kan identifisere base membran feil. Dermed er det best å definere den manuelt før du fortsetter til netthinnen tykkelsen.
  7. Velg " netthinnen " under den " lag " alternativet. Et diagram av netthinnen tykkelse vises nederst på skjermen.
  8. Klikk på en annen plassering på diagrammet eller på B-søket vise retinal tykkelsen (angitt i µm) for den valgte stillingen.
  9. Måle retinal tykkelsen på ønsket avstand fra synsnerven hodet og kopiere verdiene i et regneark.
  10. Gjenta trinn 5.1 5,9 for hver musen for både den 30 ° og 55 ° linsen.
  11. Utføre statistisk analyse med ønsket programvare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjelp av protokollen som presenteres her, SD-oktober skanner og SLO bildene ble oppnådd fra Cx3cr1gfp/gfp mus i samme tenkelig økt. Figur 3 inkluderer representant SD-oktober enkelt skanner med en 30 ° eller en 55 ° linse (figur 3A) og representative SLO bilder hentet med en 55 ° eller en 102 ° linse, der gfp positive microglia celler er visualisert. Høyere Reflektivitet av akkord er observert i SD-oktober skanner oppnådd med den 30 ° forhold til 55 ° linsen. Netthinnen arkitektur er imidlertid klart i både den 30 ° og 55 ° bilder (Figur 3rett forstørret bilder). Etter manuell korreksjoner av netthinnen grenser (indre begrense og base membran), en god korrelasjon av netthinnen tykkelsen ble observert mellom 30 o og 55 ° linsen ved måling i samme avstand fra det optiske nerven hodet ( Figur 3 c; Pearson korrelasjon = 0.967, p < 0,0001). Tidligere studier har vist at retinal tykkelsen på SD-oktober skanner relatere med ex vivo målene på histologiske retinal avsnitt15,31 og dermed SD-oktober kan brukes som en ikke-invasiv teknikk for retinal tykkelsen. Bruker SLO, kan vi identifisere gfp positive microglia celler som hyperreflective signal i auto fluorescerende bilder, men bredt felt 102 ° linsen kunne dekker et større fundus område sammenlignet med 55 ° linsen. SLO kan også benyttes for overvåking av netthinnen microglia celler distribusjon og aktivisering i reporter mus med en funksjonell fractalkine reseptor (Cx3cr1gfp / + mus) i normal eller syke netthinnen12, 21,32. Kombinasjonen av SD-oktober med SLO i tenkelig økten kan gi informasjon om microglia fordeling og aktivisering på retinal degenerasjon og kan være nyttig for overvåking retinal sykdommer i mus21.

Figure 1
Figur 1: representativt bilde på enheten brukes studien. For å bilde høyre øye av musen, er musen plassert i venstre del av skreddersydde plattformen med riktig bane linsen og kroppen ligger utsatt på den venstre delen av plattformen. Høyden på plattformen kan være justert ved å vri med klokken (til lavere plattformen) eller mot klokken (for å løfte plattformen) "haken resten justering". Filteret spaken må være plassert til "A" for å tillate IR + OCT og AF bildebehandling. Grovskruen (ikke synlig på figuren), kan eksperimentator endre fokus for skanneren. Micromanipulator kan brukes til riktig belyse og justere netthinnen for høy kvalitet bilder. Målet kan flyttes opp, ned, høyre eller venstre i kameraet håndtaket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: illustrasjon av enhetens Kontrollpanel. (A) på venstre del av kontrollpanelet oppkjøpet moduser kan velges (infrarød, IR, auto fluorescens, AF eller indocyanine grønne angiography, ICGA, kombinert eller ikke med optical coherence tomografi, OCT). På den midtre delen av panelet kan innstillingen oppkjøpet velges (intensitet av hvis bildet, inndelingen eller volum skanner). Synsfelt bestemmes av lastet linsen. Med følsomhet knotten kan lysstyrken til IR- eller AF justeres. Ved å trykke følsomhet knotten, starter programmet snitt bilder innhentet i IR eller AF for å gi en høy kvalitet bilde. (B) illustrasjon av oppkjøpet mønster menyen. (C) Sammendrag av funksjoner som brukes i programvaren med ikonet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: OCT skanner og bilen fluorescerende bilder av Cx3cr1gfp/gfp musen netthinne. (A) B-skanninger av musen netthinnen med en 55 ° (øvre panel) eller en 30 ° linse (nedre panelet). Høyere forstørrelser av gul vises på det høyre panelet. (B) bilder av gfp positive microglia celler i netthinnen i Cx3cr1gfp/gfp mus med en 55 ° og en 102 ° linse (venstre og høyre paneler, henholdsvis). (C) Retinal tykkelsen, målt på samme avstand fra det optiske nerven hodet, på SD-oktober skanner fra 30 ° og 55 ° linsen. En god sammenheng ble observert mellom to linser (Pearson korrelasjon = 0.967). Skalere barer: 200 μm, 100 µm på forstørret SD-oktober bilder (A, høyre panel). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne artikkel beskriver en protokoll for oppkjøpet av netthinnen B-skanner og bildebehandling for gfp positive microglia distribusjon i musen netthinnen i samme tenkelig økt. SD-oktober og SLO brukes stadig i dyremodeller retinal sykdom for å gi informasjon for retinal endringer over tid,10,,14,,17,,18,,21. Med denne protokollen, Cx3cr1gfp/gfp eller Cx3cr1gfp / + mus netthinnen kan avbildes ikke-invasively og informasjon av netthinnen tykkelse. Dette er kritisk viktig i netthinnen sykdom eksperimentelle modeller, der sykdommens alvorlighetsgrad endringer over tid eller når terapeutiske behandlinger er testet. Videre beskriver protokollen hvordan reporter musen linjer kan benyttes for i vivo avbilding av fluorescerende celler i netthinnen.

Protokollen presenteres her har imidlertid noen begrensninger. Først kan avbilding av musen netthinnen i enheter designet for mennesker være utfordrende fordi at høyere totale optisk mus-øyet, som kan føre til lateral forstørrelse unøyaktigheter7. Men er aksial SD-oktober målingene nøyaktig8. Dessuten oppfølging eksamen i mus ved hjelp av alternativet "Angi referanse" av programvaren er ganske vanskelig på grunn av ikke fast plasseringen av musen på plattformen og dermed langsgående avbilding av musen Netthinne kan være utfordrende. Langsgående justering av øyet kan oppnås ved å plassere den optiske nerven i midten av infrarød bildet da anskaffe de ønskede bildene. For å korrigere for øye rotasjon, manuelle justeringer av SD-oktober no ansikt bildene kan utføres etter oppkjøpet og gjelder tykkelsen som beskrevet andre steder33. Foruten tenkelig systemet brukes i stede protokollen, har andre imaging-systemer også blitt utviklet som gir en større vinkel og kan bildet et større retinal område uten bruk av kontakten linsen. Optos kan for eksempel dekke et større retinal overflaten men med større bilde variasjon i forhold til enheten som brukes i dag studere34. Til tross for disse begrensningene, kan nåværende protokollen benyttes i flere eksperimentelle modeller av netthinnen sykdom. Informasjonen som kan oppnås inkluderer retinal tykkelse endringer (hevelse, atrofi), oppdagelsen av Netthinneavløsning eller hyperreflective prikker og fluorophore-merket celler og økning eller reduksjon av sine tall.

Kombinasjonen av de to metodene i mus heterozygote for uttrykket av Cx3cr1 (Cx3cr1gfp / +), som har en funksjonell fractalkine reseptor, gjør eksperimentator samtidig oppdage i vivo endringer av netthinnen integritet i sanntid og mulige microglia opphopning i netthinnen avvik (f.eks, retinal hevelse, netthinne atrofi) under retinal sykdom eller skade. Videre bruker morphometric analyse, microglia aktiveringsstatus kan bli vurdert basert på soma størrelsen og kompleksiteten i microglia prosesser21. I netthinnen sykdommer, som retinal vene okklusjon, har aktivisering og akkumulering av microglia/makrofager på netthinnen atrofier nettsteder blitt observert27. Videre i mus defekt for Nr2e3 genet (kjernefysisk reseptor gruppe 2 gruppe E medlem 3), en musemodell av recessively arvet forbedret S-membran følsomhet syndrom (ESCS), det ytterste kjernefysiske laget folding (rosetter) kan observeres på tidlig Postnatal dager.

Interessant, microglia celler kan grunnlegge innenfor rosetter, og det har blitt foreslått at microglia kan bidra til at degenerasjon av fotoreseptorer observert i netthinnen i disse mus35,36. Siden aktivering av microglia har vært innblandet i løpet av ledsages en rekke retinal sykdommer og noen ganger av endringer i netthinnen arkitektur10,27,37,38 , kombinasjonen av SD-oktober og SLO kan avdekke sammenhenger mellom microglia aktivisering og retinal degenerasjon. Til tross for noen utfordringer, nåværende protokollen kan gi slik informasjon langs, og dermed ville det være nyttig for korrelasjon av retinal skade med microglia distribusjon/aktivisering og overvåking av terapeutisk behandling effektiviteten21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av et tilskudd på Swiss National Science Foundation (SNSF, #320030_156019). Forfatterne fikk støtte fra Heidelberg Engineering GmBH, Tyskland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectralis Imaging system (HRA+OCT) Heidelberg Engineering, Germany N/A ophthalmic imaging platform system
Heidelberg Eye Explorer Heidelberg Engineering, Germany N/A Version 1.9.13.0
78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lens Volk Optical Inc., Ohio, USA V78C
Spectralis wide angle 55° lens Heidelberg Engineering, Germany 50897-002
ultra widefield 102° lens Heidelberg Engineering, Germany 50117-001
medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor) Provet AG, Lyssach, Switzerland Swissmedic Nr. 50'590 - ATCvet: QN05CM91 anesthetic/analgesic
ketamine 50mg/ml (Ketalar) Parke-Davis, Zurich, Switzerland 72276388 anesthetic
tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix) ISPI, Bern, Switzerland N/A pupil dilation
Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mm B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Straße, Germany 9151125
hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%) OmniVision, Neuhausen, Switzerland N/A
+4 dpt rigid gas permeable contact lens Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY N/A Base Curve: 7.20 to 8.40 mm
Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm
Power: -25.00 to +25.00 Diopters
balanced salt solution (BSS) Inselspital, Bern, Switzerland N/A
silicon forceps N/A N/A
atipamezole 5 mg/mL (Antisedan) Provet AG, Lyssach, Switzerland N/A α2 adrenergic receptor antagonist
GraphPad Prism 7 GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA N/A statistical analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Madeira, M. H., Boia, R., Santos, P. F., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Contribution of microglia-mediated neuroinflammation to retinal degenerative diseases. Mediators Inflamm. , 673090 (2015).
  2. Ng, T. F., Streilein, J. W. Light-induced migration of retinal microglia into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (13), 3301-3310 (2001).
  3. Langmann, T. Microglia activation in retinal degeneration. J Leukoc Biol. 81 (6), 1345-1351 (2007).
  4. Joly, S., et al. Cooperative phagocytes: resident microglia and bone marrow immigrants remove dead photoreceptors in retinal lesions. Am J Pathol. 174 (6), 2310-2323 (2009).
  5. Arroba, A. I., Alvarez-Lindo, N., van Rooijen, N., de la Rosa, E. J. Microglia-mediated IGF-I neuroprotection in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (12), 9124-9130 (2011).
  6. Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Exp Eye Res. 81 (6), 700-709 (2005).
  7. Geng, Y., et al. Optical properties of the mouse eye. Biomed Opt Express. 2 (4), 717-738 (2011).
  8. Lozano, D. C., Twa, M. D. Development of a rat schematic eye from in vivo biometry and the correction of lateral magnification in SD-OCT imaging. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6446-6455 (2013).
  9. Vaz-Pereira, S., et al. Optical Coherence Tomography Features Of Active And Inactive Retinal Neovascularization In Proliferative Diabetic Retinopathy. Retina. 36 (6), 1132-1142 (2016).
  10. Kokona, D., Haner, N. U., Ebneter, A., Zinkernagel, M. S. Imaging of macrophage dynamics with optical coherence tomography in anterior ischemic optic neuropathy. Exp Eye Res. , (2016).
  11. Makiyama, Y., et al. Macular cone abnormalities in retinitis pigmentosa with preserved central vision using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. PLoS One. 8 (11), e79447 (2013).
  12. Paques, M., et al. High resolution fundus imaging by confocal scanning laser ophthalmoscopy in the mouse. Vision Res. 46 (8-9), 1336-1345 (2006).
  13. Joshi, R., et al. Spontaneously occurring fundus findings observed using confocal scanning laser ophthalmoscopy in wild type Sprague Dawley rats. Regul Toxicol Pharmacol. 77, 160-166 (2016).
  14. Muraoka, Y., et al. Real-time imaging of rabbit retina with retinal degeneration by using spectral-domain optical coherence tomography. PLoS One. 7 (4), e36135 (2012).
  15. Fischer, M. D., et al. Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography. PLoS One. 4 (10), e7507 (2009).
  16. Bell, B. A., et al. Retinal vasculature of adult zebrafish: in vivo imaging using confocal scanning laser ophthalmoscopy. Exp Eye Res. 129, 107-118 (2014).
  17. Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
  18. Huber, G., et al. Spectral domain optical coherence tomography in mouse models of retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5888-5895 (2009).
  19. Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative Analysis of Mouse Retinal Layers Using Automated Segmentation of Spectral Domain Optical Coherence Tomography Images. Transl Vis Sci Technol. 4 (4), 9 (2015).
  20. Sim, D. A., et al. A simple method for in vivo labelling of infiltrating leukocytes in the mouse retina using indocyanine green dye. Dis Model Mech. 8 (11), 1479-1487 (2015).
  21. Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma. J Vis Exp. (99), e52731 (2015).
  22. Acton, J. H., Cubbidge, R. P., King, H., Galsworthy, P., Gibson, J. M. Drusen detection in retro-mode imaging by a scanning laser ophthalmoscope. Acta Ophthalmol. 89 (5), e404-e411 (2011).
  23. Greenstein, V. C., et al. Structural and functional changes associated with normal and abnormal fundus autofluorescence in patients with retinitis pigmentosa. Retina. 32 (2), 349-357 (2012).
  24. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  25. Wang, X., et al. Requirement for Microglia for the Maintenance of Synaptic Function and Integrity in the Mature Retina. J Neurosci. 36 (9), 2827-2842 (2016).
  26. Ebneter, A., Casson, R. J., Wood, J. P., Chidlow, G. Microglial activation in the visual pathway in experimental glaucoma: spatiotemporal characterization and correlation with axonal injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (12), 6448-6460 (2010).
  27. Ebneter, A., Kokona, D., Schneider, N., Zinkernagel, M. S. Microglia Activation and Recruitment of Circulating Macrophages During Ischemic Experimental Branch Retinal Vein Occlusion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 944-953 (2017).
  28. Lin, Y. L., Potter-Baker, K. A. Using theoretical models from adult stroke recovery to improve use of non-invasive brain stimulation for children with congenital hemiparesis. J Neurophysiol. , (2017).
  29. Combadiere, C., et al. CX3CR1-dependent subretinal microglia cell accumulation is associated with cardinal features of age-related macular degeneration. J Clin Invest. 117 (10), 2920-2928 (2007).
  30. Bermudez, M. A., et al. Time course of cold cataract development in anesthetized mice. Curr Eye Res. 36 (3), 278-284 (2011).
  31. Toth, C. A., et al. A comparison of retinal morphology viewed by optical coherence tomography and by light microscopy. Arch Ophthalmol. 115 (11), 1425-1428 (1997).
  32. Ebneter, A., Kokona, D., Jovanovic, J., Zinkernagel, M. S. Dramatic Effect of Oral CSF-1R Kinase Inhibitor on Retinal Microglia Revealed by In Vivo Scanning Laser Ophthalmoscopy. Transl Vis Sci Technol. 6 (2), 10 (2017).
  33. Gabriele, M. L., et al. Reproducibility of spectral-domain optical coherence tomography total retinal thickness measurements in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (12), 6519-6523 (2010).
  34. Nakao, S., et al. Wide-field laser ophthalmoscopy for mice: a novel evaluation system for retinal/choroidal angiogenesis in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5288-5293 (2013).
  35. Wang, N. K., et al. Origin of fundus hyperautofluorescent spots and their role in retinal degeneration in a mouse model of Goldmann-Favre syndrome. Dis Model Mech. 6 (5), 1113-1122 (2013).
  36. Wang, N. K., et al. Cellular origin of fundus autofluorescence in patients and mice with a defective NR2E3 gene. Br J Ophthalmol. 93 (9), 1234-1240 (2009).
  37. Thanos, S. Sick photoreceptors attract activated microglia from the ganglion cell layer: a model to study the inflammatory cascades in rats with inherited retinal dystrophy. Brain Res. 588 (1), 21-28 (1992).
  38. Hughes, E. H., et al. Generation of activated sialoadhesin-positive microglia during retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (5), 2229-2234 (2003).

Tags

Medisin problemet 129 Microglia netthinne optisk coherence tomografi skanning laser ophthalmoscopy i vivo bildebehandling Oftalmologi
<em>I Vivo</em> Imaging for <em>Cx3cr1<sup>gfp/gfp</sup> </em> Reporter mus Spectral domener Optical Coherence tomografi og skanning Laser Ophthalmoscopy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kokona, D., Jovanovic, J., Ebneter,… More

Kokona, D., Jovanovic, J., Ebneter, A., Zinkernagel, M. S. In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy. J. Vis. Exp. (129), e55984, doi:10.3791/55984 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter