وهناك طريقة لتقييم بكتريوسين الآثار على الأمعاء الدقيقة من الفئران
Summary
ويعتقد أن البكتيريا تلعب دورا رئيسيا في تعريف التنوع الميكروبي في مختلف المنافذ الإيكولوجية. هنا، نحن تصف إجراء فعال لتقييم كيفية البكتيريا تؤثر على الأمعاء تكوين الميكروبيوتا في نموذج حيواني.
Abstract
أسئلة مثيرة للاهتمام جدا تنشأ مع تقدمنا المعرفة حول الأمعاء تكوين الميكروبات الحيوية والعلاقة مع الصحة، لا سيما فيما يتعلق بالعوامل التي تسهم في الحفاظ على التوازن السكاني. ومع ذلك، هناك منهجيات محدودة المتاحة لتقييم هذه العوامل. البكتيريا هي الببتيدات المضادة للميكروبات التي تنتجها العديد من البكتيريا التي قد تمنح ميزة تنافسية للحصول على الغذاء و / أو إنشاء المتخصصة. العديد من سلالات حمض اللاكتيك بروبيوتيك (لاب) سلالات لديها إمكانات كبيرة لتعزيز صحة الإنسان والحيوان عن طريق منع نمو مسببات الأمراض. ويمكن أيضا أن تستخدم للتحوير المناعي، لأنها تنتج البكتيريا. ومع ذلك، فإن النشاط العدائي للبكتريوسينات يتم تحديده عادة من خلال الاختبارات البيولوجية المختبرية في ظل ظروف محددة جيدا ولكن مفرطة في التبسيط مقارنة ببيئة الأمعاء المعقدة في البشر والحيوانات، حيث تواجه البكتيريا تأثيرات متعددة العوامل من المضيف ومئات الأنواع الميكروبية sهارينغ نفس المتخصصة. يصف هذا العمل إجراء كامل وفعال لتقييم التأثير من مجموعة متنوعة من البكتيريا مع مختلف الخصائص المستهدفة في نظام الفئران. يتم رصد التغييرات في تكوين الكائنات الحية الدقيقة خلال العلاج بكتيريوسين باستخدام التركيب 16S ردينا التسلسل. يستخدم نهجنا كلا من منتجي البكتريوسين و المسوخ التي تنتجها غير البكتريوسين المنتجة، وهذا الأخير يعطي القدرة على التمييز بين البكتريوسين ذات الصلة من التعديلات ذات الصلة غير البكتريوسين من الجراثيم. استخلاص الحمض النووي البراز وطرق التسلسل 16S ردينا هي متسقة، جنبا إلى جنب مع المعلوماتية الحيوية، تشكل إجراء قوي لإيجاد تغييرات باهتة في التشكيلات البكتيرية وإقامة الارتباطات، من حيث تركيز الكوليسترول والثلج الثلاثية، بين السكان البكتيرية وعلامات الصحة. بروتوكول لدينا هو عام، وبالتالي يمكن استخدامها لدراسة المركبات الأخرى أو العناصر الغذائية مع القدرة على تغيير ميكروفون المضيفتكوين الروبيوتا، إما عند دراسة السمية أو الآثار المفيدة.
Introduction
البكتيريا هي الببتيدات المضادة للميكروبات التي تنتجها مجموعة واسعة من الأنواع البكتيرية 1 ، 2 . وقد تم استكشاف هذه المركبات ومنتجيها، وخاصة لاب، واستغلالها في جميع أنحاء العالم لعقود لتطبيقاتها المحتملة في حفظ الأغذية والطب 3 . ومن المعروف أن العديد من البكتيريا لقتل مسببات الأمراض الهامة، بما في ذلك أنواع الليستيريا، المعوية، المكورات العنقودية، وعصية . بعض البكتيريا حتى لديهم القدرة على تعديل الاستجابة المناعية 4 . العديد من البكتيريا لديها أطياف ضيقة نسبيا، وهي الملكية التي هي محل تقدير كبير في بعض التطبيقات. على سبيل المثال، بعض البكتيريا الضيقة الطيف يمكن استخدامها لتوجيه نشاط معين ضد مجموعات مختارة من البكتيريا إشكالية، دون الكثير من الاضطراب على النباتات كومنزال أو مفيدة تقاسم نفس مكانة؛ وهذا أمر ضروري خاصة في إنفير الأمعاء، حيث العديد من الميكروبات المفيدة تزدهر بطريقة تفاعلية وديناميكية 5 . البكتيريا هي أيضا جذابة جدا للاستخدام الوقائي أو بروبيوتيك، لأنها يمكن أن تقمع (خارج) نمو مسببات الأمراض، باثوبيونتس، أو البكتيريا الانتهازية التي قد عدم التوازن التوازن الأمعاء 6 ، 7 .
من حيث طبيعتها والخصائص الفيزيائية والكيميائية، البكتيريا هي متنوعة جدا، كما أن لديها هياكل مختلفة، والخصوصيات المستهدفة، وطرق العمل، وما إلى ذلك وقد درست معظم البكتيريا في تفاصيل كبيرة في المختبر ، ولكن تم اختبار عدد قليل جدا في الغذاء المصفوفات 8 ، 9 أو في الجسم الحي، كما هو الحال في أمعاء الحيوان 6 ، 10 . الخصائص في المختبر يمكن أن تختلف إلى حد كبير عند تقييمها في الجسم الحي بسبب تعقيد سوبيئة الأمعاء وأيضا للآثار غير المقصودة المفترضة على البكتيريا المفيدة. معظم البروبيوتيك هي لاب. أنها تنتج مجموعة من الأيضات الأخرى، بما في ذلك الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة، والتي من المعروف أن تؤثر على علم وظائف الأعضاء من المضيف، وكذلك لإظهار خصائص مضادة للميكروبات تجاه بعض البكتيريا. لذلك، في حالة سلالات بروبيوتيك التي تنتج البكتيريا، فمن الأفضل لإقامة مقايسات واقعية، مثل الحيوانات السليمة مع الميكروبات الطبيعية.
في هذه الدراسة، ونحن نقدم استراتيجية تسمح لتقييم تأثير سلالات مختلفة البكتريوسين المنتجة، والتي بكتيريوسينز لها أطياف مثبطة مختلفة، على الفئران صحية. وتشمل استراتيجيتنا تغذية الفئران مع المسوخ غير البكتريوجين إيسوجينيك، والتي تمكن من التمايز بين آثار بوسيريوسين بوساطة من الآثار غير البكتريوسين بوساطة. تسلسل 16S ردينا يسمح لمتابعة التغيرات الديناميكية من السكان البكتيرية في القناة الهضمية. الغواصاتالتحليل الإحصائي المتساوي للروابط بين الأنواع البكتيرية وأيضا بين الأنواع البكتيرية والمعلمات الفسيولوجية المقاسة (على سبيل المثال، وزن الجسم، والمعلمات الكيميائية الحيوية في الدم، وما إلى ذلك ). ونحن نعتقد أن البروتوكول المقدم في هذه الدراسة ينطبق أيضا على تطبيقات أخرى بروبيوتيك أو ما قبل الجراثيم بعد دراسة البكتيريا في الحيوانات الحية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تم استخدام الإجراء الموصوف هنا لتحديد ما إذا كانت التغيرات في الجراثيم مرتبطة بالصحة أو العمر. أجزاء مختلفة من البروتوكول هي مهمة، ولكن من بينها، أخذ العينات البراز، واختيار جزء الحمض النووي ليتم تسلسلها وتحليلها، وأداء استخراج الحمض النووي والتحليل بيوانفورم?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يشكروا مبادرة إيا نيلز للعلوم والاستدامة التنسيقية للباحثين (المرجع 017-أبيل-سم-2013). سب و غب-M. بدعم من منحة AGL2015-70487-P من وزارة الاقتصاد والتنافسية الإسبانية. تم دعم أوكو و دبد من قبل برنامج المنح الدراسية الاستراتيجية للبحوث علوم الأغذية من جامعة النرويجية للعلوم الحياة (نمبو) (مشروع 1205051025). ونود أيضا أن نشكر إنماكولادا نوغيرا لمساعدتها مع رعاية الحيوان وأخذ العينات ويسوع ديهيسا لمساعدته مع ضمان توافر المواد المختبرية في منشأة الحيوان. ونحن نقدر أيضا الأستاذ لارس – غوستاف سنيبن على نصيحته بشأن الإحصاءات.
Materials
| Balb/c mice (female) | Harlan | Mice should be 6 – 8 weeks of age | |
| Plastic Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| Brain-Heart-Infusion broth | Conda | 1400.00 | |
| European Bacteriological Agar | Pronadisa | 1800.00 | |
| Agarose D1 Low EEO | Pronadisa | 8010.00 | |
| 1XTAE buffer | Thermo Scientific | 15558042 | |
| MRS broth | Difco | 288130 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| scale | Mettler Toledo | PB602-S | |
| sterile forceps | Levantina de Laboratorios S.L. | 260-3710014 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Hermle | Z383K | |
| sodium chloride | AppliChem Panreac | 121659.1211 | |
| Realpure SSS Kit | Real Life Science Solutions, Durviz, Spain | RBME04 (300 ml) | |
| Isopropanol | AppliChem Panreac | 131090.1611 | |
| Ethanol | AppliChem Panreac | 131086.1214 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter Genomics, USA | A63881 (60 ml) | |
| PerfeCta NGS library quantification kit | Quanta BioSciences, Maryland, USA | 733-2300 | |
| MiSeq v3 reagent kit | Illumina, San Diego, California, USA | MS-102-3003 | |
| Primers for 16S rRNA gene amplification | Primers contain V3-V4 region of bacterial 16S rRNA gene and Illumina overhang adaptors:5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3’ and 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3’ | ||
| Nextera XT Index kit | FC-131-1002 | Indices and Illumina sequencing adaptors | |
| Micropestle for 1.5 ml tubes, Eppendorf / Sigma , Ref. | Sigma | Z317314-1PAK | |
| Glass beads, 0.1 mm diameter | Biospec Products | 11079-101 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609.25 | |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International Inc. | 19-040 | |
| mutanolysin | Sigma | M9901-10KU | |
| lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| proteinase K | Roche | 3115887001 | |
| Rnase A | Sigma | R4875 |
References
- Papagianni, M. Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties: biosynthesis, structure, function, and applications. Biotechnol Adv. 21 (6), 465-499 (2003).
- Gillor, O., Kirkup, B. C., Riley, M. A. . Advances in Applied Microbiology. 54, 129-146 (2004).
- Dzung, B. D., Ingolf, F. N. Ribosomally Synthesized Antibacterial Peptides in Gram Positive Bacteria. Curr Drug Targets. 3 (2), 107-122 (2002).
- Dobson, A., Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C. Bacteriocin Production: a Probiotic Trait?. Appl Environ Microb. 78 (1), 1-6 (2012).
- Li, D., Wang, P., Wang, P., Hu, X., Chen, F. The gut microbiota: A treasure for human health. Biotechnol Adv. 34 (7), 1210-1224 (2016).
- Millette, M., et al. Capacity of Human Nisin- and Pediocin-Producing Lactic Acid Bacteria To Reduce Intestinal Colonization by Vancomycin-Resistant Enterococci. Appl Environ Microb. 74 (7), 1997-2003 (2008).
- Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C. Bacteriocins [mdash] a viable alternative to antibiotics?. Nat Rev Microb. 11 (2), 95-105 (2013).
- Leroy, F., Foulquié Moreno, M. R., De Vuyst, L. Enterococcus faecium RZS C5, an interesting bacteriocin producer to be used as a co-culture in food fermentation. Int J Food Microb. 88 (2-3), 235-240 (2003).
- Ananou, S., et al. Combined effect of enterocin AS-48 and high hydrostatic pressure to control food-borne pathogens inoculated in low acid fermented sausages. Meat Sci. 84 (4), 594-600 (2010).
- Riboulet-Bisson, E., et al. Effect of Lactobacillus salivarius Bacteriocin Abp118 on the Mouse and Pig Intestinal Microbiota. PLoS One. 7 (2), e31113 (2012).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies?. J Pharmacol Pharmacother. 4 (4), 303-306 (2013).
- Umu, &. #. 2. 1. 4. ;. C. O., et al. The Potential of Class II Bacteriocins to Modify Gut Microbiota to Improve Host Health. PLoS One. 11 (10), e0164036 (2016).
- Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nat Meth. 10 (10), 996-998 (2013).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2200 (2011).
- Caporaso, J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Meth. 7 (5), 335-336 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB. Appl Environ Microb. 72 (7), 5069-5072 (2006).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).
- Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naive Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy. Appl Environ Microb. 73 (16), 5261-5267 (2007).
- Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2 – Approximately Maximum-Likelihood Trees for Large Alignments. PLoS One. 5 (3), e9490 (2010).
- Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: a New Phylogenetic Method for Comparing Microbial Communities. Appl Environ Microb. 71 (12), 8228-8235 (2005).
- Faust, K., et al. Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome. PLoS Comput Biol. 8 (7), e1002606 (2012).
- Shannon, P., et al. Cytoscape: A Software Environment for Integrated Models of Biomolecular Interaction Networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 41 (1), e1 (2013).
- Edwards, A. N., Suárez, J. M., McBride, S. M. Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment. J Vis Exp. (79), e50787 (2013).
- Delves-Broughton, J., Blackburn, P., Evans, R. J., Hugenholtz, J. Applications of the bacteriocin, nisin. Antonie Van Leeuwenhoek. 69 (2), 193-202 (1996).
- Allende, A., et al. Growth and bacteriocin production by lactic acid bacteria in vegetable broth and their effectiveness at reducing Listeria monocytogenes in vitro and in fresh-cut lettuce. Food Microb. 24 (7-8), 759-766 (2007).
- Strompfová, V., Lauková, A. In vitro study on bacteriocin production of Enterococci associated with chickens. Anaerobe. 13 (5-6), 228-237 (2007).
- Caballero-Guerrero, B., Jiménez Díaz, R., Maldonado-Barragán, A., Ruiz-Barba, J. L. Coculture with specific bacteria enhances survival of Lactobacillus plantarum NC8, an autoinducer-regulated bacteriocin producer, in olive fermentations. Food Microb. 27 (3), 413-417 (2010).
- Drider, D., Fimland, G., Héchard, Y., McMullen, L. M., Prévost, H. The Continuing Story of Class IIa Bacteriocins. Microb. Mol Biol Rev. 70 (2), 564-582 (2006).
- Gao, Y., Jia, S., Gao, Q., Tan, Z. A novel bacteriocin with a broad inhibitory spectrum produced by Lactobacillus sake C2, isolated from traditional Chinese fermented cabbage. Food Control. 21 (1), 76-81 (2010).
