Summary
שילוב Ivacaftor ivacaftor-lumacaftor הן שתי תרופות CF חדש. עם זאת, יש עדיין מחסור ההבנה שלהם PK/PD, פרמקולוגיה. אנו מציגים טכניקה HPLC-MS ממוטבים לניתוח בו זמנית של ivacaftor שלה מטבוליטים הגדולות ואת lumacaftor.
Abstract
פגמים המתקן מוליכות הטרנס-הממברנה סיסטיק פיברוזיס (CFTR) הן הגורם סיסטיק פיברוזיס (CF), מחלה עם סכנת חיים ביטויים ריאתי. Ivacaftor (IVA) ivacaftor-lumacaftor (LUMA) שילוב שתי תרופות פריצת דרך CF חדש ישירות לווסת את הפעילות וסחר של החלבון-CFTR פגומים בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. עם זאת, יש עדיין מחסור של הבנה על פרמטרים פרמוקוקינטיים/pharmacodynamic פרמקולוגיה של ivacaftor ושל lumacaftor. הטכניקה HPLC-MS לניתוח בו זמנית של הריכוזים של ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate ו- lumacaftor של נוזלים ביולוגיים בחולים שקיבלו תקן שילוב ivacaftor או ivacaftor-lumacaftor טיפול כבר בעבר שפותחה על ידי הקבוצה שלנו ואומת חלקית בתקני ה-FDA. עם זאת, כדי לאפשר ניתוח תפוקה גבוהה של מספר גדול יותר של דוגמאות החולה, הקבוצה שלנו יש אופטימיזציה שיטת דיווח באמצעות עמודה הפוכה-שלב בקבוקים קטנים נקבובית גודל (2.6 מיקרומטר, C8 100; 50 x 2.1 מ"מ) ו (מערכת ממיס צבע של 0-1 דקות: 40% ב'; 1-2 דקות: 40-70% ב'; מינימום 2-2.7: שנערך ב-70% ב'; 2.7-2.8 מין: 70-90% ב'; 2.8-min 4.0: 90% B כביסה; 4.0-4.1 מין: 90-40% ב'; 4.1-6.0 מין: שנערך ב- 40% B) במקום • תנאי איזוקראטית. מטרת מחקר זה הייתה כדי לצמצם את הזמן ניתוח HPLC-MS עבור דגימה באופן דרמטי מ ~ 15 דקות רק 6 דקות לכל דגימה, אשר חיוני לניתוח של כמות גדולה של דגימות החולה. שיטה זו מועיל יהיה של השירות ניכר ללימודים למערכות יחסים חשיפה-תגובה של תרופות אלו CF פריצת דרך.
Introduction
סיסטיק פיברוזיס (CF) היא מחלה גנטית נפוצה מעורבים בלוטות הריר אקסוקרינית של הריאות, הכבד, הלבלב, המעי גורם לכשל איברים רב פרוגרסיבי, כגון ירידה תפקוד הריאות, הלבלב אי ספיקה1, 2,3. Ivacaftor (IVA) הראשון המזון והתרופות (FDA-ארה ב), סוכנות התרופות האירופית (EMA) אישרה סיסטיק פיברוזיס הטרנס-הממברנה מוליכות הרגולטור (CFTR) potentiator סמים, עם יעילות קלינית evidenced ייצור משמעותי שיפור בתפקודי הריאה מעל פלצבו תת קבוצה קטנה של חולי סיסטיק פיברוזיס הנושאת את G551D-CFTR [גליצין (G) בעמדה 551 מוחלף על ידי חומצה אספרטית (D)] missense מוטציה (~ 4-5% מהאוכלוסייה CF)4,5. זה בעל-פה מנוהל סמים מגביר את הערוץ CFTR פתיחה, ובכך מגדילים את זרם יון כלוריד של משחק את הפגם העיקרי שמוביל המאפיינים הקליניים של CF4,6. למרבה הצער, IVA יחידני אינו יעיל בחולים עם המוטציה נפוץ יותר F508del homozygous [במחיקת מסגרת הגן CFTR אשר גורמת לאובדן של פנילאלנין (נ) במיקום 508] שתוצאתה misfolded CFTR, אשר נראה ב ~ 50% CF האוכלוסייה7,8.
לאחרונה, ה-FDA העניק אישור עבור שילוב IVA עם מתקן CFTR סמים lumacaftor. האסטרטגיה המתוחכם של שילוב של מתקן CFTR (lumacaftor, LUMA) אשר מצילה F508del-CFTR השטח תא עם אפנן (IVA) אשר potentiates CFTR ערוץ פעילות, ביעילות מרחיבה את החלון הטיפול רוב האוכלוסייה CF5 . שאלות נותרו על תרופות אלו ימלא את ההבטחה שלהם כפי הופיעו מספר דיווחים סותרים הספק יצוק על היעילות הקלינית שלהם,9,10. בנוסף, שיפור תפקוד הריאות היו צנועים (2.6-4% בלבד עבור שילוב ivacaftor-lumacaftor) לעומת ההצלחה מושגת עם יחידני IVA אצל חולים הנושאת מוטציה (10.6-12.5%) G551D8. אינטראקציות-תרופתיים אויבת פוטנציאלית בין IVA וכי LUMA העלול להגביל את היעילות הקלינית של שילוב ivacaftor-lumacaftor באים שלה פחות אידיאלי של המאפיינים פרמוקוקינטיים7,11. IVA עובר מטבוליזם בהרחבה על ידי ציטוכרום P450 אנזימים (CYP), בעיקר כדי של המטבוליט הפעיל hydroxymethyl-IVA (IVA-M1, M1) וטופס לא פעיל IVA-carboxylate (IVA-M6, M6)7,12. משרן CYP3A4 LUMA, מצד שני, היא לא בהרחבה חילוף חומרים, מופרש בעיקר לא השתנה בתוך צואה11. כפי CYP3A4 inducers זירוז חילוף החומרים ציטוכרום, ריכוזי ivacaftor (CYP3A4 המצע) יכול להיות מופחת. יתר על כן, IVA והן LUMA מולקולות הידרופוביות מאוד, ~ 99% מאוגדים פלזמה חלבונים, אשר באופן משמעותי מגביל את ריכוז סמים (פעילים) חינם1,13.
באופן קולקטיבי, גורמים אלה אולי יבוא יחד כדי להגביל את היעילות הקלינית של שילוב ivacaftor-lumacaftor. לא ידוע אם ריכוזים מיטביים פלזמה מושגות תחת משטר המינון הנוכחי עבור שילוב ivacaftor-lumacaftor או אם הסף הטיפולי נשמר8. תוך זמן קצר, יש במחסור של מידע לגבי פרמוקוקינטיים פרמטרים כגון הפסגה וריכוזי הפלסמה מצב יציב של ivacaftor או ivacaftor-lumacaftor. בהינתן החומרים ראוה של ivacaftor ו- lumacaftor, פיקוח על מערכות יחסים חשיפה-תגובה הוא נחוץ כדי להשיג משטרי המינון האופטימלי לטיפול ivacaftor או ivacaftor-lumacaftor. הקבוצה שלנו לאחרונה לאור השיטה HPLC/LC-MS הראשונה עבור בקרה של מערכות יחסים חשיפה-תגובה של IVA, LUMA14. אין טכניקות חלופיות של מדידת ריכוז ivacaftor שלה מטבוליטים, lumacaftor דווחו עד היום. כדי לאפשר ניתוח תפוקה גבוהה של קולקטיב המטופל גדול יותר, כדי להפחית באופן משמעותי את זמן הניתוח, הקבוצה שלנו כולל אופטימיזציה שיטת דיווח באמצעות עמודה הפוכה-שלב בקבוקים קטנים נקבובית גודל ומערכת ממיס צבע זה מפחית את עלות ושעות פועל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
אישור לאתיקה הושג מ מונש אוניברסיטת האנושי מחקר אתיקה הוועדה (MUHREC).
1. יישום של וזמינותו: החולה מדגם אוסף
- לרשום את הזמן כאשר המטופל לוקח מינון רגיל שלהם של 150 מ"ג ivacaftor או ivacaftor 125 מ"ג /lumacaftor 200 מ ג.
- הערה למטה בדיוק הזמן כאשר נאסף את דגימת הדם המטופל.
הערה: מומלץ איסוף דגימות 4-5 במהלך הזמן מספר 24 שעות ביממה. אם האוסף של מדגם אחד בלבד אפשרי, נקודת הזמן המצוין הוא 2.5-4 h פוסט ivacaftor או ivacaftor-lumacaftor שילוב מינון כמו C מקס ריכוזים-מצב יציב יהיה בר השגה לאחר > 5 ימים של טיפול רציף. - לאסוף 4-5 מ של דם זמינים מסחרית צינורות כחול לא מטופל.
- לאחר אוסף של כל הדם, לאפשר את הדם להיקרש על ידי השארת אותו ללא הפרעה בטמפרטורת החדר.
הערה: זה בדרך כלל לוקח 15-30 דק... - להסיר קריש הדם על ידי צריך שתוציאו ב 1,000-2,000 g x 10 דקות ב 4 ° C ומפרידה בקירור. תייעד את תגובת שיקוע וכתוצאה מכך פלזמה.
- בעקבות צנטריפוגה, להעביר מיד את תגובת שיקוע (פלזמה) לתוך צינור פוליפרופילן נקי באמצעות פיפטה של פסטר. תווית הפלזמה צינור עם החולה מזהה (למשל, החולה 1), התרופה מנוהל (למשל, שילוב ivacaftor-lumacaftor) ולאחר זמן הדגימה החולה היה שנאספו (למשל, המינון שלאחר 2.5 h).
- שמור על דגימות ב 2-8 ° C במהלך הטיפול. עם סיום הטיפול, לאחסן דגימות-– 20 מעלות צלזיוס
- במידת הצורך, למשלוח דגימות עם שליח שאושרו למכון וניתוח.
הערה: כדי להישלח על קרח יבש עד ההגעה ודוגמאות יש לשמור על – 80° C עד ניתוח.
2. הכנה, עיבוד של דגימות שנצברו ותקנים
הערה: פלזמה של תמים בריא תורמים לטיפול ivacaftor/lumacaftor היה מתקבל מן הצלב האדום אוסטרלי. כדי להבטיח את התקינות, יש לשמור כל דגימות/תקנים של 2-8 ° C במהלך איסוף ועיבוד. עם סיום הטיפול, לאחסן דגימות-– 20 מעלות צלזיוס
- שוקל לצאת IVA, IVA-carboxylate, hydroxymethyl-IVA, LUMA, אשר ישמש כנקודת התייחסות הסטנדרטים פנימי.
- להכין שני פתרונות מניות עצמאית של כל analyte (IVA, M1, M6, LUMA) ב- LC-MS כיתה מתנול µg 100/mL וכן ב 10 µg/mL.
הערה: תרכובות יפוג לאחר 10 ימים ב- benchtop. - טריים להכין LC-MS סטנדרטים כיול לפני כל הפעלה אנליטי על ידי דילול של הסטנדרטים כיול פתרונות מניות לתוך לפלסמה אנושית כדי להשיג בעקבות ריכוזים: 0.01 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 µg/mL. דגימות אלה נקראות תקנים.
- כדי לזרז חלבונים, הכנת 0.1% חומצה פורמית (FA) acetonitrile (לחצן מצוקה, LC-MS כיתה) ולהשאיר במקרר עד הצורך.
3. טיפול קדם של דגימות שנצברו ותקנים
- לאפשר בשתי דגימות פלסמה החולה, ריק כדי equilibrate לטמפרטורת החדר.
- מערבולת לערבב כל מדגם פלזמה 15 לשנייה בכל דגימה.
- העברה של aliquot 100 µL או פלזמה ריק עבור תקנים או דגימות החולה לניתוח לתוך צינור microcentrifuge פוליפרופילן 1.5-mL-
- להוסיף את IVA תקן פנימי לתוך כל הצינורות רגיל (למשל 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 ו- µg/mL 10.0 כדי לכסות את טווח הריכוז פוטנציאליים), לסגור את המכסה, מערבולת 2-3 ס' תו תקן פנימי זה הוא רק נוספו פלזמה ריק אין תקן פנימי יתווסף הדגימות החולה.
- חזור על שלב 3.4. עבור פנימי תקנים נוספים M1, M6, LUMA.
- ספין למטה כל שפופרת לזמן קצר כדי להבטיח שאין שום טיפות על המכסה.
- µL להוסיף 200 של המיקס של 0.1% פא בלחצן מצוקה לתוך כל שפופרת, כדי לזרז פלזמה חלבונים.
- מערבולת התערובת נמרצות על כ-15 ס
- לאפשר צינורות לעמוד 10 דקות במקרר.
- צנטריפוגה ב x 10,000 ג'י 10 דקות ב 4 ° C, במידת האפשר.
- סינון של aliquot 200 µL של תגובת שיקוע דרך מסנן מזרק 13 מ מ לתוך בקבוקון HPLC 1.5 mL-
- µL 100 העברה של תגובת שיקוע לתוך הבקבוקון LC-MS לניתוח HPLC-MS-
4. ניתוח HPLC-MS
הערה: HPLC-MS ניתוח בוצע במערכת LC-MS בשילוב עם ספקטרומטר מסה פאול טריפל (טבלה 1).
- להפוך במערכת LC-MS, מניחים את המגש עם הדגימות האוטומטי-סמפלר.
- לצרף את העמודה לעמודת משמר, להתחבר למערכת LC-MS-
- לצרף שני בקבוקים של שלבים ניידים (בקבוק ת 100% לחצן מצוקה; בקבוק ב': 0.1% חומצה פורמית במים), equilibrate את המערכת LC-MS.
- לשלב את הפרמטרים הבאים פרוטוקול LC-MS-
- לפצל את זרימת שלב נייד לפני הכניסה את ספקטרומטר מסה על יחס של 2:1 (פסולת: כניסת MS).
- לבצע • תנאי הדרגתיות בקצב הזרימה של 0.5 mL/min משתמש שלב ניידים בהיקף של 100% לחצן מצוקה ו- 0.1% חומצה פורמית במים (40:60, נקודת ההתחלה וי/v). שימו לב: האחוזים נפח של השלב ניידים שינויים לאורך כל ניתוח.
- להפעיל את ספקטרומטר מסה במצב יינון חיובי ספקטרומטריית electrospray.
- ודא שההגדרות LC-MS הן כדלקמן: יון ספריי מתח 4.5 kV, אנרגיית התנגשות 295.9 וי, nebulizing גז: חנקן ב 3 L/דקה; גז התנגשות: ארגון; ייבוש גז לזרום 20 L/min, עדשה מתח Q3:-22 V, טמפרטורה desolvation 250 ° C עם גוש חום הטמפרטורה של 400 מעלות צלזיוס.
- 10 להזריק µL אמצעי האחסון עבור דגימה.
- Analytes זיהוי באמצעות התגובה מרובים ניטור (MRM). לפקח על מעברים יון של m/z 392.49 → 393, מ/z 408.49 → 409, מ/z 422.47 → 423 ו- m/z 452.40 → 453 IVA, IVA-M1, IVA-M6, LUMA, בהתאמה.
הערה: שיטת אופטימיזציה החדש טרם לאימות באופן מלא לפי תקני ה-FDA-
5. עקומות כיול
- לבנות LC-MS עקומות כיול לפני כל הפעלה אנליטי באמצעות הקשר בין את היחס באזור השיא של כל אחד analytes ארבע כדי תקן פנימי את כיול סטנדרטי הנומינלי ריכוזי ivacaftor (IVA-M1, IVA-M6 או LUMA) בתוך התוכנית הגדרות LC-MS-
הערה: השלבים המדויקים לבנייה של עקומת כיול זה תלוי בדגם LC-MS הציוד בשימוש. מידע זה עשוי להיות זמין במדריך ציוד. - לבצע ניתוח רגרסיה-שיטת הריבועים הפחותים על-ידי שקלול 1/C 2 לפי הדדיים של ריכוזים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחרונה דיווחנו שיטה, לאמת חלקית בתקני ה-FDA, טריפל-פאול LC-MS, מערכת גלאי HPLC, משתמש בעמודה C8 (5 מיקרומטר, זיהוי 3.9 מ"מ x 50 מ"מ) עם השלב ניידים בהיקף של 100% לחצן מצוקה ו- 0.1% חומצה פורמית במים (40:60 וי/v) בספיקה של 1 מ"ל לדקה. מתאם ליניארי של הפסגות נצפתה מעל טווח הריכוז מ 0.01 µg 10/mL בפלסמה אנושית עבור כל מטבוליטים, ivacaftor, Iva-M1, Iva-M6 ו lumacaftor14. הנה שיטה זו מוטבה כדי לאפשר באופן דרמטי מופחתת LC השמירה פעמים ו, לכן, מהזמן וזמינותו, אשר חיוני לניתוח תפוקה גבוהה של כמות גדולה של דגימות קלינית מלאה. וזמינותו אופטימלי באמצעות עמודה הפוכה-שלב בקבוקים קטנים נקבובית גודל ומערכת הממס הדרגתיות במקום • תנאי איזוקראטית, צמצום הזמן עבור דגימה מן ~ 15 דקות רק 6 דקות. Analytes נקבעים במצב חיובי ספקטרומטריית electrospray באמצעות התגובה מרובים ניטור (MRM). ההליך לאמת בחברה לפני השימוש, כפי שתוארו קודם לכן14.
הדיוק של שיטת היה 94.2% ± ± 4.53 97.5% 2.94%, בהתאם analyte14. טווח כיול מ 0.01 µg 10/mL ישימה עבור שימוש בהגדרה קלינית, בפרט בהתחשב בכך תחת טיפול ivacaftor-lumacaftor, ריכוז נמוך מאוד של IVA ו- M1 active דווחו על ידי הקבוצה שלנו בעבר, בפלסמה פוטנציאל תופיפצה אינדוקציה של CYP3A4 מאת LUMA, אשר התוצאות IVA נרחב חילוף החומרים14. הדיוק היומיות של כל analyte נאמד עם ששת המדגמים מוכן באופן עצמאי בקרת איכות (QC) באותו יום בריכוזים של 0.05, 0.5 ו- 8 µg/mL. הדיוק יום אינטר הוערכה עם ששת המדגמים QC מוכן באופן עצמאי על שלושה ימים רצופים. דיוק ונכונות חושבו באמצעות סטיית תקן יחסית (RSD). עבור כל דגימה QC, הערכים RSD צריכים להיות פחות מ 15%15. כל analytes ארבעה הראו ערכי RSD של פחות מ- 15%14. הגבול התחתון של זיהוי (לוד), כמת (LOQ) הוקמו: עבור IVA 2.50 לוד-10-3 µg/mL ו- 7.57 LOQ x µg-3 10/mL; עבור M1, לוד 4.57 x 10-4 µg/mL... ו- 10-3 LOQ x 1.38 אינץ µg/mL; עבור M6 לוד 5.86 x 10-4 µg/mL ו- 10-3 LOQ 1.78 x µg/mL; LUMA לעיר לוד היה 6.08 x 10-4 µg/mL LOQ 1.84 x 10-3 µg/mL14. Chromatogram טיפוסי מוצג באיור1. כרומטוגרפי של פתרון אופטימיזציה הושג באמצעות שלב ניידות 100% לחצן מצוקה ו- 0.1% חומצה פורמית במים (40:60, נקודת ההתחלה וי/v) עם • תנאי מעבר הצבע על עמודה C8 (מיקרומטר 2.6; 100; 50 מ"מ x 2.1 מ"מ). ההפרדה הדרגתיות שימש עם 40% ניידות שלב B 0 1 דקות; ואז 40% - 70% של הנייד שלב B מ 1 דקה עד 2 דקות; מחזיק 70% ניידים שלב B מ 2 דקות דקות 2.7; גדל מ- 70% ל 90% ניידים שלב ב' של מין 2.7 2.8 מינימום; מחזיק 90% ניידים שלב ב' מ- 2.8 דקות מינימום 4.0 לכביסת למטרות; סוף סוף חוזר מ- 90% ל-40% מ- B ניידים מכל מין 4.0 4.1 מינימום; ואז מחזיקה 40% ניידות שלב ב' מ 4.1 דקות מינימום 6.0 תנאים הראשונית (איור 1). LC השמירה הפעמים היו כדלקמן M6 1.0 דקות; M1 1.3 דקות; עבור IVA: 1.55 דקות; עבור LUMA: 2.3 min (איור 1). בדגימות הפלסמה ריק כל, ללא הפרעה עם הזמן שמירה של כל אחד analytes נצפתה, וגם לא זוהתה הפרעה משילוב של ivacaftor עם lumacaftor.
איור 1 : נציג LC-MS chromatogram לפלסמה אנושית עם 10 µg/mL של IVA-M6, IVA-M1, lumacaftor ו- ivacaftor ביחס • תנאי מעבר של משאבת. חומצה פורמית 0.1% ב- acetonitrile 100% מים, משאבות B (0-1 דקות: 40% B; 1-2 דקות: 40%-70% B; 2-2.7 min: שנערך ב-70% B; 2.7-2.8 מין: 70%-90% B. B 3.8-4.0 מין: 90% רחיצה; 4.0-min 4.1: 90%-40% B; 4.1-6.0 min: שנערך ב- 40% B). מעברים יון של m/z 392.49 ← 393, מ/z 408.49 ← 409, מ/z 422.47 ← 423 ו m/z 452.40 ← 453 היו בשימוש על MS/MS ניטור של ivacaftor, IVA - M1, IVA-M6 ו- lumacaftor, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| תנאים HPLC | |
| טור | C8; 2.6 מיקרומטר; 100 Å; 50 x 2.1 מ מ |
| משמר עמודה | HPLC בשורה מסנן 0.5 מיקרומטר; סנן עומק x 0.004 inID |
| מסנן x 0.004 inID | |
| טמפרטורה עמודה: | 30 ° C |
| נייד שלב א': | 0.1% פא במים |
| נייד שלב ב': | לחצן מצוקה 100% |
| הרכב הנייד-נקודת המוצא | 60 / 40 (v/v) |
| לדוגמה טמפרטורה: | 4 ° C |
| נפח הזרקה: | 5 ΜL |
| שטיפת מחט | 80% מתנול, 20% מים 300 µL |
| קצב הזרימה: | 0.5 mL/min |
| הדרגה: | -min 1:40 % B |
| -1-2 דקות: 40% - 70% B | |
| -2-2.7 מין: שנערך ב-70% B | |
| -2.7 - 2.8 מין: 70% - 90% B | |
| כביסה min 4.0: 90% B - 2.8- | |
| -4.0 - 4.1 מין: 90% - 40% | |
| -4.1-6.0 מין: שהתקיים ב-40%, | |
| סה כ להפעיל: | 6 דקות |
| שעות השמירה: | זמן השמירה על M6: מין 1.0 |
| זמן השמירה על M1: מינימום 1.3 | |
| זמן השמירה על IVA: 1.55 min | |
| זמן השמירה על LUMA: 2.3 min | |
| תנאים MS | |
| זיהוי מצב: | ספקטרומטריית electrospray ESI חיובי + |
| יון ספריי מתח: | 4.5 kV |
| אנרגיית התנגשות: | 295.9 V |
| גז nebulizing (חנקן): | 3 L/min |
| גז CID: | 230 kPa |
| ייבוש זרימת גז (חנקן): | 20 L/min |
| רוד קדם Q1 הטיה: | - & #1 |
טבלה 1: פרטים של התנאים HPLC-MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כפי שדווח בעבר, הקבוצה שלנו יש בפעם הראשונה שפותחה ואומת שיטה HPLC ו- LC-MS מהירה זיהוי, כימות של ivacaftor מטבוליטים הגדולות שלו hydroxymethyl-IVA M1 (פעיל) ו- M6 IVA-carboxylate (לא פעיל); lumacaftor פלזמה, ברוק של חולי CF14. וזמינותו שדווחו על-ידי הקבוצה שלנו בעבר שימש בהצלחה כדי לכמת את ריכוז LUMA, IVA, IVA-M1 ו- IVA-M6 ב פלזמה, ברוק של CF חולים שעברו טיפול סטנדרטי מצב יציב עם IVA 150 מ"ג /q12 h (המינוח הלטיני: quaque 12 שעות; פעם כל 12 שעות) או 200 מ ג /q12 h LUMA-125 מ ג /q12 h IVA שילוב14. לניתוח תפוקה גבוהה של כמויות גדולות של דגימות החולה, לנו יש אופטימיזציה בשיטת דיווח על-ידי שימוש קטן נקבובית גודל הפוכה-פאזי כרומטוגרפיה עמודה C8 (מיקרומטר 2.6; 100; 50 x 2.1 מ מ2) ומערכת צבע הממס במקום הנוכחי • תנאי איזוקראטית. זה מפחית את הזמן רץ עד 6 דקות לכל דגימה.
שיטה זו הרומן ואמין מציעה גישה מהירה, פשוטה ונוגעת לפיקוח סמים טיפולית של שילוב ivacaftor ו- ivacaftor-lumacaftor של נוזלים ביולוגיים. בהתחשב בצורך לפתח מערכות יחסים חשיפה-תגובה כדי למקסם את יעילות התרופה, כמו גם מכילים הבריאות עולה, כלי רגיש יותר צריך להיות שפותחה ואומת על מנת לסייע קלינאים באמצעות טיפולים המבוססות על ראיות של תפוקה גבוהה שיטות אנליטיות עבור חולים הסובלים CF. הקבוצה שלנו דיווח בעבר עם HPLC-MS חלקית המאומת לניתוח בו זמנית IVA, IVA-M1, IVA-M6 ו LUMA פלזמה, ברוק של חולי CF14. הקמת פרוטוקול נפוץ, קל לשימוש אנליטי לניתוח של חולים שקיבלו שילוב ivacaftor או ivacaftor-lumacaftor להקל על נתוני ההשוואה ופרשנות של תוצאות של מחקרים פרמוקוקינטיים עתידיים. מדידה IVA, IVA-M1, IVA-M6 ו LUMA ב נוזלים ביולוגיים בטכניקות LC-MS יכול לגלם כלי רב עוצמה עבור חקר את היחסים חשיפה-תגובה ביחס לתוצאות טיפוליות.
באופן כללי יותר, HPLC-MS ניתוח של שילוב ivacaftor או ivacaftor-lumacaftor של נוזלים ביולוגיים עשוי לספק בסיס מולקולרי לביצוע ויישום אסטרטגיות pharmacotherapeutic בפעוט עם חולים הסובלים CF ואני יכול להוכיח שימושי בעילה עושה את טיפול משולב יקר של ivacaftor או ivacaftor-lumacaftor עלות יותר אפקטיבי, על ידי פוטנציאל המציין את הצורך מינון בתדירות נמוכה יותר. על-ידי החלת השיטה האנליטית המוצעת מחקרים קליניים פרמוקוקינטיים/pharmacodynamic, ההזדמנות צצה לה להמשיך לחקור את הפרמטרים פרמוקוקינטיים של שילוב ivacaftor או ivacaftor-lumacaftor על מטופל גדול יותר קולקטיבית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
J.L. T.V. נתמכים על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) של מכוני הבריאות הלאומיים (R01 AI111965). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח התצוגות הרשמי של המכון הלאומי של האלרגיה, מחלות זיהומיות או מכוני הבריאות הלאומיים. MC הוא NHMRC האוסטרלי חוקר בכיר. ג' ל' הוא אוסטרלי הלאומי לבריאות ו המועצה למחקר רפואי (NHMRC) עמית מחקר, בטלויזיה האוסטרלי NHMRC התעשייה הקריירה פיתוח ברמה 2 עמית מחקר. E.K.S 2017 השגריר הצעיר שנקבע עבור ASM (החברה האמריקאית למיקרוביולוגיה) והיא נתמכת על ידי כל הפרס לתארים מתקדמים אוסטרלי.
חלקים של עבודה זו הוצג ב 12תאנון Australiasian כנס סיסטיק פיברוזיס ב מלבורן (5-8ה של אוגוסט 2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVA (Cat#S114) | SelleckChem (USA). | ||
| LUMA (Cat#S1565) | SelleckChem (USA). | ||
| IVA-carboxylate (Cat# 510242247CS) | Clearsynth (Canada). | ||
| hydroxymethyl-IVA (Cat# 510240849CS) | Clearsynth (Canada). | ||
| Methanol (MeOH, LC-MS grade), | Sigma-Aldrich | ||
| acetonitrile (ACN, LC-MS grade) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid (FA) | Sigma-Aldrich | ||
| triple-quadrupole Shimadzu 8030 LC-MS | |||
| Phenomenex Kinetex (2.6 µm C8 100 Å; 50 × 2.1mm) | |||
| (KrudKatcher Ultrea HPLC In-Line Filter 0.5 m Depth Filter x 0.004inID). | |||
| 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tube (VWR). | |||
| Eppendorf Centrifuge 5430 | |||
| 13-mm syringe filter (0.45 µm nylon, GRACE, USA) | |||
| [Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 µL, PTFE/Silicone septa]. |
References
- Schneider, E. K., et al. Drug-drug plasma protein binding interactions of ivacaftor. J Mol Recognit. 28 (6), 339-348 (2015).
- Solomon, M., Leatte, P. N. Treatments for Cystic fibrosis. , (2009).
- O'Sullivan, B. P., Flume, P. The clinical approach to lung disease in patients with cystic fibrosis. Semin Respir Crit Care Med. 30 (5), 505-513 (2009).
- Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
- Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. 373 (3), 220-231 (2015).
- Hadida, S., et al. Discovery of N-(2,4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl)-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide (VX-770, ivacaftor), a potent and orally bioavailable CFTR potentiator. J Med Chem. 57 (23), 9776-9795 (2014).
- FDA. FDA Advisory Commitee Briefing Material VERTEX-FDA Pulmonary-Allergy drugs advisory commitee. 98 , VERTEX Pharmaceuticals Incorporated. (2015).
- Holmes, D. False dawn for cystic fibrosis disease modifiers? Nat Rev Drug Discov. 13 (10), 713-714 (2014).
- Veit, G., et al. Some gating potentiators, including VX-770, diminish DeltaF508-CFTR functional expression. Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297 (2014).
- Cholon, D. M., et al. Potentiator ivacaftor abrogates pharmacological correction of DeltaF508 CFTR in cystic fibrosis. Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297 (2014).
- EMA, Assessment report ORKAMBI (ivacaftor/lumacaftor) European medicines agency. , (2015).
- VERTEX. Vertex prescribing infomation. , (2015).
- Matthes, E., et al. Low free drug concentration prevents inhibition of F508del CFTR functional expression by the potentiator VX-770 (ivacaftor). Br J Pharmacol. 173 (3), 459-470 (2016).
- Schneider, E. K., et al. Development of HPLC and LC-MS/MS methods for the analysis of ivacaftor, its major metabolites and lumacaftor in plasma and sputum of cystic fibrosis patients treated with ORKAMBI or KALYDECO. J Chrom B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1038, 57-62 (2016).
- Su, Q., et al. An LC-MS/MS method for the quantitation of cabozantinib in rat plasma: application to a pharmacokinetic study. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 985, 119-123 (2015).
