Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

В естественных условиях Визуализация Cx3cr1gfp/gfp репортер мышей с спектральные домена оптическая когерентная томография и сканирование лазерная офтальмоскопия

Published: November 11, 2017 doi: 10.3791/55984
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Ophthalmology and Department of Clinical Research, Bern University Hospital and University of Bern

Summary

Этот протокол описывает как с высоким разрешением изображений методы, такие как спектральной области оптическая когерентная томография и сканирование лазерная офтальмоскопия могут быть использованы в мелких грызунов, с помощью офтальмологических изображений платформы системы, для получения информации о Толщина сетчатки и Микроглии клеток распределения, соответственно.

Abstract

Спектральной области оптическая когерентная томография (SD-Октябрь) и сканирующий лазер офтальмоскопия (SLO) широко используются в экспериментальной офтальмологии. В настоящем Протоколе, мышей выражая Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) под промоутер Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) были использованы для изображения Микроглии клеток в естественных условиях в сетчатке. Микроглии являются резидентов макрофаги сетчатки и были вовлечены в ряд заболеваний сетчатки1,2,3,4,5,6. Этот протокол обеспечивает детальный подход для поколения сетчатки Б-сканов, с SD-Октябрь и визуализация распределения Микроглии клеток в Cx3cr1gfp/gfp мышей с SLO в естественных условиях, с использованием офтальмологических тепловизионные системы платформы. Протокол может использоваться в нескольких линиях мыши репортер. Однако есть некоторые ограничения для протокола, представленные здесь. Во-первых, SLO и SD-Октябрь, когда используется в режиме с высоким разрешением, сбор данных с высоким разрешением осевой но латеральное разрешение ниже (3,5 мкм и 6 мкм, соответственно). Кроме того уровень внимания и насыщенность в SLO сильно зависит подбор параметров и правильное выравнивание глаза. Кроме того с помощью устройств, предназначенных для человека пациентов в мышей является сложной задачей из-за выше Общая оптическая сила мыши глаза по сравнению с человеческим глазом; Это может привести к боковым увеличение неточности7, который также зависит от масштаба линзы мыши среди других. Однако несмотря на то что положение осевой сканирования зависит от боковых увеличение, осевые измерения SD-Октябрь точной8.

Introduction

В экспериментальной офтальмологии изучения патологии сетчатки обычно оценивается с использованием гистологических методов. Однако требует животных euthanization и может вызвать изменения в фактической свойства ткани гистологии. SD-OCT и SLO обычно используются в клинической офтальмологии для целей диагностики и мониторинга нескольких заболеваний сетчатки, например диабетического макулярного отека9, передней ишемической оптической невропатии10или пигментный ретинит11 . SD-OCT и SLO являются неинвазивные методы, которые создают изображения с высоким разрешением сетчатки, которые визуализируются через расширенные ученик без дальнейшего вмешательства. SD-OCT предоставляет информацию сетчатки структуры и толщина сетчатки, собирая обратного рассеяния данных для создания поперечных изображения сетчатки, в то время как SLO собирает данные флуоресценции для получения стереоскопических изображений высокой контрастностью сетчатки. В настоящее время обе методики все чаще используются в экспериментальной офтальмологии с помощью мелких грызунов12,13,14,15 (или даже данио рерио16,17) и может предоставить оба качественной и количественной информации12,,1718,19,,2021.

Накопление эндогенного флуорофоров как lipofuscins или формирования друз в сетчатке могут быть визуализированы в SLO как auto флуоресцентного сигнала. Эта особенность делает SLO полезен для диагностики и мониторинга заболеваний сетчатки, таких как age-related macular вырождения или пигментный ретинит22,23. В экспериментальной офтальмологии auto флуоресценции изображений (AF) может использоваться для обнаружения типов конкретных клеток в линиях мыши репортер. Например выгодные для визуализации в vivo Микроглии клеток в Нормальная сетчатка и для расследования микроглии/макрофагов мышей гетерозиготных для выражения гена gfp под промоутер Cx3cr124 динамика в сетчатки заболевания21. Микроглии являются резидентов макрофаги сетчатки, которые играют решающую роль на ткани гомеостаза и восстановление тканей после травмы1,25,26. Микроглии активации в сетчатке было сообщено в сетчатки травмы и ишемии, вырождение, предлагая роль этих клеток сетчатки заболевания2,3,4,5, 6.

Целью настоящего Протокола является описание относительно простой метод для сетчатки изображений и измерение толщины сетчатки, используя SD-Октябрь и для визуализации gfp позитивные Микроглии клеток в сетчатке мыши Cx3cr1gfp/gfp с помощью SLO (Heidelberg Spectralis HRA + OCT системы). Этот протокол может использоваться для визуализации и толщина измерений здоровыми или больными сетчатки в различных линиях мыши. Кроме того морфометрический анализ может выполняться для идентификации и количественной оценки микроглии чисел и микроглии активации в сетчатке, используя SLO21. Микроглии клеток, связанные с дегенеративными заболеваниями центральной нервной системы (ЦНС), в том числе Сетчатка27,,2829. Таким образом комбинируя два методы, используемые в настоящем Протоколе, корреляция микроглии распределения и дегенерации сетчатки могут быть сделаны, которые могут облегчить мониторинг тяжести заболевания или эффективность терапевтических подходов в естественных условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

во всех процедурах, взрослых мужских и женских мышей BALB/c которые выражают gfp под промоутер Cx3cr1 были используется 24. Мышей обращались согласно заявлению Арво для использования животных в глазной и видение научных исследований и все процедуры были утверждены от правительства Швейцарии, Швейцарский регламент федерального на животных. Мышей были под наркозом подкожно medetomidine гидрохлорид (0,75 мг/кг) и кетамин (45 мг/кг). Надлежащего анестезии была подтверждена мониторинга частоты дыхания и животных ' рефлекс s против щепотку хвост. В конце экспериментов, мышей были умерщвлены с CO 2 ингаляции.

Примечание: выполнить каждой тепловизионной сессии как можно скорее (максимум 20 мин), начиная с формирования катаракты следующие анестезии может препятствовать сетчатки визуализации 30.

1. Конфигурация системы

  1. включите компьютер.
  2. Включите источник питания. Сообщение " начать приобретение модуля " будет отображаться на экране панели управления устройства.
  3. Дважды щелкните ярлык на рабочем столе программного обеспечения для работы программное обеспечение.
  4. На представлении базы данных, нажмите кнопку " добавить пациент " значок.
  5. Во всплывающем окне, вставьте всю необходимую информацию (фамилия, имя, название, дату рождения, пол и пациент ID) и нажмите кнопку " ОК ". В окне поп роговицы кривизны 2 мм и нажмите кнопку " ОК ".
  6. Позиция 78D Стандартный глазной щели-контакт лампы объектив перед стандартной 30 ° оптические и безопасно закрепите скотчем.
  7. Убедитесь, что фильтр рычаг на левой стороне устройства позиционируется на указание " A " разрешить ИК + OCT и AF изображений ( рис. 1).

2. Подготовка мыши

  1. использования medetomidine гидрохлорид дозе 0,75 мг/кг и кетамин в дозе 45 мг/кг в фосфат амортизированное saline (PBS, рН 7,4) подготовить решение анестезии. Таким образом для мыши 20 g, смесь 15 мкл medetomidine гидрохлорида с 18 мкл кетамина в окончательный объем 50 мкл в PBS. Хранят раствор при температуре 4 ° C на срок до одной недели.
  2. Захватить мышь шиворот и нанесите одну каплю Тропикамид 0,5% + фенилэфрина гидрохлорида 2,5% на каждый глаз для достижения дилатация зрачка.
  3. Держите мышь сдержанно и с шприц инсулина, придает иглой 30G, вставляют 50 мкл раствора анестезии подкожно. Поместите мышь обратно в своей клетке, которая находится выше грелку. Подождите 3-5 мин, до тех пор, пока мышь полностью седативные. Для оценки глубины анестезии, щепотка хвост мыши. Проверьте роговицы рефлекс, нежно касаясь мыши роговицы с ватным тампоном. Если наблюдается без положительных рефлекс, продолжать с изображениями.
    Примечание: Важно контролировать частоту дыхания во время анестезии. Если мышь не седативные полностью, частота дыхания увеличится на болезненный стимул.
  4. Гидрат мыши роговицы с применением 2% гидроксипропилметилцеллюлоза капли в каждый глаз.

3. SD-Окт

  1. место заплату потепления приблизительно 32 ° c на платформе по индивидуальному заказу, крепится на остальные устройства Чин ( рис. 1).
  2. Изображения правый глаз, поместите указатель мыши в левой части платформы ( рис. 1). Убедитесь, что правой орбиты мыши сталкивается объектив, и его тело лежит склонны в левой части платформы.
  3. Применить капли гидроксипропилметилцеллюлоза на правый глаз и осторожно поместите проницаемых контактные линзы + 4 диоптрий грузовик газ на нем (сферической сила:-25.00 для +25.00 диоптрий). Магазин контактных линз в сбалансированного солевого раствора (BSS). Чтобы захватить объектива, используйте пластика или кремния щипцы, чтобы избежать повреждения.
  4. Нажмите желтую коробку на правом углу дисплее панели управления, чтобы начать приобретение модуля (зеленый флажок на рисунок 2A). Желтое поле будет зазеленеть и в меню панели управления появится на экране ( рисунок 2A).
  5. На приобретение Б-сканов, выберите вариант ИК + OCT на панели управления ( рис. 2A). Выбранные параметры будут выделены синим цветом на панели управления.
  6. Выберите " сетчатки " под " приложения и структуры " в программное обеспечение и перемещения объектива к мыши глаз с помощью микроманипулятор на устройстве ( рис. 1). Прежде чем выполнять фокусировку на сетчатку, проверьте, что указание " ОД " выбран в левой нижней части экрана. Программное обеспечение автоматически определяет слева (ОС) и правый глаз (OD) на основе положения цели.
    Примечание: Если цель находится на середине платформы, сообщение об ошибке будет появляться в нижней части экрана. В этом случае повторно позиции мыши слегка до тех пор, пока программное обеспечение распознает правильный глаз.
  7. С ручкой фокус, сосредоточиться на сетчатке до больших судов четко видны в изображении глазного дна в левой части экрана компьютера. Переместите камеру, повернув микроманипулятор левой или правой переместить камеру в этом направлении, или по часовой стрелке или против часовой стрелки, чтобы переместить камеру вверх или вниз, соответственно.
    Примечание: Перемещать указатель мыши на платформе или перемещения объектива вверх или вниз для достижения предпочтительной локализации головку зрительного нерва в инфракрасном изображении.
  8. Поверните регулятор чувствительности против часовой стрелки для уменьшения или по часовой стрелке, чтобы увеличить яркость изображения глазного дна. Когда достигается оптимального фокуса, на правой части экрана появится SD-OCT Б-скан.
    Примечание: Если Б-скан не могут быть визуализированы, регулируя фокус, нажмите комбинацию Ctrl + Alt + Shift + O на клавиатуре. Во всплывающем окне, отрегулируйте значение ссылка руку до тех пор, пока на экране появится B-скан.
  9. В нижней правой части экрана, выберите одно сканирование из шаблона меню (одинарная линия на рис. 2B).
  10. Свою очередь микроманипулятор устройства ( рис. 1), левый, правый, вперед или назад (чтобы включить камеру в этом направлении) обеспечить, что B-скан расположен между верхней и нижней углы SD-Окт сканирования окно.
  11. Значение автоматического реального времени (АРТ) по крайней мере 9 для получения высокого качества изображений.
    Примечание: Искусство улучшает качество изображения путем усреднения нескольких последовательных сканирований. Чем выше " искусство " значение, чем выше отношение сигнал шум и, таким образом, качество изображения. Однако, увеличивая " искусство " значение, приобретение время также увеличилось.
  12. Пресс " приобрести " кнопку ( рис. 2) на экран панели управления и получить изображения.
  13. Повторно позиции мыши изображение левый глаз и повторить шаги 3.2-3.12.
  14. Удалить контактные линзы с пластик/кремния щипцами и поместить его в BSS.
  15. Увлажнения роговицы мыши с каплей свежего гидроксипропилметилцеллюлоза и удалите избыток с папиросной бумаги.
  16. Удалить стандартные 30 ° оптические, повернув его против часовой стрелки.
  17. Установите объектив 55 ° и повторите шаги 3.4-3.12 для каждого глаза.

4. Авто, флуоресценции Imaging

  1. без перемещения мыши на платформе, выберите на панели управления ИК.
  2. С ручкой фокус, сосредоточиться на больших сосудов сетчатки.
  3. На панели управления выберите ф.
  4. Поверните регулятор чувствительности против часовой стрелки для уменьшения или по часовой стрелке для увеличения яркости изображения.
  5. Нажмите на регулятор чувствительности и установить " искусство " значение 67 или больше для получения высокого качества изображений.
  6. При наборе " искусство " достигнуто значение, нажмите " приобрести " на панели управления, чтобы получить изображение. Нажмите на регулятор чувствительности снова, чтобы остановить усреднения. Отрегулируйте фокус, для визуализации различных слоях сетчатки.
  7. Удалить объектив 55° и смонтировать широкое поле 102° объектив. Выполните шаги 4.1 – 4.6 для обоих глаз каждой мыши и для каждой мыши.
  8. Нажмите “ сохранять изображения ” на левой верхней границе окна и затем щелкните “ выйти из ”. Для сохранения изображений на компьютере, выберите мышью из списка в правой части экрана, дважды щелкнув по имени мыши. Дважды нажмите на каждое изображение отдельно и затем щелкните на значке дисковода гибких дисков. Сохраните изображение как .tif, .bmp, .jpg или .png в нужную папку. Для выхода из печати программное обеспечение “ файл ” и “ выйти из ”.

5. Анестезия разворота

  1. увлажнения глаза мыши с одной капли гидроксипропилметилцеллюлоза и вернуть указатель мыши на грелку.
  2. Подготовка Атипамезола раствора в дозе 2,25 мг/кг для обращения вспять седативный эффект medetomidine гидрохлорид. Для мыши 20 g мкл 9 atipamezol в окончательном объеме 150 мкл PBS. Хранят раствор при температуре 4 ° C на срок до одной недели.
  3. мин после анестезии инъекции (шаг 2.2), инъекционные 150 мкл раствора Атипамезола подкожно.
  4. Монитор мыши до выздоровления от анестезии. Когда указатель мыши находится полностью восстановленные (5-10 мин после инъекции Атипамезола) положить его обратно в своей клетке. Восстановление обозначается животного возможность превратить его тело, когда положили на одной стороне, приходя ходить деятельности и реагирования в ответ на экологические стимулирование.

6. Ручное измерение толщины сетчатки от изображения SD-Окт

  1. откройте OCT сканирования, дважды щелкнув на название животного.
  2. Открыть полученные с объективом 30 ° и 55 ° B-скан.
  3. Выберите " Толщина профиля ".
  4. Пресс " Редактирование слоя Segmentations " значок ( рис. 2B). Программное обеспечение автоматически определяет внутреннее ограничение и базовые мембраны.
  5. При необходимости вручную исправить положение внутренние ограничения и мембраны. Чтобы сделать это, выберите слой, чтобы быть изменены с левой стороны экрана, а затем параметр красный круг ( рис. 2B). Переместить круг с кнопку мыши нажатой для изменения линии.
  6. Измените строку, чтобы правильно расположить соответствующего слоя. Нажмите кнопку " сохранить и закрыть " для выхода из окна.
    Примечание: Из-за отражения сосудистое, программное обеспечение может определить базовый мембраны неправильно. Таким образом, желательно, чтобы определить его вручную, прежде чем приступать к сетчатки толщин.
  7. Выбрать " сетчатки " под " слоем " вариант. На нижней части экрана появится схема сетчатки толщина.
  8. Нажмите на другую позицию на диаграмме или на B-скан для просмотра сетчатки толщина (указано в мкм) для выбранной позиции.
  9. Измерить толщину сетчатки в на желаемом расстоянии от головы зрительного нерва и скопировать значения из электронной таблицы.
  10. Повторите шаги 5.1-5.9 для каждой мыши для 30 ° и 55 ° объектив.
  11. Выполнять статистический анализ с необходимое программное обеспечение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

С помощью протокола, представленные здесь, SD-Окт сканирует и SLO изображения были получены из Cx3cr1gfp/gfp мышей в том же сеансе изображений. Рисунок 3 включает в себя представитель SD-Окт одного сканирования, полученные с 30 ° или 55 ° объектив (Рисунок 3А) и представитель SLO изображения, полученные с 55 ° или 102 ° объектив, где визуализируются gfp позитивные Микроглии клеток. Высокий коэффициент отражения сосудистое наблюдается в SD-Окт сканирования, полученные с 30 °, по сравнению с 55 ° объектив. Однако сетчатки архитектура ясно, 30 ° и 55 ° изображения (рис. 3, правый увеличенного изображения). После ручной корректировки границ сетчатки (внутренний ограничения и мембраны), хорошее соотношение толщин сетчатки наблюдалось между 30 o и 55 ° объектив при измерении в таком же расстоянии от головы зрительного нерва ( Рисунок 3 c; Корреляции Пирсона 0.967, p = < 0.0001). Предыдущие исследования показали, что измерения толщины сетчатки на SD-Окт проверок коррелятом хорошо с ex vivo измерения на гистологических срезах сетчатки15,31 и таким образом SD-Окт может использоваться как неинвазивный метод для измерения толщины сетчатки. С помощью SLO, мы могли бы определить gfp позитивные Микроглии клеток как сигнал hyperreflective в авто флуоресцентных изображений, однако широкое поле 102 ° объектив смог охватить большую площадь глазного дна, по сравнению с 55 ° объектив. SLO также могут быть использованы для мониторинга распределения сетчатки Микроглии клеток и активации репортер мышей с функциональной fractalkine рецептор (Cx3cr1gfp / + мышей) в нормальных или больными сетчатки12, 21,32. Сочетание SD-OCT с SLO в том же сеансе изображений может предоставить информацию о микроглии распределения и активации при дегенерации сетчатки и могут быть полезны для мониторинга заболеваний сетчатки в мышей21.

Figure 1
Рисунок 1: представитель изображение устройства, используемого в настоящем исследовании. Для изображения правый глаз мыши, мыши располагается на левой части платформы на заказ с ее правой орбиты, стоящих перед объективом и его тело, лежа склонны в левой части платформы. Высота платформы может быть скорректированные, повернув по часовой стрелке (Нижняя платформа) или против часовой стрелки (чтобы поднять платформы) «Чин остальные настройки». Рычаг фильтр должен располагаться на «A», чтобы разрешить ИК + OCT и Автофокусировки изображения. С ручкой фокус (не видно на рисунке) экспериментатора может изменить фокус сканера. Микроманипулятор может использоваться для правильно осветить и выровнять сетчатки для высокого качества изображения. Цель может быть перемещен вверх, вниз, вправо или влево на рукоятке камеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Иллюстрация панели управления устройства. (A) в левой части окна панели управления, приобретение режимы могут быть выбраны (ИК, ИК; авто флуоресценции, AF или indocyanine зеленый ангиографии, ICGA; комбинированные или не с оптическая когерентная томография, Октябрь). На средней части панели параметр приобретение может быть выбран (интенсивность Если сканирует изображение, раздела или тома). Поле зрения определяется загруженного объектива. С помощью регулятора чувствительность можно отрегулировать яркость изображения IR или AF. Нажав на ручку чувствительность, программное обеспечение будет начать Усреднение изображений, полученных в ИК или AF для обеспечения высокого качества изображения. (B) Иллюстрация приобретение шаблон меню. (C) краткое изложение функций, используемые в программное обеспечение с соответствующий значок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: OCT сканирует и авто флуоресцентного изображения Cx3cr1gfp/gfp мыши сетчатки. (A) Б-сканов мыши сетчатки, полученные с 55 ° (Верхняя панель) или объективом 30 ° (Нижняя панель). Более высоких увеличениях желтые прямоугольники представлены на правой панели. (B) образы gfp позитивные Микроглии клеток сетчатки Cx3cr1gfp/gfp мышей, полученные с 55 ° и 102 ° объектив (левой и правой панелей, соответственно). (C) сетчатки толщин, измеренная на таком же расстоянии от зрительного нерва головы, на SD-Окт проверки полученных от 30 ° и 55 ° объектива. Было отмечено хорошее соотношение между двух линз (корреляции Пирсона = 0.967). Масштаб бары: 200 мкм, 100 мкм на увеличенного изображения SD-Окт (, правая панель). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Настоящей статьи демонстрирует протокол для приобретения сетчатки Б-сканов и изображений gfp позитивные микроглии распределения в сетчатке мыши в том же сеансе изображений. SD-OCT и SLO все шире используются в животных моделях заболеваний сетчатки для предоставления информации сетчатки изменения за время10,14,,1718,21. Этот протокол, Cx3cr1gfp/gfp или Cx3cr1gfp / + мыши сетчатки может быть неинвазивно imaged и информацию сетчатки толщины можно получить. Это крайне важно в экспериментальных моделях заболеваний сетчатки, где тяжести заболевания изменяется с течением времени или когда проверяются терапевтические процедуры. Кроме того протокол описывает, как репортер мыши линии могут быть использованы для визуализации в vivo люминесцентные клеток в сетчатке.

Однако протокола, представленные здесь имеет некоторые ограничения. Во-первых томография сетчатки мыши в устройствах, предназначенных для людей может быть сложным из-за выше Общая оптическая сила мыши глаза, что может привести к боковым увеличение неточности7. Однако осевые измерения SD-Октябрь являются точные8. Кроме того последующие экспертизы в мышей, с помощью параметра «установить ссылку» программного обеспечения довольно сложно из-за не фиксированное положение мыши на платформе, и таким образом продольной томографии мыши сетчатки может быть сложным. Головке глаза может быть достиган позиционирования зрительного нерва в центре инфракрасные изображения и затем приобретения желаемого изображения. Для того чтобы исправить для поворота глаз, ручного выравнивания изображений лица en SD-Окт могут быть выполнены после приобретения и применяются для измерения толщины, как описано в других разделах33. Помимо изображений системы, используемые в настоящем протоколе другие тепловизионные системы были также разработаны которые обеспечивают больший угол и может изображение сетчатки большую площадь без использования контактных линз. Оптопары, например, может охватывать более большой поверхности сетчатки но с большей изменчивости изображения по сравнению с устройства, используемые в настоящее время исследования34. Несмотря на эти ограничения настоящий Протокол может быть использован в нескольких экспериментальных моделях заболеваний сетчатки. Информация, которая может быть получена включает в себя изменения сетчатки толщина (отек, атрофия), обнаружение отслоения сетчатки или наличие точки hyperreflective и Флюорофор меченых клеток и увеличение или уменьшение их числа.

Сочетание этих двух методов гетерозиготных мышей для выражения Cx3cr1 (Cx3cr1gfp / +), которые имеют функциональный fractalkine рецептор, позволяет экспериментатору определить одновременно в естественных условиях изменения сетчатки целостности в реальном времени и возможного накопления микроглии вблизи сетчатки отклонений (например, сетчатки отек, атрофии сетчатки) во время сетчатки заболевания или травмы. Кроме того применяя морфометрический анализ, государств микроглии активации могут быть оценены на основе размера сома и сложность микроглии процессов21. В заболевания сетчатки, например вены сетчатки окклюзии активации и накопление микроглии/макрофаги сетчатки атрофический сайтов было отмечено27. Кроме того у мышей дефектного гена Nr2e3 (ядерных рецепторов Subfamily 2 группы Е член 3), модель мыши рецессивно наследуемые Улучшено S-конус чувствительность синдром (ЭСК), ядерный слой складные (розетки) может наблюдаться в начале послеродовых дней.

Интересно, что Микроглии клеток могут быть найдены внутри розетки, и было предложено, что микроглии может способствовать к вырождению фоторецепторов, наблюдается в retinas этих мышей35,36. После активации микроглии были вовлечены в различные заболевания сетчатки и иногда сопровождается изменения сетчатки архитектуры10,27,37,38 , сочетание SD-OCT и SLO можно выявить корреляции между микроглии активации и дегенерации сетчатки. Несмотря на некоторые проблемы настоящий Протокол может предоставить такую информацию в продольном направлении, и таким образом было бы ценным для корреляции поражения сетчатки с микроглии распределения/активации и для мониторинга терапевтического лечения эффективность21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантом Швейцарский Национальный научный фонд (SNSF; #320030_156019). Авторы получили нефинансовой поддержки от Heidelberg Engineering GmBH, Германия.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectralis Imaging system (HRA+OCT) Heidelberg Engineering, Germany N/A ophthalmic imaging platform system
Heidelberg Eye Explorer Heidelberg Engineering, Germany N/A Version 1.9.13.0
78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lens Volk Optical Inc., Ohio, USA V78C
Spectralis wide angle 55° lens Heidelberg Engineering, Germany 50897-002
ultra widefield 102° lens Heidelberg Engineering, Germany 50117-001
medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor) Provet AG, Lyssach, Switzerland Swissmedic Nr. 50'590 - ATCvet: QN05CM91 anesthetic/analgesic
ketamine 50mg/ml (Ketalar) Parke-Davis, Zurich, Switzerland 72276388 anesthetic
tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix) ISPI, Bern, Switzerland N/A pupil dilation
Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mm B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Straße, Germany 9151125
hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%) OmniVision, Neuhausen, Switzerland N/A
+4 dpt rigid gas permeable contact lens Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY N/A Base Curve: 7.20 to 8.40 mm
Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm
Power: -25.00 to +25.00 Diopters
balanced salt solution (BSS) Inselspital, Bern, Switzerland N/A
silicon forceps N/A N/A
atipamezole 5 mg/mL (Antisedan) Provet AG, Lyssach, Switzerland N/A α2 adrenergic receptor antagonist
GraphPad Prism 7 GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA N/A statistical analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Madeira, M. H., Boia, R., Santos, P. F., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Contribution of microglia-mediated neuroinflammation to retinal degenerative diseases. Mediators Inflamm. , 673090 (2015).
  2. Ng, T. F., Streilein, J. W. Light-induced migration of retinal microglia into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (13), 3301-3310 (2001).
  3. Langmann, T. Microglia activation in retinal degeneration. J Leukoc Biol. 81 (6), 1345-1351 (2007).
  4. Joly, S., et al. Cooperative phagocytes: resident microglia and bone marrow immigrants remove dead photoreceptors in retinal lesions. Am J Pathol. 174 (6), 2310-2323 (2009).
  5. Arroba, A. I., Alvarez-Lindo, N., van Rooijen, N., de la Rosa, E. J. Microglia-mediated IGF-I neuroprotection in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (12), 9124-9130 (2011).
  6. Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Exp Eye Res. 81 (6), 700-709 (2005).
  7. Geng, Y., et al. Optical properties of the mouse eye. Biomed Opt Express. 2 (4), 717-738 (2011).
  8. Lozano, D. C., Twa, M. D. Development of a rat schematic eye from in vivo biometry and the correction of lateral magnification in SD-OCT imaging. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6446-6455 (2013).
  9. Vaz-Pereira, S., et al. Optical Coherence Tomography Features Of Active And Inactive Retinal Neovascularization In Proliferative Diabetic Retinopathy. Retina. 36 (6), 1132-1142 (2016).
  10. Kokona, D., Haner, N. U., Ebneter, A., Zinkernagel, M. S. Imaging of macrophage dynamics with optical coherence tomography in anterior ischemic optic neuropathy. Exp Eye Res. , (2016).
  11. Makiyama, Y., et al. Macular cone abnormalities in retinitis pigmentosa with preserved central vision using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. PLoS One. 8 (11), e79447 (2013).
  12. Paques, M., et al. High resolution fundus imaging by confocal scanning laser ophthalmoscopy in the mouse. Vision Res. 46 (8-9), 1336-1345 (2006).
  13. Joshi, R., et al. Spontaneously occurring fundus findings observed using confocal scanning laser ophthalmoscopy in wild type Sprague Dawley rats. Regul Toxicol Pharmacol. 77, 160-166 (2016).
  14. Muraoka, Y., et al. Real-time imaging of rabbit retina with retinal degeneration by using spectral-domain optical coherence tomography. PLoS One. 7 (4), e36135 (2012).
  15. Fischer, M. D., et al. Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography. PLoS One. 4 (10), e7507 (2009).
  16. Bell, B. A., et al. Retinal vasculature of adult zebrafish: in vivo imaging using confocal scanning laser ophthalmoscopy. Exp Eye Res. 129, 107-118 (2014).
  17. Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
  18. Huber, G., et al. Spectral domain optical coherence tomography in mouse models of retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5888-5895 (2009).
  19. Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative Analysis of Mouse Retinal Layers Using Automated Segmentation of Spectral Domain Optical Coherence Tomography Images. Transl Vis Sci Technol. 4 (4), 9 (2015).
  20. Sim, D. A., et al. A simple method for in vivo labelling of infiltrating leukocytes in the mouse retina using indocyanine green dye. Dis Model Mech. 8 (11), 1479-1487 (2015).
  21. Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma. J Vis Exp. (99), e52731 (2015).
  22. Acton, J. H., Cubbidge, R. P., King, H., Galsworthy, P., Gibson, J. M. Drusen detection in retro-mode imaging by a scanning laser ophthalmoscope. Acta Ophthalmol. 89 (5), e404-e411 (2011).
  23. Greenstein, V. C., et al. Structural and functional changes associated with normal and abnormal fundus autofluorescence in patients with retinitis pigmentosa. Retina. 32 (2), 349-357 (2012).
  24. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  25. Wang, X., et al. Requirement for Microglia for the Maintenance of Synaptic Function and Integrity in the Mature Retina. J Neurosci. 36 (9), 2827-2842 (2016).
  26. Ebneter, A., Casson, R. J., Wood, J. P., Chidlow, G. Microglial activation in the visual pathway in experimental glaucoma: spatiotemporal characterization and correlation with axonal injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (12), 6448-6460 (2010).
  27. Ebneter, A., Kokona, D., Schneider, N., Zinkernagel, M. S. Microglia Activation and Recruitment of Circulating Macrophages During Ischemic Experimental Branch Retinal Vein Occlusion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 944-953 (2017).
  28. Lin, Y. L., Potter-Baker, K. A. Using theoretical models from adult stroke recovery to improve use of non-invasive brain stimulation for children with congenital hemiparesis. J Neurophysiol. , (2017).
  29. Combadiere, C., et al. CX3CR1-dependent subretinal microglia cell accumulation is associated with cardinal features of age-related macular degeneration. J Clin Invest. 117 (10), 2920-2928 (2007).
  30. Bermudez, M. A., et al. Time course of cold cataract development in anesthetized mice. Curr Eye Res. 36 (3), 278-284 (2011).
  31. Toth, C. A., et al. A comparison of retinal morphology viewed by optical coherence tomography and by light microscopy. Arch Ophthalmol. 115 (11), 1425-1428 (1997).
  32. Ebneter, A., Kokona, D., Jovanovic, J., Zinkernagel, M. S. Dramatic Effect of Oral CSF-1R Kinase Inhibitor on Retinal Microglia Revealed by In Vivo Scanning Laser Ophthalmoscopy. Transl Vis Sci Technol. 6 (2), 10 (2017).
  33. Gabriele, M. L., et al. Reproducibility of spectral-domain optical coherence tomography total retinal thickness measurements in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (12), 6519-6523 (2010).
  34. Nakao, S., et al. Wide-field laser ophthalmoscopy for mice: a novel evaluation system for retinal/choroidal angiogenesis in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5288-5293 (2013).
  35. Wang, N. K., et al. Origin of fundus hyperautofluorescent spots and their role in retinal degeneration in a mouse model of Goldmann-Favre syndrome. Dis Model Mech. 6 (5), 1113-1122 (2013).
  36. Wang, N. K., et al. Cellular origin of fundus autofluorescence in patients and mice with a defective NR2E3 gene. Br J Ophthalmol. 93 (9), 1234-1240 (2009).
  37. Thanos, S. Sick photoreceptors attract activated microglia from the ganglion cell layer: a model to study the inflammatory cascades in rats with inherited retinal dystrophy. Brain Res. 588 (1), 21-28 (1992).
  38. Hughes, E. H., et al. Generation of activated sialoadhesin-positive microglia during retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (5), 2229-2234 (2003).

Tags

Медицина выпуск 129 микроглии сетчатки оптическая когерентная томография сканирование лазерная офтальмоскопия в естественных условиях изображений офтальмологии
<em>В естественных условиях</em> Визуализация <em>Cx3cr1<sup>gfp/gfp</sup> </em> репортер мышей с спектральные домена оптическая когерентная томография и сканирование лазерная офтальмоскопия
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kokona, D., Jovanovic, J., Ebneter,… More

Kokona, D., Jovanovic, J., Ebneter, A., Zinkernagel, M. S. In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy. J. Vis. Exp. (129), e55984, doi:10.3791/55984 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter