Summary
Questo protocollo descrive come ad alta definizione tecniche di imaging come la tomografia ottica di coerenza di dominio spettrale e scansione laser oftalmoscopia può essere utilizzata in piccoli roditori, utilizzando un sistema di piattaforma di imaging oftalmico, per ottenere informazioni su lo spessore retinico e microglial cellula distribuzione, rispettivamente.
Abstract
Tomografia a coerenza ottica dominio spettrale (SD-OCT) e oftalmoscopia di scansione laser (SLO) sono ampiamente utilizzati in Oftalmologia sperimentale. Nel presente protocollo, topi che esprimono verde proteina fluorescente (gfp) sotto il promotore di Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) sono stati utilizzati per immagine microglia cellule in vivo nella retina. Le microglia sono macrofagi residenti della retina e sono stati implicati in diverse patologie retiniche1,2,3,4,5,6. Questo protocollo fornisce un approccio dettagliato per la generazione di retinica B-Scan, con SD-OCT e la formazione immagine di distribuzione delle cellule di microglia in topi Cx3cr1gfp/gfp con SLO in vivo, utilizzando un sistema di piattaforma di imaging oftalmico. Il protocollo può essere utilizzato in diverse linee di reporter del mouse. Tuttavia, esistono alcune limitazioni del protocollo presentato qui. In primo luogo, sia SLO e SD-OCT, quando usato in modalità ad alta risoluzione, raccogliere dati con alta risoluzione assiale ma la risoluzione laterale sono più bassi (3,5 µm e 6 µm, rispettivamente). Inoltre, il livello di messa a fuoco e saturazione in SLO è fortemente dipendente dalla selezione dei parametri ed il corretto allineamento dell'occhio. Inoltre, utilizzando dispositivi progettati per pazienti umani in topi è impegnativo a causa della maggiore potenza totale ottica dell'occhio del mouse rispetto all'occhio umano; Questo può portare a laterale ingrandimento imprecisioni7, che dipendono anche l'ingrandimento con la lente del mouse tra gli altri. Tuttavia, nonostante che la scansione assiale posizione dipende dall'ingrandimento laterale, le misurazioni di SD-OCT assiale sono accurati8.
Introduction
In Oftalmologia sperimentale, l'esame di patologia retinica viene solitamente valutato utilizzando tecniche istologiche. Tuttavia, l'istologia richiede euthanization animale e può causare alterazione per le proprietà effettive del tessuto. SD-OCT e SLO sono abitualmente utilizzati in Oftalmologia clinica a fini diagnostici e per il monitoraggio delle diverse patologie retiniche quali l'edema maculare diabetico9, neuropatia ottica ischemica anteriore10o retinite pigmentosa11 . SD-OCT e SLO sono tecniche non invasive che generano immagini ad alta risoluzione della retina, che sono visualizzati attraverso la pupilla dilatata senza ulteriori interventi. SD-OCT fornisce informazioni della struttura retinica e lo spessore retinico raccogliendo dati di retrodiffusione per creare immagini a sezione trasversale della retina, mentre SLO raccoglie i dati di fluorescenza per produrre immagini stereoscopiche ad alto contrasto della retina. Al giorno d'oggi, entrambe le tecniche sono sempre più utilizzate in Oftalmologia sperimentale utilizzando piccoli roditori12,13,14,15 (o anche zebrafish16,17) e può fornire sia informazioni qualitative e quantitative12,17,18,19,20,21.
Accumulo di fluorofori endogeni come lipofuscine o la formazione di drusen nella retina possa essere visualizzata da SLO come segnale fluorescente automatico. Questa caratteristica rende SLO una tecnica importante per la diagnosi e il monitoraggio delle patologie retiniche come la degenerazione maculare senile o retinite pigmentosa22,23. In Oftalmologia sperimentale, fluorescenza auto imaging (AF) può essere utilizzato per il rilevamento di tipi cellulari specifici nelle linee di reporter del mouse. Ad esempio, topi eterozigoti per l'espressione della gfp sotto il promotore di Cx3cr124 sono vantaggiosi per la visualizzazione in vivo di cellule microgliali nella retina normale e per l'indagine di microglia/macrofagi dinamica nella malattia retinica21. Le microglia sono i macrofagi residenti della retina, che svolgono un ruolo cruciale su omeostasi tissutale e riparazione tissutale su lesioni1,25,26. Attivazione della microglia nella retina è stata segnalata in lesione retinica, l'ischemia e la degenerazione, suggerendo un ruolo di queste cellule nella malattia retinica2,3,4,5, 6.
L'obiettivo del presente protocollo è di descrivere un metodo relativamente semplice per l'imaging retinico e misurazione dello spessore retinico con SD-OCT e per la visualizzazione delle cellule di microglia positivo di gfp nel mouse retina utilizzando Cx3cr1gfp/gfp SLO (sistema di Heidelberg Spectralis HRA + OCT). Questo protocollo può essere utilizzato per misure di imaging e spessore delle retine sane o malate in varie linee del mouse. Inoltre, le analisi morfometriche possono essere eseguite per l'identificazione e la quantificazione dei numeri di microglia e attivazione di microglia nella retina utilizzando SLO21. Cellule di microglia sono associate con malattie degeneranti nel sistema nervoso centrale (CNS), compreso la retina27,28,29. Così, combinando i due metodi utilizzati nel presente protocollo, correlazione della distribuzione di microglia e degenerazione retinica può essere fatto, che può facilitare il monitoraggio la gravità della malattia o l'efficacia di terapeutica si avvicina in vivo.
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Protocol
in tutte le procedure, topi BALB/c adulti maschi e femminili che esprimono gfp sotto il promotore di Cx3cr1 erano usate 24. Topi sono stati trattati secondo la dichiarazione di ARVO per l'uso degli animali in oftalmica e Vision Research e tutte le procedure sono state approvate dal governo svizzero secondo la normativa federale svizzero sul benessere degli animali. Topi sono stati anestetizzati da un'iniezione sottocutanea di medetomidina cloridrato (0,75 mg/kg) e ketamina (45 mg/kg). L'anestesia adeguata è stata confermata mediante il monitoraggio della frequenza respiratoria e l'animale ' riflesso di s contro un pizzico di coda. Alla fine degli esperimenti, i topi sono stati eutanasizzati con inalazione di CO 2.
Nota: eseguire ogni sessione di imaging più rapidamente possibile (massimo 20 min), poiché la formazione di cataratta anestesia seguente può ostacolare la visualizzazione della retina 30.
1. configurazione del sistema
- accendere il computer.
- Attivare l'alimentazione elettrica. Il messaggio " inizio modulo di acquisizione " appariranno sulla schermata Pannello di controllo del dispositivo.
- Fare doppio clic sul collegamento sul desktop del software per funzionare il software.
- La visualizzazione del database, scegliere il " aggiungere paziente " icona.
- Nella finestra pop-up, inserire tutte le informazioni necessarie (nome, cognome, titolo, data di nascita, sesso e paziente-ID) e fare clic su " ok ". La finestra pop impostare la curvatura cornea a 2 mm e fare clic su " ok ".
- Posizionare una 78D standard oftalmico senza contatto fessura lampada lente davanti l'ottica standard 30 ° e fissarlo in modo sicuro con del nastro adesivo.
- Assicurarsi che la leva di filtro sulla sinistra del dispositivo è posizionata sull'indicazione " A " per consentire sia IR + OCT e AF di immagine ( Figura 1).
2. Preparazione del mouse
- uso una dose di medetomidina cloridrato di 0,75 mg/kg e un ketamina dose di 45 mg/kg in soluzione tampone fosfato (PBS, pH 7.4) per preparare la soluzione di anestesia. Così, per un mouse 20g, mescolare 15 µ l di medetomidina cloridrato con 18 µ l di ketamina ad un volume finale di 50 µ l di PBS. Conservare la soluzione a 4 ° C fino a una settimana.
- Afferrare il mouse per la collottola e applicare una goccia di tropicamide 0,5% + fenilefrina cloridrato 2,5% su ogni occhio per ottenere la dilatazione della pupilla.
- Tenere il mouse trattenuto e con una siringa da insulina associata ad un ago 30g, iniettare per via sottocutanea 50 µ l della soluzione anestesia. Mettere il mouse indietro nella sua gabbia che è posto sopra una piastra elettrica. Attendere 3-5 min fino a quando il mouse è completamente sedato. Per valutare la profondità anestetica, pizzicare la coda del mouse. Controllare il riflesso corneale toccando delicatamente la cornea del mouse con un batuffolo di cotone. Se non si è osservato nessun riflesso positivo, continuare con l'imaging.
Nota: È importante monitorare la frequenza respiratoria durante l'anestesia. Se il mouse non è completamente sedato, la frequenza respiratoria aumenterà a uno stimolo doloroso. - Idrato la cornea mouse con un'applicazione di 2% idrossipropilmetilcellulosa gocce su ogni occhio.
3. SD-OCT
- inserire una patch di riscaldamento di circa 32 ° C sulla piattaforma su misura attaccata sul resto di mento del dispositivo ( Figura 1).
- All'immagine l'occhio destro, posizionare il mouse sulla parte sinistra della piattaforma ( Figura 1). Assicurarsi che la giusta orbita del mouse si trova di fronte la lente e il suo corpo si trova incline sulla parte sinistra della piattaforma.
- Applicare una goccia di idrossipropilmetilcellulosa sull'occhio di destra e posizionare attentamente una lente a contatto + 4 diottrie rigida gas permeabile su di esso (potenza sferica:-25.00 a +25,00 diottrie). Conservare le lenti a contatto in soluzione salina bilanciata (BSS). Per afferrare la lente, utilizzare pinze di plastica o silicone per evitare danni.
- Premere la scatola gialla nell'angolo destro del display del pannello di controllo per avviare il modulo di acquisizione (scatola verde sulla Figura 2A). La scatola gialla diventa verde e il menu del pannello di controllo verrà visualizzato sullo schermo ( Figura 2A).
- Per l'acquisizione di B-Scan, selezionare l'opzione IR + OCT sul pannello di controllo ( Figura 2A). Le impostazioni selezionate sono evidenziate in blu sul pannello di controllo.
- Selezionare " Retina " sotto " applicazione e struttura " nel software e spostare l'obiettivo verso l'occhio del mouse utilizzando il micromanipolatore sul dispositivo ( Figura 1). Prima messa a fuoco sulla retina, controllare che l'indicazione " OD " è selezionata nella parte inferiore sinistra dello schermo. Il software identifica automaticamente la sinistra (OS) e l'occhio destro (OD) basato sulla posizione dell'obiettivo.
Nota: Se l'obiettivo è posizionato al centro della piattaforma, verrà visualizzato un messaggio di errore nella parte inferiore dello schermo. In tal caso, ri-posizionare il mouse leggermente fino a quando il software riconosce l'occhio corretta. - Con la manopola di messa a fuoco, fuoco sulla retina fino a grossi vasi appaiono chiaramente nell'immagine del fondo sulla sinistra dello schermo del computer. Spostare la fotocamera ruotando il micromanipolatore sinistra o destra, per muovere la telecamera in quella direzione, o in senso orario o in senso antiorario, per spostare la telecamera su o giù, rispettivamente.
Nota: Riposizionare il mouse sulla piattaforma o spostare l'obiettivo verso l'alto o verso il basso per raggiungere la localizzazione preferita della testa del nervo ottico nell'immagine termografica. - Girare la manopola della sensibilità in senso antiorario per ridurre o in senso orario per aumentare la luminosità dell'immagine del fondo. Quando viene raggiunta la messa a fuoco ottima, un SD-OCT B-scan apparirà sulla destra dello schermo.
Nota: Se la B-scan non possono essere visualizzate regolando la messa a fuoco, premere la combinazione Ctrl + Alt + Maiusc + O sulla tastiera. Nella finestra a comparsa, regolare il valore del braccio di riferimento fino a quando sullo schermo appare la B-scan. - Sulla parte inferiore destra dello schermo, scegliere la singola scansione dal menu modello (singola riga nella Figura 2B).
- Girare il micromanipolatore del dispositivo ( Figura 1) sinistra, destra, avanti o indietro (per accendere la fotocamera in quella direzione) per garantire che la B-scan si trova tra la parte superiore e inferiore angoli di SD-OCT scansione finestra.
- Impostare il valore automatico in tempo reale (arte) di almeno 9 per ottenere immagini di alta qualità.
Nota: Arte migliora la qualità dell'immagine calcolando varie scansioni consecutive. Più alto il " ART " valore, più alto il rapporto segnale-rumore e quindi la qualità dell'immagine. Tuttavia, aumentando il " ART " valore, l'acquisizione di tempo inoltre è aumentata. - Premere il " acquisire " pulsante ( Figura 2) sullo schermo del pannello di controllo e acquisizione delle immagini.
- Ri-posizionare il mouse per l'occhio sinistro di immagine e ripetere i passaggi 3.2-3.12.
- Rimuovere la lente a contatto con le pinzette di plastica/silicone e inserirlo BSS.
- Idratare la cornea del mouse con una fresca goccia di idrossipropilmetilcellulosa e rimuovere l'eccesso con una velina.
- Rimuovere l'ottica standard 30 ° ruotandolo in senso antiorario.
- Montare l'obiettivo di 55 ° e ripetere i passaggi 3.4-3.12 per ogni occhio.
4. Auto fluorescenza Imaging
- senza spostare il mouse sulla piattaforma, selezionare IR sul pannello di controllo.
- Con la manopola di messa a fuoco, concentrarsi su grandi vasi retinici.
- Il pannello di controllo selezionare AF.
- Ruotare la manopola della sensibilità in senso antiorario per ridurre o in senso orario per aumentare la luminosità dell'immagine.
- Premere la manopola della sensibilità e impostare il " ART " valore di 67 o più per ottenere alta qualità immagini.
- Quando il set " arte " è stato raggiunto il valore, premere " acquisire " sul pannello di controllo per acquisire l'immagine. Premere la manopola di sensibilità per interrompere una media. Regolare la messa a fuoco, per visualizzare i diversi strati retinici.
- Rimuovere la lente 55° e montare l'obiettivo di 102° ampio campo. Attenersi alla seguente procedura 4.1 – 4.6 per entrambi gli occhi di ogni mouse e per ogni mouse.
- Clic “ salvare le immagini ” sul bordo superiore sinistro della finestra e quindi fare clic su “ uscita ”. Per salvare le immagini nel computer, selezionare il mouse dall'elenco nella parte destra dello schermo facendo doppio clic sul nome del mouse. Fare doppio clic su ogni immagine separatamente e quindi fare clic sull'icona del disco floppy. Salvare l'immagine come TIF, BMP,. jpg o. png nella cartella desiderata. Per uscire premere software “ File ” e “ uscire ”.
5. Inversione di anestesia
- idratare gli occhi del mouse con una goccia di idrossipropilmetilcellulosa e restituire il mouse su un termoforo.
- Soluzione di atipamezolo Prepare in una dose di 2,25 mg/kg per invertire gli effetti sedativi di medetomidina cloridrato. Per un mouse 20g, aggiungere 9 µ l di atipamezol in un volume finale di 150 µ l PBS. Conservare la soluzione a 4 ° C fino a una settimana.
- min dopo l'iniezione di anestesia (punto 2.2), iniettare per via sottocutanea 150 µ l di soluzione di atipamezolo.
- Monitorare il mouse fino al recupero dall'anestesia. Quando il mouse è completamente recuperato (5-10 min dopo l'iniezione di atipamezolo) rimetterlo nella sua gabbia. Recupero è indicato per la capacità dell'animale di trasformare il suo corpo quando posto su un lato, ricupero di camminare attività e di reagire in risposta alla stimolazione ambientale.
6. Misura di spessore retinico manuale da SD-OCT immagini
- aprire la scansione OCT facendo doppio clic sul nome dell'animale.
- Aprire il B-scan ottenute con la lente di 30 ° o 55 °.
- Scegli " profilo spessore ".
- Premere il " modificare Layer segmentazioni " icona ( Figura 2B). Il software automaticamente identifica la limitazione interna e base membrana.
- Se necessario, correggere manualmente la posizione di limitazione interna e base della membrana. A tale scopo, scegliere il livello da modificare dal lato sinistro dello schermo e quindi l'opzione cerchio rosso ( Figura 2B). Spostare il cerchio con il pulsante del mouse premuto per modificare la riga.
- Modificare la riga per posizionare correttamente il livello corrispondente. Fare clic su " salvare e chiudere " per uscire dalla finestra.
Nota: A causa della riflettività della coroide, il software può identificare la membrana base in modo non corretto. Pertanto, è preferibile definire manualmente prima di procedere con le misurazioni dello spessore retinico. - Scegli " Retina " sotto il " strato " opzione. Un diagramma di spessore retinico appariranno sulla parte inferiore dello schermo.
- Fare clic su una posizione diversa del diagramma o su B-scan per visualizzare lo spessore retinico (indicato in µm) per la posizione selezionata.
- Misurare lo spessore retinico la distanza desiderata dalla testa del nervo ottico e copiare i valori in un foglio di calcolo.
- Ripetere i passaggi da 5,1-5,9 per ogni mouse per sia il 30 ° e la lente di 55 °.
- Eseguire analisi statistica con software desiderato.
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Representative Results
Utilizzando il protocollo presentato qui, SD-OCT analizza e SLO immagini sono state ottenute da topi Cx3cr1gfp/gfp nella stessa sessione di imaging. Figura 3 include rappresentante SD-OCT singole scansioni ottenute con un 30 ° o una lente di 55 ° (Figura 3A) e rappresentante SLO immagini ottenute con un 55 ° o una lente di 102 °, dove sono visualizzate le cellule di microglia positivo di gfp. Più alta riflettività della coroide è osservata in SD-OCT scansioni ottenute con la 30 ° rispetto all'obiettivo di 55 °. Tuttavia, architettura retinica è chiaro sia il 30 ° e le immagini di 55 ° (Figura 3, destra immagini ingrandite). Dopo correzioni manuali dei confini della retina (limitazione interna e della membrana di base), una buona correlazione delle misurazioni dello spessore retinico è stata osservata fra la 30 o e l'obiettivo 55 ° quando si misura nella stessa distanza dalla testa del nervo ottico ( Figura 3; Correlazione di Pearson = 0,967, p < 0,0001). Studi precedenti hanno dimostrato che le misurazioni dello spessore retinico su SD-OCT scansioni correlano bene con misure ex vivo su sezioni istologiche retinica15,31 e così SD-OCT sono utilizzabili come una tecnica non-invasiva per le misurazioni dello spessore retinico. Utilizzando SLO, potremmo identificare cellule di microglia positivo di gfp come hyperreflective segnale nelle immagini fluorescenti auto, tuttavia l'obiettivo di 102 ° ampio campo era in grado di coprire un'area più ampia del fondo rispetto all'obiettivo di 55 °. SLO può essere utilizzato anche per il monitoraggio della distribuzione di cellule di microglia retinica e l'attivazione in topi reporter con un recettore funzionale fractalchina (Cx3cr1gfp / + topi) nella retina normale o malati12, 21,32. La combinazione di SD-OCT con SLO nella stessa sessione di imaging può fornire informazioni sulla distribuzione di microglia e attivazione su degenerazione retinica e potrebbe essere utile per il monitoraggio di patologie retiniche in topi21.
Figura 1: immagine rappresentativa del dispositivo utilizzato nel presente studio. Per realizzare l'immagine l'occhio destro del mouse, il mouse è posizionato sulla parte sinistra della piattaforma su misura con la sua orbita destra rivolto verso l'obiettivo e il suo corpo sdraiato incline sulla parte sinistra della piattaforma. L'altezza della piattaforma può essere regolata ruotando in senso orario (per abbassare la pedana) o in senso antiorario (per sollevare la piattaforma) la "regolazione di resto di mento". La leva del filtro deve essere posizionata alla "A" per consentire imaging IR + OCT e AF. Con la manopola di messa a fuoco (non visibile in figura), lo sperimentatore può cambiare la messa a fuoco dello scanner. Il micromanipolatore può essere utilizzato per illuminare correttamente e di allineare la retina per immagini di alta qualità. L'obiettivo può essere spostato in alto, in basso, a destra, o lasciato per l'impugnatura della fotocamera. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: illustrazione del pannello di controllo del dispositivo. (A) sulla parte sinistra del display del pannello di controllo possono essere selezionate le modalità di acquisizione (infrarossi, IR; fluorescenza auto, AF o verde di indocianina, ICGA; combinato o non con tomografia a coerenza ottica, OCT). Sulla parte centrale del pannello l'impostazione di acquisizione possa essere scelti (intensità delle scansioni se immagine, sezione o volume). Il campo visivo è determinato dalla lente caricata. Con la manopola della sensibilità può essere regolata la luminosità dell'immagine IR o AF. Premendo la manopola di sensibilità, il software si avvia in media le immagini ottenute in IR o AF per fornire un'immagine di alta qualità. (B) illustrazione del menu modello di acquisizione. (C) sintesi delle funzioni utilizzate nel software con l'icona corrispondente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: OCT analizza e auto immagini fluorescenti delle retine del mouse Cx3cr1gfp/gfp . (A) B-scansioni della retina di topo ottenuti con un 55 ° (pannello superiore) o una lente 30 ° (pannello inferiore). Ingrandimenti superiori delle caselle gialle sono presentati sul pannello di destra. (B) immagini di cellule di microglia positivo di gfp nelle retine di topi Cx3cr1gfp/gfp , ottenuti con un 55 ° e una lente di 102 ° (destra e sinistra pannelli, rispettivamente). (C) misure di spessore retinico, misurati sulla stessa distanza dalla testa del nervo ottico, sulle esplorazioni di SD-OCT derivati dalla lente 30 ° e 55 °. Una buona correlazione è stata osservata fra le due lenti (la correlazione di Pearson = 0,967). Scala bar: 200 µm, 100 µm su immagini ingrandite di SD-OCT (un, pannello di destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il presente articolo viene illustrato un protocollo per l'acquisizione di B-scansioni della retina e l'imaging di gfp positivo microglia distribuzione nella retina di topo nella stessa sessione di imaging. SD-OCT e SLO sono sempre più utilizzati nei modelli animali della malattia retinica per fornire informazioni di alterazioni retiniche sopra tempo10,14,17,18,21. Con questo protocollo, Cx3cr1gfp/gfp o Cx3cr1gfp / + retina di topo può essere imaged in modo non invasivo e informazioni di spessore retinico possono essere ottenuti. Ciò è estremamente importante nei modelli sperimentali di malattia della retina, dove la gravità della malattia varia nel tempo o quando trattamenti terapeutici sono testati. Inoltre, il protocollo descrive come linee di reporter del mouse possono essere utilizzati per l'imaging in vivo di cellule fluorescenti nella retina.
Tuttavia, il protocollo presentato qui ha alcune limitazioni. In primo luogo, la formazione immagine della retina di topo in dispositivi progettati per gli esseri umani può essere impegnativa a causa della superiore potenza totale ottica dell'occhio del mouse, che può portare al laterale ingrandimento imprecisioni7. Tuttavia, le misurazioni di SD-OCT assiale sono accurati8. Inoltre, esame di follow-up nei topi utilizzando l'opzione "Imposta riferimento" del software è piuttosto difficile a causa della posizione non fissa del mouse sulla piattaforma e così formazione immagine longitudinale delle retine del mouse può essere impegnativa. L'allineamento longitudinale dell'occhio può essere realizzato posizionando il nervo ottico al centro dell'immagine a infrarossi e quindi acquisire le immagini desiderate. Al fine di correggere per la rotazione dell'occhio, allineamenti manuali delle immagini SD-OCT en viso possono essere eseguiti dopo l'acquisizione e applicano le misure di spessore come descritto altrove33. Oltre al sistema di imaging utilizzato nel presente protocollo, altri sistemi di imaging sono anche stati sviluppati che forniscono un angolo maggiore e può immagine una più grande zona della retina senza l'utilizzo della lente a contatto. Optos ad esempio in grado di coprire una maggiore superficie retinica ma con una maggiore variabilità di immagine rispetto al dispositivo utilizzato nel presente studio34. Nonostante queste limitazioni, il presente protocollo può essere utilizzato in diversi modelli sperimentali di malattia retinica. Le informazioni che possono essere ottenute includono alterazioni dello spessore retinico (gonfiore, atrofia), rilevamento del distacco di retina o la presenza di puntini hyperreflective e cellule fluoroforo e l'aumento o la diminuzione del loro numero.
Combinazione dei due metodi nei topi eterozigoti per l'espressione di Cx3cr1 (Cx3cr1gfp / +), che hanno un recettore funzionale fractalchina, consente lo sperimentatore rilevare contemporaneamente nel vivo alterazioni dell'integrità della retina in tempo reale e possibile accumulo di microglia in prossimità di anomalie retiniche (ad es., retinica gonfiore, atrofia retinica) durante malattia retinica o lesioni. Inoltre, applicando l'analisi morfometrica, stato di attivazione della microglia può essere valutato sulla base delle dimensioni di soma e complessità di microglia processi21. Nelle malattie retiniche, quali l'occlusione della vena retinica, l'attivazione e l'accumulo di microglia/macrofagi sui siti atrofiche retiniche sono state osservate27. Inoltre, nei topi difettoso per il gene Nr2e3 (nucleare recettore sottofamiglia 2 gruppo E membro 3), un modello murino di recessively ereditato migliorato la sindrome da sensibilità S-coni (CES), lo strato nucleare esterno pieghevole (rosette) può essere osservato a presto giorni postnatali.
Interessante, cellule di microglia possono essere trovate all'interno delle rosette ed è stato suggerito che microglia potrebbe contribuire alla degenerazione dei fotorecettori osservato nelle retine di questi topi35,36. Poiché l'attivazione della microglia sono stati implicati nel corso di una varietà di malattie della retina e a volte è accompagnata da alterazioni retiniche architettura10,27,37,,38 , la combinazione di SD-OCT e SLO può rivelare correlazioni tra attivazione microgliale e degenerazione retinica. Nonostante alcuni problemi, il presente protocollo può fornire tali informazioni longitudinalmente, e così sarebbe prezioso per la correlazione di danno retinico con distribuzione/attivazione di microglia e per il monitoraggio del trattamento terapeutico efficacia21.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da un grant della Swiss National Science Foundation (FNS; #320030_156019). Gli autori hanno ricevevano assistenza non finanziaria da Heidelberg Engineering GmBH, Germania.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spectralis Imaging system (HRA+OCT) | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | ophthalmic imaging platform system |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | Version 1.9.13.0 |
| 78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lens | Volk Optical Inc., Ohio, USA | V78C | |
| Spectralis wide angle 55° lens | Heidelberg Engineering, Germany | 50897-002 | |
| ultra widefield 102° lens | Heidelberg Engineering, Germany | 50117-001 | |
| medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor) | Provet AG, Lyssach, Switzerland | Swissmedic Nr. 50'590 - ATCvet: QN05CM91 | anesthetic/analgesic |
| ketamine 50mg/ml (Ketalar) | Parke-Davis, Zurich, Switzerland | 72276388 | anesthetic |
| tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix) | ISPI, Bern, Switzerland | N/A | pupil dilation |
| Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mm | B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Straße, Germany | 9151125 | |
| hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%) | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | N/A | |
| +4 dpt rigid gas permeable contact lens | Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY | N/A | Base Curve: 7.20 to 8.40 mm Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm Power: -25.00 to +25.00 Diopters |
| balanced salt solution (BSS) | Inselspital, Bern, Switzerland | N/A | |
| silicon forceps | N/A | N/A | |
| atipamezole 5 mg/mL (Antisedan) | Provet AG, Lyssach, Switzerland | N/A | α2 adrenergic receptor antagonist |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA | N/A | statistical analysis software |
References
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