Summary
Dit protocol beschrijft hoe hoge resolutie beeldvormende technieken zoals spectrale domein optische coherentie tomografie en scannen van laser ophthalmoscopy kan worden gebruikt in kleine knaagdieren, met behulp van een oogheelkundige imaging platform systeem, om informatie te verkrijgen over netvlies dikte en microglial cel distributie, respectievelijk.
Abstract
Spectrale domein optische coherentie tomografie (SD-OCT) en scannen laser ophthalmoscopy (SLO) worden uitgebreid gebruikt in experimentele oogheelkunde. In het huidige protocol, muizen uiten groen fluorescente proteïne (gfp) onder de promotor van Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) werden gebruikt om het imago microglia cellen in vivo in het netvlies. Microglia zijn verblijfplaats macrofagen van het netvlies en zijn betrokken bij verschillende retinale ziekten1,2,3,4,5,6. Dit protocol biedt een gedetailleerde aanpak voor generatie van retinale B-scans, met SD-OCT en beeldvorming van microglia cel distributie in Cx3cr1gfp/gfp muizen met SLO in vivo, met behulp van een oogheelkundige imaging platform systeem. Het protocol kan worden gebruikt in verscheidene verslaggever muis lijnen. Er zijn echter enkele beperkingen bij het protocol hier gepresenteerd. Ten eerste, SLO én SD-OCT, wanneer gebruikt in de modus hoge resolutie verzamelen van gegevens met hoge axiale resolutie maar de laterale resolutie is lager (3,5 µm en 6 µm, respectievelijk). De focus en intensiteit niveau in SLO is bovendien sterk afhankelijk van de parameter selectie en de juiste uitlijning van het oog. Bovendien, met behulp van de inrichtingen die zijn ontworpen voor menselijke patiënten in muizen is uitdagend als gevolg van de hogere totale optische macht van het oog van de muis ten opzichte van het menselijk oog; Dit kan leiden tot het lateraal vergroting onnauwkeurigheden7, die zijn ook afhankelijk van de vergroting door de lens van de muis onder anderen. Echter, ondanks dat de axiale scan standpunt is afhankelijk van de laterale vergroting, de axiale SD-OCT-metingen zijn nauwkeurige8.
Introduction
In experimentele oogheelkunde, wordt behandeling van retinale pathologie meestal geëvalueerd met histologische technieken. Echter, histologie dierlijke euthanization vereist en kan leiden tot wijziging van de werkelijke eigenschappen van het weefsel. SD-OCT en SLO worden routinematig gebruikt in klinische oogheelkunde voor diagnostische doeleinden en voor het toezicht van verschillende retinale ziekten zoals diabetische macula oedeem9, anterieure ischemische optische neuropathie10of retinitis pigmentosa11 . SD-OCT en SLO zijn niet-invasieve technieken die het genereren van hoge resolutie beelden van het netvlies, die worden gevisualiseerd door de verwijde pupil zonder verdere tussenkomst. SD-OCT biedt informatie van het netvlies structuur en de dikte van het netvlies door backscattering gegevens verzamelt om te maken van transversale beelden van het netvlies, terwijl SLO verzamelt fluorescentie gegevens om te produceren van stereoscopische hoge-contrast beelden van het netvlies. Tegenwoordig, beide technieken worden steeds vaker gebruikt in experimentele oogheelkunde met kleine knaagdieren12,13,14,15 (of zelfs zebrafish16,17) en kan bieden beide kwalitatieve en kwantitatieve informatie12,17,18,19,20,21.
Accumulatie van endogene fluorophores zoals lipofuscins of de vorming van drusen in het netvlies kan worden gevisualiseerd door SLO als auto fluorescent signaal. Deze functie maakt SLO een waardevolle techniek voor diagnose en bewaking van retinale ziekten zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie of retinitis pigmentosa22,23. In experimentele oogheelkunde, kan auto fluorescentie imaging (AF) worden gebruikt voor het opsporen van specifieke celtypes in verslaggever muis lijnen. Bijvoorbeeld zijn muizen heterozygoot voor de uitdrukking van gfp onder de promotor van Cx3cr124 voordelig voor in vivo visualisatie van microglial cellen in de normale retina en voor het onderzoek van microglia/macrofaag dynamiek in netvlies ziekte21. Microglia zijn de ingezetene macrofagen van het netvlies, die een cruciale rol spelen op de weefsel homeostase en weefselherstel na verwonding1,25,26. Microglia activering in het netvlies is gemeld in netvlies letsel, ischemie en degeneratie, suggereren een rol van deze cellen in het netvlies ziekte2,3,4,5, 6.
Het doel van dit protocol is voor het beschrijven van een relatief eenvoudige methode voor retinale beeldvorming en meting van retinale dikte met SD-OCT en visualisatie van gfp positieve microglia cellen in het Cx3cr1gfp/gfp muis netvlies met SLO (Heidelberg Spectralis HRA + OCT systeem). Dit protocol kan worden gebruikt voor beeldvorming en dikte metingen van gezonde of zieke netvlies in verschillende lijnen van de muis. Daarnaast kunnen Morfometrische analyses worden uitgevoerd voor de identificatie en kwantificering van microglia nummers en microglia activering in de retina met behulp van SLO21. Microglia cellen worden geassocieerd met degeneratieve ziekten in het centrale zenuwstelsel (CNS), met inbegrip van het netvlies27,28,29. Dus, door het combineren van de twee methoden die worden gebruikt in het huidige protocol, correlatie van microglia distributie en Retina degeneratie kan worden gemaakt, die kan vergemakkelijken toezicht ernst van de ziekte of de doeltreffendheid van therapeutische benaderingen in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
in alle procedures, waren de BALB/c volwassen mannelijke en vrouwelijke muizen die express gfp onder de promotor van Cx3cr1 gebruikte 24. Muizen werden behandeld volgens de ARVO verklaring voor het gebruik van dieren in Ophthalmic en visie onderzoek en alle procedures goedgekeurd van de Zwitserse regering volgens de federale Zwitserse verordeningen inzake het welzijn van dieren. Muizen zijn verdoofd door een subcutane injectie van medetomidine hydrochloride (0,75 mg/kg) en ketamine (45 mg/kg). Goede verdoving werd bevestigd door de controle op de luchtwegen en het dier ' s reflex tegen een snuifje van de staart. Aan het eind van de experimenten, waren muizen euthanized met CO 2 inademing.
Opmerking: uitvoeren van elke imaging sessie zo spoedig mogelijk (maximaal 20 min), sinds de vorming van staar volgende anesthesie kan belemmeren retinale visualisatie 30.
1. systeemconfiguratie
- de computer aanzet.
- Inschakelen met de voeding. Het bericht " Start acquisitie module " verschijnt op het apparaat control panel scherm.
- Tweemaal klikken op de snelkoppeling op het bureaublad van de software om de software in werking stellen.
- De weergave van de database, klik op de " toevoegen patiënt " pictogram.
- Invoegen in het pop-upvenster, alle nodige informatie (achternaam, voornaam, titel, geboortedatum, geslacht, en patiënt-ID) en klik op " ok ". De pop venster ingesteld van de kromming van het hoornvlies op 2 mm en klik op " ok ".
- Plaatst u een 78D standaard ophthalmic contactloze gleuf lamp lens voor de standaard 30 ° optiek en zet het veilig vast met tape.
- Ervoor te zorgen dat de hendel van de filter aan de linkerkant van het apparaat is gepositioneerd op de vermelding " A " dat zowel IR + OCT en AF imaging ( Figuur 1).
2. Voorbereiding van de muis
- gebruik een medetomidine hydrochloride dosis van 0,75 mg/kg en een ketamine dosis van 45 mg/kg in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7.4) ter voorbereiding van de verdoving oplossing. Dus, voor een muis-20 g, meng 15 µL van medetomidine hydrochloride met 18 µL van ketamine tot een eindvolume van 50 µL in PBS. Opslaan van de oplossing bij 4 ° C gedurende maximaal één week.
- Begrijpen de muis door de scruff en één druppel van tropicamide 0,5% + phenylephrine hydrochloride 2,5% toe te passen op elk van beide ogen om de leerling dilatatie.
- Houden van de muis ingetogen en injecteren met een insuline spuit gekoppeld aan een naald 30G, 50 µL van de verdoving oplossing subcutaan. Zet de muis terug in zijn kooi dat wordt geplaatst boven een verwarming pad. 3-5 min wachten totdat de muis is volledig verdoofd. Knijpen om te beoordelen verdoving diepte, de staart van de muis. Controleer de cornea reflex door het hoornvlies muis met een wattenstaafje zachtjes aan te raken. Als geen positieve reflex wordt waargenomen, gaat u verder met de beeldvorming.
Opmerking: Het is belangrijk om de ademhaling te controleren tijdens de anesthesie. Als de muis is niet volledig verdoofd, de luchtwegen tarief zal toenemen op een pijnlijke stimulus. - Hydraat het hoornvlies muis met een toepassing van 2% hydroxypropylmethylcellulose druppels op elk oog.
3. SD-OCT
- een verwarmende patch van ongeveer 32 ° C plaats op de op maat gemaakte platform aangesloten op het apparaat de kin rest ( Figuur 1).
- Om het imago van het rechteroog, plaatst u de muisaanwijzer op het linker gedeelte van het platform ( Figuur 1). Ervoor zorgen dat de juiste baan van de muis wordt geconfronteerd met de lens en haar lichaam gevoelig op het linker gedeelte van het platform ligt.
- Breng een druppel hydroxypropylmethylcellulose op het rechteroog en plaats een + 4 dioptrie rigide gas permeabele contactlens op het (sferische macht:-25.00 naar +25.00 dioptrieën). De contactlens in evenwichtige zoutoplossing (BSS) opslaan. Om te grijpen de lens, plastic of siliconen pincet gebruiken om schade te voorkomen.
- Druk op het gele vak op de rechterhoek van het beeldscherm van de controle om te beginnen de acquisitie module (groene doos op figuur 2A). Het gele vak zal groen worden en het menu van het regelpaneel verschijnt op het scherm ( figuur 2A).
- Voor verwerving van B-scans, selecteer de optie IR + OCT op het bedieningspaneel ( figuur 2A). Geselecteerde instellingen worden gemarkeerd in blauw op het bedieningspaneel.
- Selecteer " netvlies " onder " toepassing en structuur " in de software en verplaats de lens naar het oog van de muis met behulp van de micromanipulator op het apparaat ( Figuur 1). Alvorens zich te concentreren op het netvlies, Controleer of de vermelding " OD " is geselecteerd op het linker onderste deel van het scherm. De software identificeert automatisch de links (OS) en het rechter oog (OD) op basis van de positie van het doel.
Opmerking: Als het doel is geplaatst in het midden van het platform, zal een foutbericht verschijnen aan de onderkant van het scherm. In dat geval opnieuw plaatst u de muis enigszins totdat de software het juiste oog herkent. - Met de knop van de focus, focus op het netvlies totdat de grote schepen duidelijk te in de maagwand afbeelding aan de linkerkant van het computerscherm zien zijn. Beweeg de camera door te draaien aan de micromanipulator links of rechts, naar de camera te verplaatsen in die richting, of rechtsom of linksom, te verplaatsen van de camera omhoog of omlaag, naar respectievelijk.
Opmerking: Het verplaatsen van de muis op het platform of verplaats de lens naar boven of beneden om de gewenste lokalisatie van het hoofd van de oogzenuw in de infraroodafbeelding. - Draai de gevoeligheid knop linksom te verminderen of te verhogen van de helderheid van het beeld van de fundus met de klok mee. Wanneer optimale focus is bereikt, een SD-OCT B-scan aan de rechterkant van het scherm worden weergegeven.
Opmerking: Als de B-scan kan niet worden gevisualiseerd door de focus aan te passen, druk de combinatie Ctrl + Alt + Shift + O op het toetsenbord. In het pop-upvenster, past u de waarde voor de arm van de verwijzing tot de B-scan op het scherm verschijnt. - Op het bodemrecht van het scherm, kies het één scan in het patroon menu (één regel in figuur 2B).
- De micromanipulator van het apparaat ( Figuur 1) draaien links, rechts, naar voren of achteren (om te Draai de camera in die richting) om ervoor te zorgen dat de B-scan tussen de bovenste en onderste ligt hoeken van de SD-OCT scan venster.
- Stelt u de waarde van automatische Real-Time (kunst) tot en met ten minste 9 te verkrijgen van hoge kwaliteitsbeelden.
Opmerking: ART verbetert beeldkwaliteit door het gemiddeld aantal achtereenvolgende scans. Hoe hoger de " ART " waarde, hoe hoger de signaal-/ ruisverhouding en daarmee de beeldkwaliteit. Echter, doordat de " ART " waarde, het verwerven van de tijd wordt eveneens vergroot. - Druk op de " verwerven " ( Figuur 2) op het controle paneel scherm knop en het verwerven van de beelden.
- Opnieuw plaatst u de muis naar de afbeelding van het linkeroog en herhaal stappen 3.2-3.12.
- Verwijderen van de contactlens met kunststof/silicon pincet en leg deze in BSS.
- Het hoornvlies muis met een verse druppel hydroxypropylmethylcellulose hydrateren en verwijder de overmaat met een papieren zakdoekje.
- De standaard 30 ° optiek verwijderen door deze te draaien in tegenwijzerzin.
- De 55 ° lens mount en herhaal stappen 3.4-3.12 voor elk oog.
4. Auto fluorescentie Imaging
- zonder de muis te bewegen op het platform, IR te selecteren in het regelpaneel.
- Met de focus knop, concentreren op de grote retinale vaartuigen.
- Op het bedieningspaneel selecteren AF.
- Draai de gevoeligheid knop linksom te verminderen of rechtsom te verhogen van de helderheid van het beeld.
- Druk op de knop van de gevoeligheid en stel de " ART " waarde aan 67 of meer te verkrijgen van hoge kwaliteit beelden.
- Wanneer de set " ART " waarde is bereikt, druk op " verwerven " op het bedieningspaneel te verwerven van de afbeelding. Druk op de knop van de gevoeligheid om te stoppen met het gemiddeld. Aanpassen van de focus, om verschillende retinale lagen visualiseren.
- De 55° lens verwijderen en het brede veld 102° lens mount. Voer de stappen uit 4.1 – 4.6 voor beide ogen van elke muis en voor elke muis.
- Klik “ beelden opslaan ” op de bovenste rand aan de linkerkant van het venster en klik vervolgens op “ sluiten ”. Wilt opslaan de beelden in de computer, schakelt de muis uit de lijst in het rechterdeel van het scherm door te dubbelklikken op de naam van de muis. Dubbelklik op elke afbeelding afzonderlijk en klik op het pictogram van de diskette. Sla de afbeelding op als .tif, .bmp, .jpg of .png op de gewenste map. Om af te sluiten van de pers van de software “ bestand ” en “ sluiten ”.
5. Anesthesie omkering
- de ogen van de muis met een druppel hydroxypropylmethylcellulose hydrateren en rendement van de muis op een verwarming pad.
- Voorbereiden atipamezole oplossing in een dosis van 2,25 mg/kg om te keren van de kalmerende effecten van medetomidine hydrochloride. Voor een muis-20 g, voeg 9 µL van atipamezol in een eindvolume van 150 µL PBS. Opslaan van de oplossing bij 4 ° C gedurende maximaal één week.
- min na verdoving injectie (stap 2.2), 150 µL van atipamezole oplossing subcutaan injecteren.
- Controleren de muis tot herstel van de verdoving. Wanneer de muis is volledig herstelde (5-10 min na atipamezole injectie) zet het terug in zijn kooi. Herstel wordt aangegeven door de capaciteit van het dier te draaien van zijn lichaam toen legde aan de ene kant, herwinnen van wandelen van activiteit, en reageren in antwoord op het milieu stimulatie.
6. Handmatige Retinal Laagdiktemeting van SD-OCT beelden
- de OCT scan openen door te dubbelklikken op de naam van het dier.
- Openen van de B-scan verkregen met de 30 ° of 55 ° lens.
- Kiezen " dikte profiel ".
- Druk op de " bewerken laag segmentaties " pictogram ( figuur 2B). De software automatisch identificeert de innerlijke beperken en baseren membraan.
- Indien nodig handmatig corrigeren de positie van de innerlijke beperken en baseren membraan. Om dit te doen, kies de laag worden gewijzigd vanaf de linkerkant van het scherm en klik vervolgens op de rode cirkel optie ( figuur 2B). Zet de cirkel met de muisknop ingedrukt om de lijn wijzigen.
- Wijzigt u de regel om de positie van de bijbehorende laag correct. Klik op " opslaan en sluiten " om het venster te sluiten.
Opmerking: Als gevolg van de reflectiviteit van het vaatvlies, de software kan identificeren de basis membraan onjuist. Het is dus beter om het handmatig te definiëren alvorens tot retinale diktemetingen. - Kiezen " netvlies " onder de " laag " optie. Een diagram met de dikte van het netvlies zal verschijnen op de onderkant van het scherm.
- Klik op een andere positie op het diagram of op de B-scan te bekijken van het netvlies dikte (aangegeven in µm) voor de geselecteerde positie.
- Meten van de retinale dikte in de gewenste afstand vanaf de kop van de oogzenuw en de waarden in een werkblad kopieert.
- Herhaal stap 5.1-5,9 voor elke muis voor zowel de 30 ° en de lens 55 °.
- Statistische analyses uitvoeren met het gewenste software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van het protocol hier gepresenteerd, SD-OCT scant en SLO beelden werden verkregen uit Cx3cr1gfp/gfp muizen in dezelfde imaging-sessie. Figuur 3 bevat vertegenwoordiger SD-OCT één scans verkregen met een 30 ° of een 55 ° lens (Figuur 3 bis) en representatieve SLO beelden met een 55 ° of een 102 ° lens verkregen, waar gfp positieve microglia cellen worden gevisualiseerd. Hogere reflectiviteit van het vaatvlies wordt waargenomen in de SD-OCT scans verkregen met de 30 ° t.o.v. de 55 ° lens. Netvlies het platform is echter duidelijk in zowel de 30 ° en de 55 ° beelden (Figuur 3, juiste vergrote afbeeldingen). Na handmatige correcties van retinale grenzen (innerlijke beperken en baseren membraan), een goede correlatie van retinale diktemetingen werd waargenomen tussen de 30 o en de lens 55 ° bij het meten in dezelfde afstand van het hoofd van de oogzenuw ( Figuur 3 c; Pearson correlatie 0.967, p = < 0.0001). Eerdere studies hebben aangetoond dat de retinale diktemetingen op SD-OCT scans correlaat goed met ex vivo metingen op histologische retinale secties15,31 en dus SD-OCT kunnen worden gebruikt als een niet-invasieve techniek voor retinale diktemetingen. Met behulp van SLO, kon wij identificeren gfp positieve microglia cellen als hyperreflective signaal in de auto fluorescerende beelden, maar de lens van de 102 ° breed terrein kon ter dekking van een groter gebied van de fundus in vergelijking met de 55 ° lens. SLO kan ook worden gebruikt voor de monitoring van retinale microglia cellen distributie en activering in reporter muizen met een functionele fractalkine receptor (Cx3cr1gfp / + muizen) in normale of zieke netvlies12, 21,-32. De combinatie van SD-OCT met SLO in dezelfde imaging sessie kan informatie verschaffen over microglia distributie en activering bij netvlies degeneratie en nuttig is voor het toezicht op ziekten van de netvlies in muizen21zou kunnen zijn.
Figuur 1: representatief beeld van het apparaat dat wordt gebruikt in de huidige studie. Naar het image van het rechteroog van de muis, is de muis geplaatst op het linker gedeelte van de op maat gemaakte platform met de juiste baan geconfronteerd met de lens en het lichaam liggen gevoelig op het linker gedeelte van het platform. De hoogte van het platform kan worden aangepast door te draaien met de klok mee (te verlagen van het platform) of tegen de klok in (naar het platform til) de "kin rest aanpassing". De hendel van de filter moet worden geplaatst op "A" dat IR + OCT en AF beeldvorming. Met de focus knop (niet zichtbaar op de afbeelding), de experimentator kan het veranderen van de focus van de scanner. De micromanipulator kan worden gebruikt om correct belichten en het netvlies voor hoge kwaliteit afbeeldingen uitlijnen. Het doel kan worden verplaatst omhoog, omlaag, rechts of links door de handgreep van de camera. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: illustratie van het apparaat van het Configuratiescherm. (A) op het linker gedeelte van het display van de controle de overname modi kunnen worden geselecteerd (infrarood, auto fluorescentie, AF- of indocyanine groene angiografie, ICGA; gecombineerde of niet met optische coherentie tomografie, OCT). Op het middelste gedeelte van het paneel kan de instelling van de overname (intensiteit van de als afbeelding, sectie of volume scans) worden gekozen. Het gezichtsveld wordt bepaald door de geladen lens. Met de knop gevoeligheid kan de helderheid van het beeld IR of AF worden aangepast. Door te drukken op de knop van de gevoeligheid, zal de software beginnen gemiddeld de beelden verkregen in IR of AF om te zorgen voor een hoge kwaliteit beeld. (B) illustratie van de overname patroon menu. (C) samenvatting van de functies die worden gebruikt in de software met het bijbehorende pictogram. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: OCT scant en auto fluorescerende beelden van Cx3cr1gfp/gfp muis netvlies. (A) B-scans van het netvlies van de muis verkregen met een 55 ° (bovenste deelvenster) of een 30 ° lens (onderkant). Hogere vergrotingen van de gele kaders worden gepresenteerd op het juiste paneel. (B) beelden van gfp positieve microglia cellen in het netvlies van Cx3cr1gfp/gfp muizen verkregen met een 55 ° en een 102 ° lens (links en rechts panelen, respectievelijk). (C) retinale diktemetingen, gemeten op dezelfde afstand van het hoofd van de oogzenuw, op SD-OCT scans afgeleid van de 30 ° en 55 ° lens. Een goede correlatie werd waargenomen tussen de twee lenzen (Pearson correlatie = 0.967). Schaal bars: 200 µm, 100 µm op vergrote SD-OCT beelden (A, rechter paneel). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel toont een protocol voor de verwerving van retinale B-scans en beeldvorming van gfp positieve microglia distributie in het netvlies van de muis in dezelfde imaging-sessie. SD-OCT en SLO worden steeds meer gebruikt in diermodellen van retinale ziekte om informatie te verstrekken van retinale wijzigingen over tijd10,14,17,18,21. Met dit protocol, Cx3cr1gfp/gfp of Cx3cr1gfp / + muis netvlies kan niet-gebeurt worden beeld en informatie met de dikte van het netvlies kan worden verkregen. Dit is uitermate belangrijk in netvlies ziekte experimentele modellen, waar de ernst van de ziekte na verloop van tijd verandert of wanneer therapeutische behandelingen worden getest. Bovendien wordt het protocol beschreven hoe verslaggever muis lijnen kunnen worden gebruikt voor de in vivo imaging van fluorescerende cellen in het netvlies.
Het hier gepresenteerde protocol heeft echter enkele beperkingen. Beeldvorming van het netvlies van de muis in inrichtingen die zijn ontworpen voor de mens mogelijk eerst, uitdagende als gevolg van de hogere totale optische macht van het oog van de muis, die leiden kan tot vergroting onnauwkeurigheden7lateraal. Echter zijn de axiale SD-OCT-metingen nauwkeurige8. Bovendien, follow-up onderzoek bij muizen via de optie "verwijzing ingesteld" van de software is nogal moeilijk als gevolg van de niet vaste positie van de muis op het perron en dus longitudinale beeldvorming van muis netvlies kunnen uitdagende. Longitudinale uitlijning van het oog kan worden bereikt door de oogzenuw positionering in het midden van het infrarood beeld en vervolgens het verwerven van de gewenste beelden. Om te corrigeren voor rotatie van het oog, handmatige aanpassingen van de SD-OCT nl gezicht beelden kunnen worden uitgevoerd na de overname en toepassing op de diktemetingen zoals elders beschreven33. Naast de imaging systeem dat wordt gebruikt in het huidige protocol, andere beeldvormingssystemen ook ontwikkeld die zorgen voor een grotere hoek en kan het beeld van een grotere retinale ruimte zonder het gebruik van de contactlens. OPTOS kan bijvoorbeeld betrekking hebben op een groter oppervlak van de retinale maar met grotere variabiliteit van de afbeelding ten opzichte van het apparaat dat wordt gebruikt in de huidige studie34. Ondanks deze beperkingen, kan dit protocol worden gebruikt in verschillende experimentele modellen van retinale ziekte. De informatie die kan worden verkregen, omvat retinale dikte veranderingen (zwelling, atrofie), opsporing van retinale detachement, of de aanwezigheid van hyperreflective punten en fluorophore-geëtiketteerden cellen en de stijging of daling van hun nummers.
Combinatie van de twee methoden in muizen heterozygoot voor de uitdrukking van Cx3cr1 (Cx3cr1gfp / +), die hebben een functionele fractalkine receptor, maakt de experimentator gelijktijdig in vivo detecteren verbouwingen van het retinale integriteit in real time en mogelijk microglia accumulatie in de nabijheid van netvlies afwijkingen (bijvoorbeeld, zwelling, Retina atrofie van het retinale) tijdens het netvlies ziekte of letsel. Bovendien, door toepassing van Morfometrische analyse, microglia activeringsstatus kan worden beoordeeld op basis van de grootte van het soma en complexiteit van microglia verwerkt21. In het netvlies ziekten, zoals retinale veneuze occlusie, zijn activering en accumulatie van microglia/macrofagen op netvlies atrofische sites waargenomen27. Bovendien, in muizen defect voor het Nr2e3 gen (nucleaire Receptor onderfamilie 2 groep E lid 3), een muismodel van de recessively overgenomen verbeterde S-cone gevoeligheid syndroom (SER's), de nucleaire buitenlaag vouwen (rozetten) kan worden waargenomen op vroeg postnatale dagen.
Interessant, microglia cellen kunnen binnen de rozetten worden gevonden en er is gesuggereerd dat microglia kan bijdragen aan de ontaarding van researchdieren waargenomen in het netvlies van deze muizen35,36. Aangezien de activering van microglia zijn betrokken in de loop van een verscheidenheid van retinale ziekten en soms gepaard gaat met veranderingen in het netvlies het platform10,27,37,38 , de combinatie van SD-OCT en SLO correlaties tussen microglia activeren en Retina degeneratie kan onthullen. Dit protocol kan de gegevens verstrekken die lengterichting ondanks sommige uitdagingen, en dus het zou waardevol voor de correlatie van retinale schade met microglia distributie/activering en voor het toezicht van therapeutische behandeling effectiviteit21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door een subsidie van de Zwitserse National Science Foundation (SNSF; #320030_156019). De auteurs ontvangen nietfinanciële steun in Heidelberg Engineering GmBH, Duitsland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spectralis Imaging system (HRA+OCT) | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | ophthalmic imaging platform system |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | Version 1.9.13.0 |
| 78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lens | Volk Optical Inc., Ohio, USA | V78C | |
| Spectralis wide angle 55° lens | Heidelberg Engineering, Germany | 50897-002 | |
| ultra widefield 102° lens | Heidelberg Engineering, Germany | 50117-001 | |
| medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor) | Provet AG, Lyssach, Switzerland | Swissmedic Nr. 50'590 - ATCvet: QN05CM91 | anesthetic/analgesic |
| ketamine 50mg/ml (Ketalar) | Parke-Davis, Zurich, Switzerland | 72276388 | anesthetic |
| tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix) | ISPI, Bern, Switzerland | N/A | pupil dilation |
| Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mm | B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Straße, Germany | 9151125 | |
| hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%) | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | N/A | |
| +4 dpt rigid gas permeable contact lens | Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY | N/A | Base Curve: 7.20 to 8.40 mm Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm Power: -25.00 to +25.00 Diopters |
| balanced salt solution (BSS) | Inselspital, Bern, Switzerland | N/A | |
| silicon forceps | N/A | N/A | |
| atipamezole 5 mg/mL (Antisedan) | Provet AG, Lyssach, Switzerland | N/A | α2 adrenergic receptor antagonist |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA | N/A | statistical analysis software |
References
- Madeira, M. H., Boia, R., Santos, P. F., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Contribution of microglia-mediated neuroinflammation to retinal degenerative diseases. Mediators Inflamm. , 673090 (2015).
- Ng, T. F., Streilein, J. W. Light-induced migration of retinal microglia into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (13), 3301-3310 (2001).
- Langmann, T.
- Joly, S., et al. Cooperative phagocytes: resident microglia and bone marrow immigrants remove dead photoreceptors in retinal lesions. Am J Pathol. 174 (6), 2310-2323 (2009).
- Arroba, A. I., Alvarez-Lindo, N., van Rooijen, N., de la Rosa, E. J. Microglia-mediated IGF-I neuroprotection in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (12), 9124-9130 (2011).
- Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Exp Eye Res. 81 (6), 700-709 (2005).
- Geng, Y., et al.
- Lozano, D. C., Twa, M. D. Development of a rat schematic eye from in vivo biometry and the correction of lateral magnification in SD-OCT imaging. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6446-6455 (2013).
- Vaz-Pereira, S., et al. Optical Coherence Tomography Features Of Active And Inactive Retinal Neovascularization In Proliferative Diabetic Retinopathy. Retina. 36 (6), 1132-1142 (2016).
- Kokona, D., Haner, N. U., Ebneter, A., Zinkernagel, M. S. Imaging of macrophage dynamics with optical coherence tomography in anterior ischemic optic neuropathy. Exp Eye Res. , (2016).
- Makiyama, Y., et al. Macular cone abnormalities in retinitis pigmentosa with preserved central vision using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. PLoS One. 8 (11), e79447 (2013).
- Paques, M., et al. High resolution fundus imaging by confocal scanning laser ophthalmoscopy in the mouse. Vision Res. 46 (8-9), 1336-1345 (2006).
- Joshi, R., et al. Spontaneously occurring fundus findings observed using confocal scanning laser ophthalmoscopy in wild type Sprague Dawley rats. Regul Toxicol Pharmacol. 77, 160-166 (2016).
- Muraoka, Y., et al. Real-time imaging of rabbit retina with retinal degeneration by using spectral-domain optical coherence tomography. PLoS One. 7 (4), e36135 (2012).
- Fischer, M. D., et al. Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography. PLoS One. 4 (10), e7507 (2009).
- Bell, B. A., et al. Retinal vasculature of adult zebrafish: in vivo imaging using confocal scanning laser ophthalmoscopy. Exp Eye Res. 129, 107-118 (2014).
- Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
- Huber, G., et al. Spectral domain optical coherence tomography in mouse models of retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5888-5895 (2009).
- Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative Analysis of Mouse Retinal Layers Using Automated Segmentation of Spectral Domain Optical Coherence Tomography Images. Transl Vis Sci Technol. 4 (4), 9 (2015).
- Sim, D. A., et al. A simple method for in vivo labelling of infiltrating leukocytes in the mouse retina using indocyanine green dye. Dis Model Mech. 8 (11), 1479-1487 (2015).
- Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma. J Vis Exp. (99), e52731 (2015).
- Acton, J. H., Cubbidge, R. P., King, H., Galsworthy, P., Gibson, J. M. Drusen detection in retro-mode imaging by a scanning laser ophthalmoscope. Acta Ophthalmol. 89 (5), e404-e411 (2011).
- Greenstein, V. C., et al. Structural and functional changes associated with normal and abnormal fundus autofluorescence in patients with retinitis pigmentosa. Retina. 32 (2), 349-357 (2012).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Wang, X., et al. Requirement for Microglia for the Maintenance of Synaptic Function and Integrity in the Mature Retina. J Neurosci. 36 (9), 2827-2842 (2016).
- Ebneter, A., Casson, R. J., Wood, J. P., Chidlow, G. Microglial activation in the visual pathway in experimental glaucoma: spatiotemporal characterization and correlation with axonal injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (12), 6448-6460 (2010).
- Ebneter, A., Kokona, D., Schneider, N., Zinkernagel, M. S. Microglia Activation and Recruitment of Circulating Macrophages During Ischemic Experimental Branch Retinal Vein Occlusion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 944-953 (2017).
- Lin, Y. L., Potter-Baker, K. A. Using theoretical models from adult stroke recovery to improve use of non-invasive brain stimulation for children with congenital hemiparesis. J Neurophysiol. , (2017).
- Combadiere, C., et al. CX3CR1-dependent subretinal microglia cell accumulation is associated with cardinal features of age-related macular degeneration. J Clin Invest. 117 (10), 2920-2928 (2007).
- Bermudez, M. A., et al. Time course of cold cataract development in anesthetized mice. Curr Eye Res. 36 (3), 278-284 (2011).
- Toth, C. A., et al. A comparison of retinal morphology viewed by optical coherence tomography and by light microscopy. Arch Ophthalmol. 115 (11), 1425-1428 (1997).
- Ebneter, A., Kokona, D., Jovanovic, J., Zinkernagel, M. S. Dramatic Effect of Oral CSF-1R Kinase Inhibitor on Retinal Microglia Revealed by In Vivo Scanning Laser Ophthalmoscopy. Transl Vis Sci Technol. 6 (2), 10 (2017).
- Gabriele, M. L., et al. Reproducibility of spectral-domain optical coherence tomography total retinal thickness measurements in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (12), 6519-6523 (2010).
- Nakao, S., et al. Wide-field laser ophthalmoscopy for mice: a novel evaluation system for retinal/choroidal angiogenesis in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5288-5293 (2013).
- Wang, N. K., et al. Origin of fundus hyperautofluorescent spots and their role in retinal degeneration in a mouse model of Goldmann-Favre syndrome. Dis Model Mech. 6 (5), 1113-1122 (2013).
- Wang, N. K., et al. Cellular origin of fundus autofluorescence in patients and mice with a defective NR2E3 gene. Br J Ophthalmol. 93 (9), 1234-1240 (2009).
- Thanos, S. Sick photoreceptors attract activated microglia from the ganglion cell layer: a model to study the inflammatory cascades in rats with inherited retinal dystrophy. Brain Res. 588 (1), 21-28 (1992).
- Hughes, E. H., et al. Generation of activated sialoadhesin-positive microglia during retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (5), 2229-2234 (2003).
