Summary
Combinación de ivacaftor y ivacaftor lumacaftor son dos nuevos fármacos de CF. Sin embargo, todavía hay una carencia de entendimiento sobre su PK/PD y farmacología. Presentamos una técnica de HPLC-MS optimizada para el análisis simultáneo de ivacaftor y sus principales metabolitos y lumacaftor.
Abstract
Defectos en el regulador de conductancia trans membrana de fibrosis quística (CFTR) son la causa de la fibrosis quística (FQ), una enfermedad con manifestaciones pulmonares mortales. El ivacaftor (IVA) y combinación de ivacaftor-lumacaftor (LUMA) son dos nuevos medicamentos avance CF que modulan directamente la actividad y el tráfico de la proteína CFTR defectuosa. Sin embargo, todavía hay una falta de entendimiento en los parámetros farmacocinéticos/farmacodinámicos y la farmacología de ivacaftor y lumacaftor. La técnica de HPLC-MS para el análisis simultáneo de las concentraciones de ivacaftor, hidroximetil-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate y lumacaftor en fluidos biológicos en pacientes que reciben la combinación estándar de ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor la terapia ha sido desarrollada por nuestro grupo y validado parcialmente a las normas de la FDA. Sin embargo, para permitir el análisis de alto rendimiento de un mayor número de muestras de pacientes, nuestro grupo ha optimizado el método divulgado a través de una columna de cromatografía de fase inversa de tamaño de poro más pequeño (2.6 μm, C8 100 Å; 50 x 2,1 mm) y un sistema solvente degradado ( 0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: en 70% B; 2.7-2,8 min: 70-90% de B; 2,8-4,0 min: 90% lavado de B; 4.0-4,1 min: 90-40% B; 4.1 6.0 min: en 40% B) en lugar de una elución isocrática. El objetivo de este estudio era reducir el tiempo de análisis HPLC-MS por muestra dramáticamente de ~ 15 minutos a sólo 6 minutos por muestra, que es esencial para el análisis de una gran cantidad de muestras de pacientes. Este método conviene será de gran utilidad para estudios en las relaciones exposición-respuesta de estas drogas de CF de avance.
Introduction
La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad genética común que implica las glándulas exocrinas de la mucosa del pulmón, hígado, páncreas y los intestinos causando insuficiencia multiorgánica progresiva, como una disminución en la función pulmonar y la insuficiencia pancreática1, 2,3. Ivacaftor (IVA) es el primer Food and Drug Administration (FDA-US) y Agencia Europea de medicamentos (EMA) aprobó fibrosis quística trans membrana conductancia regulador (CFTR) potenciador de drogas, con eficacia clínica se manifiesta produciendo un significativo mejora la función pulmonar en comparación con placebo en un pequeño subgrupo de pacientes con FQ teniendo la G551D-CFTR [glicina (G) en posición 551 es reemplazado por ácido aspártico (D)] mutación sin sentido (~ 4-5% de la población de CF)4,5. Esto administrados por vía oral drogas aumenta el canal CFTR abriendo, así aumentar el flujo de iones de cloruro y actuando sobre el defecto primario que conduce a las manifestaciones clínicas de CF4,6. Lamentablemente, IVA monoterapia no es eficaz en pacientes con la mutación más común de F508del homocigótica [en canceladura del marco del gen CFTR que se traduce en la pérdida de la fenilalanina (F) en la posición 508] que resulta en mal plegada CFTR, que se observa en ~ 50% de la población de CF7,8.
Recientemente, la FDA otorgó la aprobación para combinar IVA con el corrector CFTR lumacaftor drogas. La inteligente estrategia de combinar un corrector CFTR (lumacaftor LUMA) que rescata la F508del-CFTR a la superficie de la célula con un modulador (IVA) que potencia la actividad del canal CFTR, efectivamente se expande la ventana de tratamiento a la mayoría de la población de CF5 . Sigue habiendo preguntas sobre si estos fármacos cumplirá su promesa como un número de informes contradictorios han emergido poner en duda sobre su eficacia clínica9,10. Además, mejoras en la función pulmonar fueron sólo modesto (2.6-4% para combinación ivacaftor-lumacaftor) en comparación con el éxito alcanzado con la monoterapia en pacientes con una mutación (10.6-12,5%) de G551D8de IVA. Posibles interacciones de fármacos antagonistas entre IVA y LUMA que limitan potencialmente la eficacia clínica de la combinación lumacaftor ivacaftor provienen de sus propiedades farmacocinéticas ideal menos de7,11. IVA es ampliamente metabolizada por las enzimas del citocromo P450 (CYP), principalmente a un metabolito activo hidroximetil-IVA (IVA-M1, M1) y una forma inactiva de7,IVA-carboxylate (IVA-M6, M6)12. El inductor de CYP3A4 LUMA, por otro lado, no se metaboliza extensamente y en gran parte se excreta inalterado en la heces11. Como inductores de CYP3A4 inducen metabolismo del citocromo, se podrían reducir concentraciones ivacaftor (sustrato de CYP3A4). Por otra parte, tanto el IVA como LUMA son moléculas muy hidrofóbicas y están obligado ~ 99% a proteínas plasmáticas, que limita significativamente la concentración de libre de drogas (activo)1,13.
Colectivamente, estos factores pueden ser que se reúnen para limitar la eficacia clínica de la combinación de ivacaftor-lumacaftor. No se sabe si se alcanzan las concentraciones plasmáticas óptimas bajo el actual régimen de dosificación para el ivacaftor-lumacaftor combinación o si el umbral terapéutico se mantiene8. Actualmente, hay una escasez de información sobre los parámetros farmacocinéticos como el pico y las concentraciones plasmáticas de estado estacionario de ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor. Dado el notable metabolismo de ivacaftor y lumacaftor, seguimiento de las relaciones exposición-respuesta es requisito para alcanzar regímenes de dosis óptima para tratamiento ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor. Nuestro grupo ha publicado recientemente el primer método HPLC, LC-MS para la supervisión de las relaciones exposición-respuesta de IVA y LUMA14. No hay técnicas alternativas de medición de las concentraciones de ivacaftor, sus metabolitos y lumacaftor se han divulgado hasta la fecha. Para permitir el análisis de alto rendimiento de un colectivo de pacientes mayor y para reducir drásticamente el tiempo de análisis, nuestro grupo ha optimizado el método divulgado a través de una columna de cromatografía de fase inversa de tamaño de poro más pequeño y un sistema solvente degradado que reduce costos y tiempos en marcha.
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Protocol
aprobación de ética se obtuvo de Monash University humano investigación ética Comité (MUHREC).
1. aplicación de la prueba: toma de muestras de paciente
- registrar el tiempo cuando el paciente toma la dosis estándar de 150 mg el ivacaftor o ivacaftor 125 mg /lumacaftor 200 mg.
- Nota abajo el tiempo exacto cuando se recoge la muestra de sangre del paciente.
Nota: Se recomienda recoger muestras de 4-5 en un transcurso de tiempo 24 h. Si la colección de solo muestra es posible, el momento indicado es 2.5-4 h post ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor combinación de dosificación como C máximo las concentraciones en estado estacionario será alcanzables después de > 5 días de tratamiento consecutivo. - Recoger 4-5 mL de sangre en tubos azul sin tratamiento disponibles en el mercado.
- Después de la recolección de la sangre, que la sangre coagule dejando tranquilo a temperatura ambiente.
Nota: Esto generalmente toma 15-30 minutos - Eliminar el coágulo por centrifugación a 1.000-2.000 x g durante 10 min a 4 ° C en una centrífuga refrigerada. Designar el sobrenadante resultante como plasma.
- Después de centrifugación, inmediatamente transferir el sobrenadante (plasma) en un tubo limpio de polipropileno con una pipeta Pasteur. Etiqueta el plasma del tubo con el ID del paciente (p. ej., paciente 1), el medicamento administrado (por ejemplo, combinación de ivacaftor-lumacaftor) y tiempo de la muestra del paciente fue recogida (p. ej., dosis después de 2,5 h).
- Mantener las muestras a 2-8 ° C durante la manipulación. Una vez terminado el tratamiento, almacenar las muestras en – 20 ° C.
- Si es necesario, enviar las muestras con un mensajero aprobado al Instituto análisis.
Nota: Las muestras deben enviarse en hielo seco hasta su llegada y debe mantenerse en – 80° C hasta análisis.
2. Preparación y procesamiento de muestras efectuados y normas
Nota: Plasma de donantes sanos ingenuos al ivacaftor/lumacaftor tratamiento se obtuvo de la Cruz Roja australiana. Para asegurar la integridad, todas las muestras y normas debe mantenerse a 2-8 ° C durante la recolección y procesamiento. Una vez terminado el tratamiento, almacenar las muestras en – 20 ° C.
- Pesar IVA, IVA-carboxylate, hidroximetil-IVA y LUMA que servirá como referencia para los estándares internos.
- Preparar dos soluciones independientes de cada analito (IVA, M1, M6 y LUMA) en metanol de grado LC-MS en 100 μg/mL y 10 μg/ml.
Nota: Los compuestos expirará después de 10 días en el escritorio. - Recién preparar LC-MS, patrones de calibración antes de cada serie analítica mediante la dilución de los estándares de calibración soluciones en plasma humano para lograr a raíz de las concentraciones: 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 y 10.0 μg/mL. Estas muestras se denominan normas.
- Para precipitar proteínas, preparar 0.1% de ácido fórmico (FA) en acetonitrilo (ACN, grado de LC-MS) y deja en el refrigerador hasta que sea necesario.
3. Tratamiento previo de muestras efectuados y normas
- tanto muestras de plasma del paciente y en blanco se equilibren a temperatura ambiente.
- Vortex para mezclar cada muestra de plasma de 15 s por ejemplo.
- Transfiera una alícuota de 100 μl de cualquiera plasma sin estándares o muestras para análisis en un tubo de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 mL.
- Añadir el IVA estándar interno en cada uno de los tubos estándar (por ejemplo, 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 y 10.0 μg/mL para cubrir el potencial rango de concentración), cierre la tapa y vortex por 2-3 s. Nota esa norma interna es sólo Añadida al plasma en blanco y no estándar interno se agrega a las muestras del paciente.
- Repita el paso 3.4. de los otros estándares internos M1, M6 y LUMA.
- Vuelta abajo cada tubo brevemente para asegurar que hay no hay gotas en la tapa de.
- Añadir 200 μL de la mezcla de 0.1% FA en ACN en cada tubo para precipitar las proteínas del plasma.
- Vórtice la mezcla vigorosamente durante 15 s.
- Tubos reposar 10 minutos en el refrigerador.
- Centrifugar a 10.000 x g durante 10 min a 4 ° C, si es posible.
- Filtrar una alícuota de 200 μL del sobrenadante a través de un filtro de la jeringuilla de 13 m m en un frasco HPLC de 1.5 mL.
- Transferir 100 μl del sobrenadante en el frasco de LC-MS para el análisis de HPLC-MS.
4. El análisis por HPLC-MS
Nota: HPLC-MS el análisis fue realizado en un sistema LC-MS juntado con el espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (tabla 1).
- Vuelta en el sistema LC-MS, coloque la bandeja con las muestras en el dechado auto.
- Fijar la columna en una columna de guardia y conectar al sistema LC-MS.
- Conectar dos botellas de fases móviles (botella A: 100% ACN; botella B: 0,1% ácido fórmico en agua) y equilibrar el sistema LC-MS.
- Incorporar a los siguientes parámetros en el protocolo de LC-MS.
- Divide el flujo de fase móvil antes de entrar en el espectrómetro de masas en una proporción 2:1 (residuos: entrada de MS).
- Realizar una elución gradiente a un flujo de 0,5 mL/min utilizando una fase móvil que consiste en 100% ACN y 0.1% de ácido fórmico en agua (40: 60, el punto de partida v/v). Tenga en cuenta que el porcentaje de volumen de la fase móvil cambia a lo largo del análisis.
- Operar el espectrómetro de masas en modo de ionización por electrospray positivo.
- Asegúrese de que los valores de LC-MS son los siguientes: voltaje de spray ion 4,5 kV, energía de la colisión 295.9 V, nebulización gas: nitrógeno a 3 L/min, gas de colisión: argón; secado gas caudal 20 L/min, voltaje Q3 de la lente:-22 V, desolvation temperatura 250 ° C con un bloque de calor temperatura de 400 ° C.
- Volumen de inyectar 10 μl por muestra.
- Detectar analitos usando la reacción múltiple (MRM) de monitoreo. Seguimiento de las transiciones del ion de m/z 392.49 → 393, m/z 408.49 → 409, m/z 422.47 → 423 y m/z 452.40 → 453 para IVA, IVA-M1, M6 IVA y LUMA, respectivamente.
Nota: El método recientemente optimizado aún tiene que ser plenamente validado según estándares de la FDA.
5. Curvas de calibración
- construir la LC-MS curvas de calibración antes de cada serie analítica usando la relación entre las proporciones de área de pico de cada uno de los cuatro analitos a estándar interno y las calibración estándar nominal las concentraciones de El ivacaftor (IVA-M1, M6 IVA o LUMA) dentro del programa de configuración de LC-MS.
Nota: Los pasos exactos para la construcción de la curva de calibración es dependiente en el modelo de equipo LC-MS se utiliza. Esta información puede estar disponible en el manual del equipo. - Realizar el análisis de regresión lineal de mínimos cuadrados ponderando 2 según el recíproco de las concentraciones de.
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Representative Results
Recientemente hemos reportado un método, validado parcialmente a las normas de la FDA, en un triple cuadrupolo LC-MS y un sistema de detector HPLC, usando una columna C8 (5 μm, 3,9 x 50 mm diámetro interior) con la fase móvil que consiste en 100% ACN y 0.1% de ácido fórmico en agua (40: 60 v/v) con un caudal de 1 mL/min. Se observó una correlación linear de los picos sobre un rango de concentración de 0,01 a 10 μg/mL en plasma humano para todos los metabolitos, ivacaftor, Iva-M1, M6 Iva y lumacaftor14. Aquí este método ha sido optimizado permitir dramáticamente reducido LC tiempos de retención y, por tanto, el tiempo en marcha total del ensayo, que es esencial para el análisis de alto rendimiento de una gran cantidad de muestras clínicas. El ensayo se ha optimizado mediante el uso de una columna de cromatografía de fase inversa de tamaño de poro más pequeño y un sistema solvente degradado en lugar de una elución isocrática, reduciendo el tiempo por muestra de ~ 15 minutos a sólo 6 minutos. Los analitos se determinan en electrospray modo positivo de reacción múltiple (MRM) de monitoreo. El procedimiento debe validarse en la empresa antes de su uso, como anteriormente hemos detallado14.
La exactitud del método fue 94,2% ± 4,53% a 97.5% 2.94%, dependiendo del analito14. El rango de calibración de 0,01 a 10 μg/mL es aplicable para el uso en el ajuste clínico, en particular teniendo en cuenta que bajo terapia lumacaftor ivacaftor, concentraciones muy bajas de activos IVA y M1 fueron divulgadas por nuestro grupo anteriormente, en el plasma potencialmente debido a la inducción de CYP3A4 por LUMA, que da lugar a extenso metabolismo de IVA14. La precisión intra-día de cada analito se evaluó con seis muestras de preparados independientemente de control de calidad (QC) en el mismo día a concentraciones de 0.05, 0.5 y 8 μg/mL. La precisión interdía fue evaluada con muestras de control de calidad independiente preparadas seis en tres días consecutivos. Exactitud y precisión se calcularon mediante la desviación estándar relativa (RSD). Para cada muestra de control de calidad, los valores RSD deben ser inferior al 15%15. Todos los cuatro analitos mostraron valores RSD de menos del 15%14. El límite inferior de detección (LOD) y cuantificación (LOQ) fueron establecidos: por IVA LOD 2.50 x 10-3 μg/mL y LOQ 7.57 x 10-3 μg/mL; para M1, LOD 4.57 x 10-4 μg/mL y LOQ 1.38 x 10-3 μg/mL; para M6 LOD 5.86 x 10-4 μg/mL y LOQ 1.78 x 10-3 μg/mL; para LUMA LOD fue 6.08 x 10-4 μg/mL y LOQ 1.84 x 10-3 μg/mL14. Un cromatograma típico se muestra en la figura 1. Una optimizado Resolución cromatográfica fue obtenida usando una fase móvil de 100% ACN y 0.1% de ácido fórmico en agua (40: 60, el punto de partida v/v) con una elución gradiente en una columna C8 (2.6 μm; 100 Å; 50 x 2,1 mm). La separación del gradiente fue utilizada con el 40% de la fase móvil B de 0 a 1 min; entonces 40% - 70% de la fase móvil B de 1 min a 2 min; celebración de 70% de la fase móvil B de 2 min a min 2,7; aumento de 70% a 90% de la fase móvil B de min 2,7 a 2,8 min; que el 90% de la fase móvil B de min 2,8 a 4,0 min para el lavado de fines; Finalmente regresando de 90% a 40% de B móvil de min 4,0 a 4,1 min; luego que 40% de la fase móvil B de 4,1 min a min 6,0 para las condiciones iniciales (figura 1). Los tiempos de retención de LC fueron por M6 1,0 min; para M1 1,3 min; de IVA: 1,55 min; para LUMA: 2,3 min (figura 1). En todas las muestras de plasma blanco, no se observó ninguna interferencia con el tiempo de retención de cualquiera de los analitos, ni se detectó interferencia de la combinación de ivacaftor con lumacaftor.
Figura 1 : Representante LC-MS cromatograma de plasma humano enriquecido con 10 μg/mL de IVA-M6, M1 IVA, lumacaftor y ivacaftor en relación con la elución gradiente de bomba. Un 0,1% de ácido fórmico en agua y la bomba B 100% acetonitrilo (0-1 min: 40% B; 1-2:00 %-70% B; 2-2.7 min: llevó a cabo en 70% B; B 2,7-2,8 min: 70%-90%; 3.8-4.0 min: 90% B lavado; 4.0-4,1 min: 90%-40% B; 4.1 6.0 min: en 40% B). Las transiciones del ion de m/z 392.49 → 393, m/z 408.49 → 409, m/z 422.47 → 423 y m/z 452.40 → 453 fueron utilizadas por MS/MS control de ivacaftor, IVA - M1, M6 IVA y lumacaftor, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Condiciones HPLC | |
| Columna | C8; 2.6 μm; 100 Å; 50 x 2,1 mm |
| Precolumna | HPLC en línea filtro 0.5 μm; Filtro de profundidad x 0.004 inID |
| Filtro x 0.004 inID | |
| Temperatura de columna: | 30 ° C |
| Fase móvil A: | 0.1% FA en agua |
| Fase móvil B: | 100% ACN |
| Composición de la fase móvil en el punto de partida | 60 / 40 (v/v) |
| Temperatura de la muestra: | 4 ° C |
| Volumen de inyección: | 5 ΜL |
| Lavado de aguja | metanol al 80%, 20% 300 μL de agua |
| Tasa de flujo: | 0.5 mL/min. |
| Gradiente: | 1:00 % B |
| -1-2:00 % - 70% B | |
| -2-2,7 min: en 70% B | |
| -2,7 - 2,8 min: 70% - 90% de B | |
| -2,8 - 4,0 min: 90% B lavado | |
| -4.0 - 4,1 minuto: 90% - 40% | |
| -4.1-6,0 min: en 40%, | |
| Total run: | 6 minutos |
| Tiempos de retención: | Tiempo de retención para M6: 1,0 min |
| Tiempo de retención para M1: 1,3 min | |
| Tiempo de retención de IVA: 1,55 minutos | |
| Tiempo de retención para LUMA: 2,3 min | |
| Condiciones de MS | |
| Modo de detección: | por electrospray ESI positivo + |
| Voltaje de spray ion: | 4.5 kV |
| Energía de la colisión: | 295.9 V |
| Gas (nitrógeno) de nebulización: | 3 L/min |
| Gas de CID: | kPa 230 |
| Secado de flujo de gas (nitrógeno): | 20 L/min |
| Sesgo de pre-barra Q1: | - & #1 |
Tabla 1: Detalles de las condiciones de HPLC-MS.
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Discussion
Como se informó anteriormente, nuestro grupo tiene por primera vez desarrollado y validado un método de HPLC y LC-MS para la detección y cuantificación de ivacaftor y sus principales metabolitos hidroximetil-IVA M1 (activo) y el IVA-carboxylate M6 (inactivos); y lumacaftor en el plasma y el esputo de pacientes de CF14. El análisis divulgado previamente por nuestro grupo fue utilizado con éxito para cuantificar la concentración de LUMA, IVA, IVA-M1 y M6 de IVA en el plasma y el esputo de pacientes con FQ sometidos a terapia estándar de estado estacionario con IVA 150 mg /q12 h (terminología Latina: quaque 12 h; una vez cada 12 h) o 200 mg /q12 h LUMA 125 mg /q12 h IVA combinación14. Para el análisis de alto rendimiento de grandes cantidades de muestras de pacientes, hemos optimizado el método divulgado utilizando una columna de cromatografía de fase inversa de tamaño poro menor C8 (2.6 μm; 100 Å; 50 x 2,1 mm2) y un sistema solvente degradado en vez de la corriente elución isocrática. Esto reduce la duración a 6 minutos por muestra.
Este método novedoso y fiable ofrece un enfoque sencillo, sensible y rápido para análisis farmacológico de la combinación de ivacaftor y ivacaftor lumacaftor en fluidos biológicos. Dada la necesidad de desarrollar relaciones exposición-respuesta para maximizar la eficacia de los medicamentos, así como contener los costos de salud, las herramientas más sensibles deben ser desarrollado y validado para ayudar a los clínicos en el uso de terapias basadas en evidencia y alto rendimiento técnicas analíticas para pacientes que padecen CF. nuestro grupo ha divulgado previamente un parcialmente validada de HPLC-MS para analizar simultáneamente el IVA, IVA-M1, M6 IVA y LUMA en el plasma y el esputo de pacientes de CF14. Establecer un protocolo analítico común y fácil de usar para el análisis de pacientes que recibieron la combinación ivacaftor o lumacaftor ivacaftor facilitaría la comparación de datos e interpretación de resultados de estudios farmacocinéticos futuros. IVA, IVA-M1, M6 IVA y LUMA de medición en fluidos biológicos mediante técnicas de LC-MS podría encarnar una poderosa herramienta para explorar la relación en lo referente a los resultados terapéuticos.
Más en general, análisis de HPLC-MS de ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor combinación en fluidos biológicos puede proporcionar una base molecular para la aplicación de estrategias farmacoterapéutico individualizados con pacientes que sufren de FQ y puede resultar útil en los terrenos que la terapia de combinación ivacaftor o ivacaftor lumacaftor cara más rentable, potencialmente indicando la necesidad de dosis menos frecuentes. Aplicando el método analítico propuesto a estudios clínicos farmacocinéticos/farmacodinámicos, ha surgido la oportunidad para investigar los parámetros farmacocinéticos de combinación ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor en un paciente mayor colectiva.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
J.L. y T.V. son apoyados por el Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas (NIAID) de los institutos nacionales de salud (R01 AI111965). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial del Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas o los institutos nacionales de salud. MC es un investigador australiano NHMRC Principal. J. L. es nacional australiano de salud y Consejo de investigación médica (NHMRC) Senior Research Fellow, y T.V. es un australiano NHMRC industria carrera desarrollo nivel 2 investigador. E.K.S es un 2017 joven Embajador designado para ASM (sociedad estadounidense de Microbiología) y es apoyado por la concesión australiana del postgrado.
Partes de este trabajo fue presentado en la 12th Conferencia incesante en la Fibrosis quística en Melbourne (5-8th de agosto de 2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVA (Cat#S114) | SelleckChem (USA). | ||
| LUMA (Cat#S1565) | SelleckChem (USA). | ||
| IVA-carboxylate (Cat# 510242247CS) | Clearsynth (Canada). | ||
| hydroxymethyl-IVA (Cat# 510240849CS) | Clearsynth (Canada). | ||
| Methanol (MeOH, LC-MS grade), | Sigma-Aldrich | ||
| acetonitrile (ACN, LC-MS grade) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid (FA) | Sigma-Aldrich | ||
| triple-quadrupole Shimadzu 8030 LC-MS | |||
| Phenomenex Kinetex (2.6 µm C8 100 Å; 50 × 2.1mm) | |||
| (KrudKatcher Ultrea HPLC In-Line Filter 0.5 m Depth Filter x 0.004inID). | |||
| 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tube (VWR). | |||
| Eppendorf Centrifuge 5430 | |||
| 13-mm syringe filter (0.45 µm nylon, GRACE, USA) | |||
| [Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 µL, PTFE/Silicone septa]. |
References
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