Summary
פרוטוקול זה מתאר איך ברזולוציה גבוהה טכניקות הדמיה כגון טומוגרפיה אופטית קוהרנטית בתחום ספקטרלי, סריקת לייזר ophthalmoscopy יכול להיות מנוצל מכרסמים קטנים, באמצעות מערכת פלטפורמה אופטלמולוגיות הדמיה, כדי לקבל מידע על עובי רשתית, microglial תא הפצה, בהתאמה.
Abstract
טומוגרפיה אופטית קוהרנטית בתחום ספקטרלי (SD-אוקטובר) ו לייזר סריקה ophthalmoscopy (סלו) נמצאים בשימוש נרחב אופתלמולוגיה ניסיוני. בפרוטוקול הנוכחי, עכברים המבטאים ירוק (gfp) חלבון פלואורסצנטי תחת האמרגן של Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) שימשו כדי התמונה מיקרוגלייה תאים ויוו ברשתית. מיקרוגלייה מקרופאגים תושב של הרשתית, היו מעורבים מספר מחלות רשתית1,2,3,4,5,6. פרוטוקול זה מספקת גישה מפורטת לדור של B-הרשתית, עם SD-אוקטובר, הדמיה של התפלגות התא מיקרוגלייה בעכברים Cx3cr1gfp/gfp עם סלו ויוו, באמצעות מערכת פלטפורמה אופטלמולוגיות הדמיה. הפרוטוקול יכול לשמש במספר שורות העכבר הכתב. עם זאת, ישנן כמה מגבלות בפרוטוקול המוצג כאן. ראשית, סלו וגם SD-אוקטובר, כאשר נעשה שימוש במצב ברזולוציה גבוהה, איסוף הנתונים עם מפוח ברזולוציה גבוהה אבל הרזולוציה לרוחב הוא נמוך (מיקרומטר 3.5 ו- 6 מיקרומטר, בהתאמה). יתר על כן, רמת המיקוד ורוויה סלו תלויה מאוד מבחר פרמטר, יישור נכון של העין. בנוסף, באמצעות התקנים שנועדו עבור חולים אנושיים בעכברים הוא מאתגר עקב גבוה סך כל הכוח האופטי של העין העכבר לעומת העין האנושית; זה יכול להוביל לרוחב ההגדלה אי דיוקים7, אשר תלויים גם ההגדלה שהעדשה העכבר בין היתר. עם זאת, למרות הסורק צירית במצב הזה הוא תלוי הגדלה לרוחב, המדידות SD-אוקטובר צירית מדויק8.
Introduction
עיניים ניסיוני, בחינת פתולוגיה ברשתית מחושבת בדרך כלל באמצעות טכניקות היסטולוגית. עם זאת, היסטולוגיה דורש euthanization בעלי חיים, עלול לגרום שינוי במאפיינים בפועל של הרקמה. SD-אוקטובר, סלו נעשה שימוש באופן שגרתי עיניים קליניים למטרות אבחון ועל הפיקוח על מחלות רשתית מספר כגון בצקת מקולרית סוכרתית9, קדמית נוירופתיה אופטית איסכמי10או רטיניטיס פיגמנטוזה11 . SD-אוקטובר סלו טכניקות פולשני להפיק תמונות ברזולוציה גבוהה של הרשתית, אשר הם דמיינו דרך האישון מורחבים ללא התערבות נוספת בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. SD-אוקטובר מספק מידע של מבנה הרשתית ועובי הרשתית על ידי איסוף נתונים backscattering כדי ליצור תמונות חתך של הרשתית, בעוד סלו אוספת נתונים זריחה כדי להפיק תמונות חדות גבוהה סטריאוסקופי של הרשתית. כיום, בשתי הטכניקות משמשות יותר ויותר ניסיוני עיניים באמצעות מכרסמים קטנים12,13,14,15 (או אפילו דג זברה16,17) ויכול לספק גם מידע כמותיים12,17,18,19,20,21.
הצטברות של אנדוגני fluorophores כמו lipofuscins או היווצרות של drusen ברשתית, ניתן לאבחן על ידי סלו כמו האות פלורסנט אוטומטית. תכונה זו הופכת סלו טכניקה יקר עבור אבחון וניטור של מחלות רשתית כמו ניוון מקולרי הקשור לגיל או רטיניטיס פיגמנטוזה22,23. עיניים ניסיוני, זריחה אוטומטי הדמיה (AF) יכול לשמש עבור זיהוי סוגי תאים מסוים בקווים העכבר הכתב. לדוגמה, עכברים משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים עבור הביטוי של ה-gfp תחת האמרגן של Cx3cr124 הם יתרון עבור ויזואליזציה ויוו microglial תאים ברשתית נורמלי, החקירה של מיקרוגלייה/מקרופאג הדינמיקה של מחלות רשתית21. מיקרוגלייה הן המקרופאגים תושב של הרשתית, אשר לשחק תפקיד מכריע על הומאוסטזיס רקמות ותיקון רקמות על פציעה1,25,26. מיקרוגלייה הפעלת ב הרשתית דווחה פגיעה ברשתית, איסכמיה, ניוון, רומז תפקיד של תאים אלה מחלות רשתית2,3,4,5, 6.
מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא לתאר שיטה פשוטה יחסית עבור הדמיה ברשתית ומדידה של עובי הרשתית בעזרת SD-אוקטובר ועבור ויזואליזציה של תאים מיקרוגלייה חיובי gfp באמצעות העכבר Cx3cr1gfp/gfp רשתית סלו (היידלברג Spectralis HRA + OCT מערכת). פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל עבור מדידות הדמיה ועובי של הרשתית בריא או חולה בקווים העכבר שונים. בנוסף, ניתן לבצע ניתוחים morphometric עבור וכימות של מספרים מיקרוגלייה והפעלה מיקרוגלייה ברשתית באמצעות סלו21. מיקרוגלייה התאים קשורים עם מחלות ניווניות של מערכת העצבים המרכזית (CNS), כולל28,27,29הרשתית. כך, על ידי שילוב של שתי השיטות בשימוש בפרוטוקול הנוכחי, המתאם של מיקרוגלייה הפצה, ניוון הרשתית יכול להתבצע, אשר יכול להקל על חומרת המחלה ניטור או יעילות טיפולית גישות vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
בכל ההליכים, BALB/c למבוגרים זכר ונקבה של עכברים אקספרס gfp תחת האמרגן של Cx3cr1 היו בשימוש 24. עכברים טופלו על-פי ארוו שימוש בבעלי חיים של לרפואת עיניים ומחקר חזון ואושרו בכל ההליכים מהממשלה השוויצרי על פי הוראות השוויצרי הפדראלי על צער. עכברים היו ומורדמת באמצעות זריקה תת עורית של medetomidine הידרוכלוריד (0.75 מ ג/ק ג), קטמין (45 מ"ג/ק"ג). הרדמה. ראויה אושר ע י ניטור את קצב הנשימה ואת החיה ' s רפלקס נגד קמצוץ הזנב. בסוף הניסויים, עכברים היו מורדמים עם שאיפת 2 CO.
הערה: לבצע כל מושב הדמיה בהקדם האפשרי (מקסימום 20 דקות), מאז היווצרות קטרקט הרדמה הבאות עשויה לרסן ויזואליזציה ברשתית 30.
1. תצורת המערכת
- להפעיל את המחשב.
- הפעל את אספקת החשמל. ההודעה " מודול התחלה " יופיעו על המסך בלוח הבקרה של ההתקן.
- לחיצה כפולה על קיצור הדרך בשולחן העבודה כדי להפעיל את התוכנה של התוכנה-
- בתצוגה ' מסד נתונים ', לחץ " להוסיף החולה " סמל.
- בחלון מוקפץ, להוסיף כל המידע הנחוץ (שם משפחה, שם פרטי, כותרת, תאריך לידה, סקס, החולה-ID) ולחץ על " טוב ". על חלון פופ מוגדר עקמומיות הקרנית של 2 מ מ, לחץ על " טוב ".
- למקם עדשה מנורה רגיל חתוך ללא מגע אופטלמולוגיות 78D מול הראייה תקן 30 ° ותחברי אותו בבטחה עם קלטת.
- לוודא כי המנוף מסנן בצד השמאלי של המכשיר מוצב הסימן " A " כדי לאפשר IR + OCT והן AF הדמיה ( איור 1).
2. העכבר הכנה
- שימוש מנה הידרוכלוריד medetomidine של 0.75 mg/kg, קטמין מנה של 45 מ"ג/ק"ג ב באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS, pH 7.4) להכין פתרון הרדמה. לכן, בשביל עכבר 20 גרם, מערבבים 15 µL של medetomidine הידרוכלוריד עם 18 µL של קטמין לאמצעי הסופי של µL 50 ב- PBS. לאחסן את הפתרון ב 4 ° C עד לשבוע אחד.
- לתפוס את העכבר יתלה ולהחיל טיפה אחת של tropicamide 0.5% + phenylephrine הידרוכלוריד 2.5% על כל עין כדי להשיג נורמאליות.
- להשאיר את העכבר מאופקת, עם מזרק אינסולין קשורה מחט 30 גרם, להזריק µL 50 של הפתרון הרדמה subcutaneously. לשים את העכבר לכלוב הממוקמים מעל כרית החימום. יש להמתין 3-5 דקות עד העכבר הוא תרופות הרגעה. כדי להעריך את עומק הרדמה, לצבוט את הזנב של העכבר. בדוק את הקרנית על ידי נגיעה בעדינות את הקרנית העכבר באמצעות מקלון צמר גפן. אם אין רפלקס חיובי נצפית, המשך עם ההדמיה.
הערה: חשוב לעקוב אחר קצב נשימה במהלך הרדמה. אם העכבר הוא לא תחת תרופות הרגעה, קצב הנשימה יגדל על גירוי מכאיב. - מימה הקרנית עכבר עם יישום של 2% hydroxypropylmethylcellulose טיפות על כל עין.
3. SD-אוקטובר
- במקום תיקון ההתחממות של 32 ° C על פלטפורמת בהזמנה המצורפת במנוחה הסנטר של המכשיר ( איור 1).
- את תמונת עין ימין, מקם את העכבר על החלק השמאלי של פלטפורמת ( איור 1). להבטיח כי המסלול הנכון של העכבר פונה העדשה, הגוף שלו טמון שכיבה על החלק השמאלי של פלטפורמת ה-
- למרוח טיפה של hydroxypropylmethylcellulose על עין ימין ומקם בזהירות גז נוקשה +4 כוחן חדיר עדשות מגע על זה (כדורי כוח:-25.00 כדי +25.00 diopters). אחסן את עדשת המגע של תמיסת מלח מאוזנת (BSS). כדי לתפוס את העדשה, להשתמש מלקחיים פלסטיק או סיליקון כדי למנוע נזק.
- הקש על התיבה הצהובה בפינה הימנית בתצוגת לוח הבקרה כדי להפעיל את המודול רכישה (הקופסה הירוקה על איור 2A). התיבה הצהובה יפנו ירוק, ' מתפריט החלונית ' בקרה ' יופיע על המסך ( איור 2 א).
- עבור רכישת B סריקות, בחר את האפשרות IR + OCT בחלונית ' בקרה ' ( איור 2 א). הגדרות שנבחרו מסומנות בכחול על לוח הבקרה.
- בחר " רשתית " תחת " יישום, מבנה " התוכנה ואת מהלך העדשה לכיוון העין העכבר באמצעות את micromanipulator על המכשיר ( איור 1). לפני התמקדות על הרשתית, בדוק את הסימן " OD " נבחרה בחלק השמאלי התחתון של המסך. התוכנה מזהה באופן אוטומטי משמאל (OS), העין הימנית (OD) בהתבסס על המיקום של המטרה.
הערה: אם המטרה היא ממוצבת על האמצע של הפלטפורמה, הודעת שגיאה תופיע בתחתית המסך. במקרה כזה, ולמקם מחדש את העכבר מעט עד שהתוכנה מזהה את העין הנכונה. - עם הידית להתמקד, להתמקד על הרשתית עד כלי גדול נראים בבירור בתמונה הפונדוס בצד השמאל של מסך המחשב. להזיז את המצלמה על-ידי הפעלת את micromanipulator שמאלה או ימינה, כדי להעביר את המצלמה בכיוון הזה, או בכיוון השעון או נגד כיוון השעון, כדי להזיז את המצלמה למעלה או למטה, בהתאמה.
הערה: מיקום העכבר על הפלטפורמה או להזיז את העדשה כלפי מעלה או כלפי מטה כדי להשיג לוקליזציה המועדפת של ראש עצב הראייה בתמונה אינפרא-אדום. - סובב את רגישות נגד כיוון השעון כדי להפחית או בכיוון השעון, כדי להגדיל את הבהירות של התמונה הפונדוס. כאשר ההתמקדות אופטימלית היא מושגת, SD-OCT B-בסריקה יופיע בצד ימין של המסך.
הערה: אם B-הסריקה, לא ניתן לאבחן על ידי התאמת את המוקד, להקיש את הצירוף Ctrl + Alt + Shift + O במקלדת. בחלון הנפתח, התאם את הערך של הזרוע הפניה עד B-הסריקה מופיעה על המסך. - על החלק התחתון של המסך, בחר את הסריקה יחיד ' מתפריט ' תבנית (קו בודד באיור 2B).
- להפוך את micromanipulator של המכשיר ( איור 1), שמאלה, ימינה, קדימה או לאחור (כדי להפעיל את המצלמה בכיוון הזה) על מנת להבטיח כי הסריקה B ממוקם בין החלק העליון והחלק התחתון פינות של ה-SD-OCT לסרוק חלון.
- להגדיר את ערך בזמן אמת אוטומטיים (אמנות) לפחות 9 כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה-
הערה: אמנות משפר את איכות התמונה על-ידי חישוב ממוצע מספר סריקות רציפות. גבוה יותר " אמנות ", ערך, גבוה יותר את יחס אות לרעש ולכן איכות התמונה. עם זאת, על ידי הגדלת " אמנות " ערך, השלימה את רכישת זמן הוא גם גדל. - העיתונות " לרכוש " כפתור ( איור 2) על המסך בלוח הבקרה ולרכוש את התמונות.
- ולמקם מחדש את העכבר תמונה של עין שמאל, חזור על השלבים 3.2-3.12.
- להסיר את עדשות המגע עם פלסטיק/סיליקון מלקחיים ומניחים אותו לתוך BSS-
- מימה הקרנית עכבר עם טיפת טריים hydroxypropylmethylcellulose ולהסיר את העודפים עם נייר טישו.
- להסיר את הראייה תקן 30 מעלות על-ידי סיבוב נגד כיוון השעון.
- הר העדשה 55 ° וחזור על שלבים 3.4-3.12 עבור כל עין.
4. אוטומטי פלורסצנטיות הדמיה
- מבלי להזיז את העכבר על הרציף, בחר IR בלוח הבקרה.
- עם הידית להתמקד, להתמקד בכלי הדם ברשתית גדול.
- בלוח הבקרה בחר AF.
- סובב את רגישות נגד כיוון השעון כדי להפחית או בכיוון השעון, כדי להגדיל את הבהירות של התמונה.
- להקיש על כפתור רגישות ולהגדיר " אמנות " ערך לתמונות 67 או יותר כדי לקבל איכות גבוהה-
- כאשר ערכת " אמנות " ערך הגיעה, הקש " לרכוש " בלוח הבקרה כדי לרכוש את התמונה. להקיש על כפתור רגישות שוב להפסיק בממוצע. להתאים את המוקד, לדמיין שכבות הרשתית שונות.
- להסיר את העדשה 55° והר העדשה 102 מעלות שדה רחב. בצע שלבים 4.1 – 4.6 בשתי העיניים של כל עכבר ועבור כל עכבר.
- לחץ “ לשמור תמונות ” בגבול העליון השמאלי של החלון ולאחר מכן לחץ על “ יציאה ”. כדי לשמור את התמונות במחשב, בחר את העכבר מתוך הרשימה החלק הימני של המסך על ידי לחיצה כפולה על שם העכבר. לחץ פעמיים על כל תמונה בנפרד ולאחר מכן לחץ על סמל התקליטור תקליטונים. לשמור את התמונה כקובץ. tif,. bmp,. jpg או. png על התיקיה הרצויה. כדי לצאת העיתונות תוכנה “ קובץ ” ו “ יציאה ”.
5. היפוך הרדמה
- מימה עם טיפה אחת של hydroxypropylmethylcellulose העיניים העכבר ולהחזיר את העכבר על משטח חימום.
- פתרון atipamezole להכין מנה של 2.25 מ"ג/ק"ג להיפוך ההשפעות הרגעה של medetomidine הידרוכלוריד. עכבר 20 גרם, להוסיף µL 9 של atipamezol נפח סופי של 150 µL PBS. לאחסן את הפתרון ב 4 ° C עד לשבוע אחד.
- דקות לאחר ההזרקה בהרדמה (שלב 2.2), להזריק 150 µL של פתרון atipamezole subcutaneously.
- לפקח על העכבר עד ההתאוששות מן ההרדמה. כאשר העכבר הוא התאושש באופן מלא (5-10 דקות לאחר ההזרקה atipamezole) להחזיר אותו בכלוב. שחזור שציין את היכולת של החיה כדי להפעיל את הגוף שלו הניח בצד אחד, החזרת של הליכה פעילות, ומגיבים בתגובה לגירוי סביבתי-
6. מדידת עובי הרשתית ידנית מתמונות SD-אוקטובר
- לפתוח את הסריקה OCT על ידי לחיצה כפולה על השם של החיה.
- פתח ב'-הסריקה שהושג עם העדשה 30 מעלות או 55 °-
- בחר " עובי הפרופיל ".
- העיתונות " לערוך שכבה Segmentations " סמל ( איור 2B). התוכנה באופן אוטומטי מזהה את הגבלת הפנימי, לבסס את הממברנה.
- במידת הצורך, לתקן באופן ידני את המיקום של הגבלת הפנימי לבסס ממברנה. לשם כך, בחר את השכבה כדי להיות שונה מהצד השמאלי של המסך ולאחר מכן באפשרות עיגול אדום ( איור 2B). להזיז העיגול עם לחצן העכבר לחוץ כדי לשנות את הקו-
- לשנות את הקו כדי למקם את השכבה המתאימה בצורה נכונה. לחץ על " שמור וסגור " כדי לצאת מהחלון.
הערה: בשל השתקפות של דמית, התוכנה עשויה לזהות את קרום הבסיס באופן שגוי. לכן, עדיף להגדיר את זה באופן ידני לפני שתמשיך עובי הרשתית למדידות. - בחר " רשתית " תחת " שכבה " אפשרות. דיאגרמה של עובי הרשתית יופיע בתחתית המסך.
- לחץ על עמדה שונה הדיאגרמה או על B-scan כדי להציג את עובי הרשתית (מסומן במיקרומטר) עבור המיקום שנבחר.
- למדוד את עובי רשתית בהמרחק הרצוי בין ראש עצב הראייה, להעתיק את הערכים בגיליון.
- חזור על השלבים 5.1-5.9 עבור כל בעכבר על 30 מעלות והן את העדשה 55 °-
- לבצע ניתוח סטטיסטי בתוכנה הרצויה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות פרוטוקול המובאת כאן, SD-אוקטובר ואבחון סלו תמונות התקבלו Cx3cr1gfp/gfp עכברים במהלך אותה הפעלה של הדמיה. איור 3 כולל SD נציג-סריקות יחיד שהושג עם 30 מעלות או עדשה 55 ° (איור 3 א) ותמונות סלו נציג שהושג עם 55 ° או עדשה 102 °, איפה הם דמיינו gfp מיקרוגלייה חיובי תאים OCT. השתקפות גבוהה יותר של דמית נצפית ב- SD-OCT סריקות שהושג עם 30 מעלות בהשוואה העדשה 55 °. עם זאת, ארכיטקטורת הרשתית ברור של 30 מעלות והן את התמונות 55 ° (איור 3, תמונות בהגדלה נכון). לאחר תיקונים ידניים של גבולות ברשתית (הגבלת הפנימי לבסס קרום), התאמה טובה של מדידות עובי הרשתית נצפתה בין העדשה 55 ° 30 o כאשר מודדים את המרחק אותו מן ראש עצב הראייה ( איור 3C; מתאם פירסון = 0.967, p < 0.0001). מחקרים קודמים הראו כי המידות עובי הרשתית SD-אוקטובר סריקות לתאם עם מדידות ex-vivo על מקטעי רשתית היסטולוגית15,31 ובכך SD-אוקטובר יכול לשמש שיטה לא פולשנית עבור מדידות עובי הרשתית. באמצעות סלו, נוכל לזהות תאים מיקרוגלייה חיובי gfp כמו האות hyperreflective של תמונות פלורסנט אוטומטי, אולם העדשה 102 מעלות שדה רחב היה מסוגל לכסות את אזור הפונדוס גדול יותר לעומת העדשה 55 °. סלו גם יכול להיות מנוצל עבור בקרה של חלוקת תאים ברשתית מיקרוגלייה והפעלה בעכברים כתב עם קולטן fractalkine תפקודית (Cx3cr1gfp / + עכברים) רשתית רגיל או חולה12, 21,32. השילוב של SD-אוקטובר עם סלו באותה הפעלת הדמיה יכול לספק מידע על הפצה מיקרוגלייה והפעלה על ניוון הרשתית, עשוי להיות שימושי עבור ניטור מחלות רשתית עכברים21.
איור 1: תמונת הנציגה של המכשיר השתמשו במחקר הנוכחי- את תמונת עין ימין של העכבר, כשהעכבר ממוקם על החלק השמאלי של פלטפורמת בהזמנה אישית במסלול הנכון שלה מול העדשה והגוף שלה משקר נוטה על החלק השמאלי של הפלטפורמה. הגובה של פלטפורמת יכול להיות מותאם על-ידי סיבוב עם כיוון השעון (כדי להוריד את הפלטפורמה) או נגד כיוון השעון (להרים את הפלטפורמה) "ההתאמה הסנטר מנוחה". להיות ממוקם המנוף מסנן כדי "A" כדי לאפשר הדמיה IR + OCT ו AF. עם הידית מיקוד (לא גלוי על הדמות), הנסיין יכול לשנות את המיקוד של הסורק. Micromanipulator יכול לשמש כדי להאיר כהלכה וליישר הרשתית לתמונות באיכות גבוהה. המטרה יכול להיות עברה למעלה, למטה, נכון או שהותירו את הידית המצלמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: איור של לוח הבקרה של ההתקן. (א) על החלק השמאלי בתצוגת לוח הבקרה ניתן לבחור מצבי רכישה (אינפרא אדום, אינפרא-אדום; אוטומטי פלורסצנטיות, AF או indocyanine ירוק מסתמים, ICGA; משולב או לא עם טומוגרפיה אופטית קוהרנטית, OCT). על החלק האמצעי של הלוח ההגדרה רכישה יכולה להיבחר (עוצמת הסריקות אם התמונה, המקטע או אמצעי אחסון). שדה הראיה נקבעת על ידי העדשה טעון. עם הידית רגישות ניתן לכוונן את הבהירות של התמונה IR או AF. על ידי לחיצה על הידית רגישות, התוכנה תתחיל בממוצע את התמונות ב IR או AF מספקים תמונה באיכות גבוהה. (B) איור של התפריט תבנית רכישה. (ג) סיכום של פונקציות המשמשים את התוכנה עם הסמל המתאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: OCT סריקות ועם אוטומטי תמונות פלורסנט של רשתית העכבר Cx3cr1gfp/gfp . (א) B סריקות של הרשתית העכבר שהושג עם 55 ° (החלונית העליונה) או 30 מעלות העדשה (פאנל התחתונה). הגדלה גבוהה יותר מתיבות צהוב מוצגים בלוח השמאלי. (B) תמונות של תאים מיקרוגלייה חיובי gfp באדמומיות של עכברים Cx3cr1gfp/gfp שהושג עם 55 ° ו 102 ° עדשה (שמאל וימין פאנלים, בהתאמה). מדידות עובי הרשתית (C), הנמדד על המרחק אותו ראש עצב הראייה, על סריקות SD-אוקטובר נגזר מן העדשה 30 ° ו 55 °. מתאם טוב נצפתה בין שתי עדשות (מתאם פירסון = 0.967). גודל ברים: מיקרומטר 200, 100 מיקרומטר בתמונות SD-אוקטובר מוגדל (לוח, נכון). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המאמר הנוכחי מדגים פרוטוקול עבור הרכישה של הרשתית B והדמיה של הפצה חיובית מיקרוגלייה gfp ברשתית העכבר במהלך אותה הפעלה של הדמיה. SD-אוקטובר, סלו משמשים יותר ויותר במודלים חייתיים של מחלות רשתית לספק מידע של שינויים ברשתית מעל הזמן10,14,17,18,21. עם פרוטוקול זה, Cx3cr1gfp/gfp או Cx3cr1gfp / + רשתית העכבר יכול לדימות לא-פולשנית, ניתן לקבל מידע של עובי הרשתית. דבר זה חשוב במיוחד במודלים ניסיוני מחלות רשתית, שבו חומרת המחלה משתנה לאורך זמן, או כאשר טיפולי נבדקים. יתר על כן, הפרוטוקול מתאר איך כתב קווים העכבר יכול להיות מנוצל עבור ההדמיה ויוו פלואורסצנט תאים ברשתית.
עם זאת, פרוטוקול המוצג כאן יש מספר מגבלות. ראשית, הדמיה של הרשתית העכבר בהתקנים שנועדו עבור בני אדם עשויים להיות מאתגר עקב גבוה סך כל הכוח האופטי של העין העכבר, אשר יכול להוביל לרוחב ההגדלה אי דיוקים7. עם זאת, המדידות SD-אוקטובר צירית הם מדויקים8. בנוסף, בחינת המשך טיפול בעכברים באמצעות האפשרות "הגדר הפניה" של התוכנה קשה למדי בשל המיקום לא קבועה של העכבר על הפלטפורמה, ובכך הדמיה האורך של רשתית העכבר יכול להיות מאתגר. יישור האורך של העין יכולה להיות מושגת על ידי מיצוב עצב הראייה במרכז של תמונת אינפרא-אדום ורכישת ואז התמונות הרצויות. על מנת לתקן עבור סיבוב העין, במערכים ידנית של תמונות פנים en SD-אוקטובר יכול להתבצע לאחר רכישת ולהחיל על המדידות עובי כמתואר33. מלבד מערכת הדמיה בשימוש בפרוטוקול הנוכחי, מערכות הדמיה אחרות גם פותחו לספק זווית גדולה יותר, יכולים ליצור תמונות אזור ברשתית גדול יותר ללא שימוש עדשות מגע. לדוגמה Optos יכול לכסות משטח הרשתית גדול יותר אך עם השתנות תמונה גדולה יותר לעומת המכשיר בשימוש בהווה ללמוד34. למרות מגבלות אלו, בפרוטוקול הנוכחי יכול להיות מנוצל במספר דגמים ניסיוני של מחלות רשתית. המידע שניתן להשיג כולל שינויים עובי הרשתית (נפיחות, אטרופיה), זיהוי של הרשתיות או הנוכחות של hyperreflective נקודות, התווית על-ידי fluorophore תאים ולהגדיל או להקטין את מספרם.
שילוב של שתי השיטות בעכברים משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים עבור הביטוי של Cx3cr1 (Cx3cr1gfp / +), אשר יש קולטן fractalkine תפקודית, מאפשר הנסיין לאתר בו זמנית אין ויוו שינויים של שלמות רשתית בזמן אמיתי, אפשרי מיקרוגלייה הצטברות בסביבה רשתית חריגות (למשל, רשתית נפיחות, ניוון רשתית) במהלך מחלות רשתית או פציעה. יתר על כן, על-ידי החלת ניתוח morphometric, מצב הפעלה מיקרוגלייה יכול להידרש בהתבסס על גודל סומא ומעבד המורכבות מיקרוגלייה21. מחלות רשתית, כגון סגר וריד רשתית, הפעלת והצטברות של מיקרוגלייה/מקרופאגים באתרי מנוונת ברשתית נצפו27. יתר על כן, בעכברים פגומים של הגן Nr2e3 (גרעיני קולטן של 2 קבוצה E חבר 3), דגם העכבר של recessively בירושה משופרת תסמונת רגישות S-חרוט (ESCS), השכבה החיצונית גרעיני קיפול (רוזטות) יכול להיות שנצפו בבית מוקדם ימים לאחר הלידה.
מעניין, תאים מיקרוגלייה להימצא בתוך רוזטות, הוצע שמיקרוגלייה הזה עשוי לתרום התנוונות photoreceptors נצפתה באדמומיות של אלה עכברים35,36. מאז הפעלת מיקרוגלייה היו מעורבים במהלך מגוון רחב של מחלות רשתית, ולעיתים מלווה שינויים ברשתית אדריכלות10,27,37,38 , השילוב של SD-אוקטובר סלו יכול לחשוף מתאמים בין הפעלת מיקרוגלייה ניוון הרשתית. למרות כמה אתגרים, בפרוטוקול הנוכחי יכול לספק מידע כגון longitudinally, וכך זה יהיה יקר עבור המתאם של פגיעה ברשתית עם מיקרוגלייה הפצה/הפעלה, הפיקוח על טיפולית יעילות21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק של השוויצרי הקרן הלאומית למדע (SNSF; #320030_156019). המחברים קיבל תמיכה nonfinancial GmBH הנדסה היידלברג, גרמניה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spectralis Imaging system (HRA+OCT) | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | ophthalmic imaging platform system |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | Version 1.9.13.0 |
| 78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lens | Volk Optical Inc., Ohio, USA | V78C | |
| Spectralis wide angle 55° lens | Heidelberg Engineering, Germany | 50897-002 | |
| ultra widefield 102° lens | Heidelberg Engineering, Germany | 50117-001 | |
| medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor) | Provet AG, Lyssach, Switzerland | Swissmedic Nr. 50'590 - ATCvet: QN05CM91 | anesthetic/analgesic |
| ketamine 50mg/ml (Ketalar) | Parke-Davis, Zurich, Switzerland | 72276388 | anesthetic |
| tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix) | ISPI, Bern, Switzerland | N/A | pupil dilation |
| Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mm | B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Straße, Germany | 9151125 | |
| hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%) | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | N/A | |
| +4 dpt rigid gas permeable contact lens | Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY | N/A | Base Curve: 7.20 to 8.40 mm Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm Power: -25.00 to +25.00 Diopters |
| balanced salt solution (BSS) | Inselspital, Bern, Switzerland | N/A | |
| silicon forceps | N/A | N/A | |
| atipamezole 5 mg/mL (Antisedan) | Provet AG, Lyssach, Switzerland | N/A | α2 adrenergic receptor antagonist |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA | N/A | statistical analysis software |
References
- Madeira, M. H., Boia, R., Santos, P. F., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Contribution of microglia-mediated neuroinflammation to retinal degenerative diseases. Mediators Inflamm. , 673090 (2015).
- Ng, T. F., Streilein, J. W. Light-induced migration of retinal microglia into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (13), 3301-3310 (2001).
- Langmann, T.
- Joly, S., et al. Cooperative phagocytes: resident microglia and bone marrow immigrants remove dead photoreceptors in retinal lesions. Am J Pathol. 174 (6), 2310-2323 (2009).
- Arroba, A. I., Alvarez-Lindo, N., van Rooijen, N., de la Rosa, E. J. Microglia-mediated IGF-I neuroprotection in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (12), 9124-9130 (2011).
- Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Exp Eye Res. 81 (6), 700-709 (2005).
- Geng, Y., et al.
- Lozano, D. C., Twa, M. D. Development of a rat schematic eye from in vivo biometry and the correction of lateral magnification in SD-OCT imaging. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6446-6455 (2013).
- Vaz-Pereira, S., et al. Optical Coherence Tomography Features Of Active And Inactive Retinal Neovascularization In Proliferative Diabetic Retinopathy. Retina. 36 (6), 1132-1142 (2016).
- Kokona, D., Haner, N. U., Ebneter, A., Zinkernagel, M. S. Imaging of macrophage dynamics with optical coherence tomography in anterior ischemic optic neuropathy. Exp Eye Res. , (2016).
- Makiyama, Y., et al. Macular cone abnormalities in retinitis pigmentosa with preserved central vision using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. PLoS One. 8 (11), e79447 (2013).
- Paques, M., et al. High resolution fundus imaging by confocal scanning laser ophthalmoscopy in the mouse. Vision Res. 46 (8-9), 1336-1345 (2006).
- Joshi, R., et al. Spontaneously occurring fundus findings observed using confocal scanning laser ophthalmoscopy in wild type Sprague Dawley rats. Regul Toxicol Pharmacol. 77, 160-166 (2016).
- Muraoka, Y., et al. Real-time imaging of rabbit retina with retinal degeneration by using spectral-domain optical coherence tomography. PLoS One. 7 (4), e36135 (2012).
- Fischer, M. D., et al. Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography. PLoS One. 4 (10), e7507 (2009).
- Bell, B. A., et al. Retinal vasculature of adult zebrafish: in vivo imaging using confocal scanning laser ophthalmoscopy. Exp Eye Res. 129, 107-118 (2014).
- Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
- Huber, G., et al. Spectral domain optical coherence tomography in mouse models of retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5888-5895 (2009).
- Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative Analysis of Mouse Retinal Layers Using Automated Segmentation of Spectral Domain Optical Coherence Tomography Images. Transl Vis Sci Technol. 4 (4), 9 (2015).
- Sim, D. A., et al. A simple method for in vivo labelling of infiltrating leukocytes in the mouse retina using indocyanine green dye. Dis Model Mech. 8 (11), 1479-1487 (2015).
- Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma. J Vis Exp. (99), e52731 (2015).
- Acton, J. H., Cubbidge, R. P., King, H., Galsworthy, P., Gibson, J. M. Drusen detection in retro-mode imaging by a scanning laser ophthalmoscope. Acta Ophthalmol. 89 (5), e404-e411 (2011).
- Greenstein, V. C., et al. Structural and functional changes associated with normal and abnormal fundus autofluorescence in patients with retinitis pigmentosa. Retina. 32 (2), 349-357 (2012).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Wang, X., et al. Requirement for Microglia for the Maintenance of Synaptic Function and Integrity in the Mature Retina. J Neurosci. 36 (9), 2827-2842 (2016).
- Ebneter, A., Casson, R. J., Wood, J. P., Chidlow, G. Microglial activation in the visual pathway in experimental glaucoma: spatiotemporal characterization and correlation with axonal injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (12), 6448-6460 (2010).
- Ebneter, A., Kokona, D., Schneider, N., Zinkernagel, M. S. Microglia Activation and Recruitment of Circulating Macrophages During Ischemic Experimental Branch Retinal Vein Occlusion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 944-953 (2017).
- Lin, Y. L., Potter-Baker, K. A. Using theoretical models from adult stroke recovery to improve use of non-invasive brain stimulation for children with congenital hemiparesis. J Neurophysiol. , (2017).
- Combadiere, C., et al. CX3CR1-dependent subretinal microglia cell accumulation is associated with cardinal features of age-related macular degeneration. J Clin Invest. 117 (10), 2920-2928 (2007).
- Bermudez, M. A., et al. Time course of cold cataract development in anesthetized mice. Curr Eye Res. 36 (3), 278-284 (2011).
- Toth, C. A., et al. A comparison of retinal morphology viewed by optical coherence tomography and by light microscopy. Arch Ophthalmol. 115 (11), 1425-1428 (1997).
- Ebneter, A., Kokona, D., Jovanovic, J., Zinkernagel, M. S. Dramatic Effect of Oral CSF-1R Kinase Inhibitor on Retinal Microglia Revealed by In Vivo Scanning Laser Ophthalmoscopy. Transl Vis Sci Technol. 6 (2), 10 (2017).
- Gabriele, M. L., et al. Reproducibility of spectral-domain optical coherence tomography total retinal thickness measurements in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (12), 6519-6523 (2010).
- Nakao, S., et al. Wide-field laser ophthalmoscopy for mice: a novel evaluation system for retinal/choroidal angiogenesis in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5288-5293 (2013).
- Wang, N. K., et al. Origin of fundus hyperautofluorescent spots and their role in retinal degeneration in a mouse model of Goldmann-Favre syndrome. Dis Model Mech. 6 (5), 1113-1122 (2013).
- Wang, N. K., et al. Cellular origin of fundus autofluorescence in patients and mice with a defective NR2E3 gene. Br J Ophthalmol. 93 (9), 1234-1240 (2009).
- Thanos, S. Sick photoreceptors attract activated microglia from the ganglion cell layer: a model to study the inflammatory cascades in rats with inherited retinal dystrophy. Brain Res. 588 (1), 21-28 (1992).
- Hughes, E. H., et al. Generation of activated sialoadhesin-positive microglia during retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (5), 2229-2234 (2003).
