Summary
Ivacaftor と ivacaftor lumacaftor の組み合わせは、2 つの新しい CF 薬です。ただし、まだ自分の PK/PD と薬理学の理解の不足があります。Ivacaftor 主要な代謝物と lumacaftor の同時解析のために最適化された HPLC MS 技術を提案します。
Abstract
嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子 (CFTR) の欠陥は、嚢胞性線維症 (CF)、生命にかかわる肺症状を病気の原因です。Ivacaftor (IVA) と ivacaftor lumacaftor (輝度) の組み合わせは、直接活動と欠陥 CFTR 蛋白質の輸送を調節する 2 つの新しい CF の画期的な薬です。ただし、薬物動態/薬力学パラメーターに関する理解の不足、ivacaftor と lumacaftor の薬理学はまだです。高速液体クロマトグラフィー MS ivacaftor、ヒドロキシメチル ivacaftor、ivacaftor-カルボン酸、および lumacaftor 標準の ivacaftor または ivacaftor lumacaftor の組み合わせを受けている患者の体液中の濃度の同時分析法治療は、以前されて私たちのグループによって開発され、FDA の基準を部分的に検証されます。ただし、患者サンプルの大きい数の高スループット解析をできるように、私たちのグループが小さい細孔サイズ逆相クロマトグラフィー コラムを使用して報告されたメソッドに最適化 (2.6 μ m、C8 100 Å; 50 x 2.1 mm) と溶媒混合系のグラデーション (0 1 分: 40 %b;1-2 分: 40-70 %b;2 2.7 分: 70 %b にて開催2.7 2.8 分: 70-90 %b;2.8-4.0 分: 90 %b 洗濯;4.0 4.1 分: 90-40 %b;4.1 6.0 分: 40 %b で開催) ではなくイソクラティック溶出。本研究の目的は、大量の患者のサンプルの分析のために不可欠であるサンプルあたり 6 分のみ 〜 15 分から大幅にサンプルあたりの高速液体クロマトグラフィー-質量分析時間を減らすことでした。これらの画期的な CF 薬物の量反応関係を研究のためかなりユーティリティのこの便宜的なメソッドになります。
Introduction
嚢胞性線維症 (CF) は肺、肝臓、膵臓、肺機能、膵機能不全1,の減少などの進行性多臓器不全を引き起こす腸の分泌粘液腺を含む一般的な遺伝的疾患2,3。Ivacaftor (IVA) は最初の食品医薬品局 (FDA 米国) と欧州医薬品庁 (EMA) 明らかな臨床的有効性の重要な生産と嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ (CFTR) 増強剤を含む薬を承認ベアリング G551D CFTR CF の患者の小さいサブセットでプラセボに対する肺機能の改善 [グリシン (G) 551 の位置にはアスパラギン酸 (D) 置き換え] ミスセンス変異 (CF 人口の 4 〜 5%)4,5。これは経口投与薬剤増加 CFTR チャネルを開く、塩化物イオン流を増加させると CF4,6の臨床症状につながる主要な欠陥に作用します。残念ながら、イヴァ単独療法は [フレーム位置 508 にフェニルアラニン (F) の損失の結果 CFTR 遺伝子の削除] でより一般的なホモ F508del 変異を有する患者における効果的なの 〜 50% に見られる変性 CFTR の結果CF 人口7,8。
最近、FDA は薬 lumacaftor CFTR 補正とイヴァを組み合わせることの承認を付与します。CFTR チャネル活性を増強する変調器 (IVA) を用いた細胞表面に F508del CFTR を救助する「CFTR 補正 (lumacaftor、LUMA) を組み合わせた巧妙な戦略効果的に CF 人口5のほとんどに治療ウィンドウを表示.競合レポートの数の臨床9,10時にその疑いが浮上しているようにこれらの薬が彼らの約束を果たすかどうか以上の質問が残っています。さらに、肺の機能の改善だけささやかな (2.6 4 の % であった ivacaftor lumacaftor 組み合わせ) 軸受 G551D 突然変異 (10.6 12.5%)8患者の IVA 単独で達成した成功と比較して。IVA とルミナンス ivacaftor lumacaftor 併用の臨床的有効性が制限される可能性がの潜在的な敵対的薬物相互作用は、その理想的な未満の薬物動態的特性7,11から来る。IVA は活性代謝物ヒドロキシメチル-イヴァ (IVA M1, M1) と不活性形 IVA-カルボン酸 (IVA M6 M6)7,12主にチトクローム p450 (CYP) によって代謝されます。CYP3A4 誘導ルミナンス、その一方で、広範囲で代謝されてし、は主としてそのまま糞便11に排泄されます。CYP3A4 誘導剤がチトクローム代謝を誘導する、ivacaftor (CYP3A4 基質) 濃度を減らすことができます。また、イヴァとルミナンスの両方は非常に疎水性の分子、~ 99% にバインドされる血漿蛋白 (アクティブ) 遊離型薬物濃度1,13を大幅に制限します。
総称して、これらの要因は、ivacaftor lumacaftor 併用の臨床的有効性を制限する一緒に来るかもしれません。Ivacaftor lumacaftor の組み合わせで現在服用下で最適な血中濃度を達成するかどうかまたはかどうか治療のしきい値は8を維持されますが不明です。現在、ピークといった薬物動態学的パラメーターに関する情報の少なさと ivacaftor または ivacaftor lumacaftor の定常状態血漿濃度があります。Ivacaftor と lumacaftor の指摘の代謝を考えると、すると、ivacaftor または ivacaftor lumacaftor 療法の最適用量レジメンを達成するために必要な暴露-反応関係の監視です。当社グループは最近、イヴァとルミナンス14の量反応関係の監視のための最初の高速液体クロマトグラフィー/液体クロマトグラフィー-質量方法を公開しました。これまで ivacaftor、その代謝産物および lumacaftor 濃度測定の代替技術は報告されていません。大規模患者集団の高スループット解析を許可し、分析時間を大幅に削減する、当社グループが小さい細孔サイズ逆相クロマトグラフィー コラムおよび勾配溶剤系を使用して報告された方法を最適化します。コストと実行時間を削減します。
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Protocol
倫理の承認からモナッシュ大学人間研究倫理委員会 (MUHREC) が得られた
。1 アッセイのアプリケーション: 患者サンプル コレクション
- とき患者と 150 mg ivacaftor または ivacaftor 125 mg/lumacaftor の標準的な量の時間を記録 200 mg。 。
- 注下患者の血液サンプルを収集するとき正確な時刻です
。 注: 24 時間コース上 4-5 の試料を収集をお勧めします。示された時間ポイントは 2.5-4 h ポスト ivacaftor または ivacaftor lumacaftor の組み合わせ投与、定常状態で C の 最大 濃度は後達成される場合のみ 1 つのサンプルのコレクションは、> 連続投与後 5 日 。
- 市販の未処理青いチューブの血液の 4 ~ 5 mL を収集します 。
- 全血のコレクションの後許可を室温で邪魔されずに残して凝固血
。 注: これは通常 15-30 分かかる - は、冷却遠心機で 4 ° C で 10 分間 1,000-2,000 × g で遠心分離によって血腫を除去します。プラズマとして結果の上澄みを指定します 。
- 遠心分離後すぐにパスツール ピペットを使用して清潔なポリプロピレン チューブに上清 (プラズマ) を転送します。プラズマ管を患者 ID を (例えば 患者 1)、(例えば、ivacaftor lumacaftor の組み合わせ)、投与薬と患者のサンプルの時間のラベルは収集した (例えば、2.5 時間後の投与量).
- の処理中に 2-8 ° C で維持するサンプル。処理が完了すると、ストアでサンプル – 20 ° C
- 必要に応じて、出荷サンプル分析研究所に承認されたクーリエ
。 注: サンプルをドライアイスに到着まで発送して保管 – 解析までの 80 ° C.
2。準備および発生したサンプルの処理と基準
注: ivacaftor/lumacaftor 療法を健康なドナーの世間知らずからプラズマがオーストラリア赤十字社から得られました。整合性を確保して収集と処理中にすべてサンプル/基準 2-8 ° C でおきます。処理が完了すると、ストアでサンプル – 20 ° C
- IVA、IVA-カルボン酸、ヒドロキシメチル-IVA、社内基準への参照となる輝度を量り 。
- LC MS グレードのメタノール 100 μ g/mL、10 μ g/mL の各試料 (IVA、M1、M6 および LUMA) の 2 つの独立した在庫ソリューションを準備します
。 注: 化合物は、ベンチトップで 10 日後切れます 。
- たて準備各解析実行前に液体クロマトグラフィー-質量校正標準器校正基準の濃度希釈原液以下の濃度を達成するためにひと血漿に: 0.01 0.025 0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 μ g/mL。これらのサンプルを基準と呼びます 。
- 蛋白質の沈殿物、アセトニ トリル (ACN、LC MS グレード) の 0.1% ギ酸 (FA) を準備し、必要になるまで冷蔵庫にしておきます 。
3。発生したサンプルおよび標準の前処理
- 部屋の温度平衡に両方の患者と空白の血漿サンプルを許可します 。
- 15 の血漿を混合する渦サンプル毎秒です 。
- 1.5 mL ポリプロピレン微量遠心チューブに基準のいずれかの空白プラズマまたは分析のための患者のサンプルの 100 μ 因数を転送します 。
- は、標準的な管のそれぞれに内部標準 IVA を追加 (例えば 0.01、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、および潜在的な濃度範囲をカバーする 10.0 μ G/ml)、蓋を閉めるし、2-3 s. 注内部標準の渦は、のみ空白のプラズマに追加と内部標準は患者のサンプルに追加されません 。
- 3.4 の手順を繰り返します内部の標準 M1、M6、ルミナンス。 。
- スピン ・ ダウン各チューブに簡単に蓋の上に水滴がないことを確認します 。
- 0.1% のミックスの追加 200 μ L を血しょう蛋白質を沈殿させた各チューブに ACN で FA 。
- 渦約 15 のために精力的に混合 s.
- 冷蔵庫に 10 分放置する管を許可します 。
- 可能であれば 4 ° C で 10 分間、10,000 × g で遠心分離機します 。
- 1.5 mL の HPLC バイアルに 13 mm のシリンジ フィルター通過の上清 200 μ L 因数をフィルター処理します 。
- 高速液体クロマトグラフィー質量分析用 LC MS バイアルに上澄みの転送 100 μ L.
4。高速液体クロマトグラフィー質量分析
注: トリプル四重極質量分析計 (表 1) と相まって LC MS システム上の高速液体クロマトグラフィー-質量分析を行った.
- に LC MS システム上自動サンプラでサンプルとトレイを配置します 。
- ガード列に列し LC MS システムに接続します 。
- 移動相の両方の本を添付 (ボトル a: 100 %acn; ボトル水の b: 0.1% ギ酸) LC MS システムの平衡と 。
- 次パラメーターを組み込む LC MS プロトコル。
- 2:1 の比率で質量分析計に入る前に移動相の流れを分割 (廃棄物: MS 入口).
- グラジエント移動相に水の 100 %acn と 0.1% ギ酸を使用して 0.5 mL/min の流量での実行 (開始点、40: 60 で v/v)。移動相の容積 % 分析を通じて変更されるに注意してください 。
- 肯定的なエレクトロ スプレー イオン化モードで質量を操作します 。
- LC MS 設定は次のとおりであることを確認: イオン スプレー電圧 4.5 kV、衝突エネルギー 295.9 V、噴霧ガス: 3 L/分で窒素; 衝突ガス: アルゴン; 乾燥ガス 20 L/分の流量、電圧 Q3 のレンズ:-22 V、溶媒の温度熱ブロック 250 ° C400 の温度 ° C
- サンプルあたり注入 10 μ L のボリューム 。
- 監視 (MRM) 複数の反応を利用して検出検体。M/z 392.49 のイオンの遷移を監視 →、393 m/z 408.49 → 409、m/z 422.47 → 423 と m/z 452.40 → ルミナンス、イヴァ M6、イヴァ M1 IVA 453 それぞれ
。 注: 新しく最適化されたメソッドがまだされて完全に FDA の基準に従って検証される 。
5。較正曲線
- 構築 LC MS 内部標準へ 4 つの analytes のそれぞれのピーク面積比との校正の標準的な公称濃度との関係を使用して各解析実行前に検LC MS 設定プログラム内 ivacaftor (IVA M1、イヴァ M6 またはルミナンス).
注: 検量線の建設のための正確な手順は使用されている LC MS 機器のモデルによって異なります。この情報機器マニュアルにあります 。
- によると濃度の逆数 1/C 2 を重み付けによる線形最小二乗回帰分析を実行します 。
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Representative Results
我々 は最近の C8 列 (5 μ m、内径 3.9 × 50 mm) を用いた 100% 水 (40: 60 の ACN と 0.1% ギ酸から成る移動相をトリプル四重極液体クロマトグラフィー-質量と高速液体クロマトグラフィー検出器システム、FDA の基準を部分的に検証メソッドに報告しています。、v/v) 1 mL/min の流速で。すべての代謝物、ivacaftor、Iva M1、Iva-M6、lumacaftor14のひと血漿は 0.01 から 10 μ g/mL までの濃度範囲でピークの相関を認めた.このメソッドを最適化されていますここで劇的に許可する LC 保持時間あり、したがって臨床サンプルの大量の高スループット分析のために不可欠である試金の完全な実行時間を削減します。アッセイは、小さい細孔サイズ逆相クロマトグラフィー コラムおよび 〜 15 分からわずか 6 分にサンプルあたりの時間を短縮、アイソクラティック代わりに勾配溶剤系を使用して最適化されていました。イオンクロマトグラフィーは、監視 (MRM) 複数の反応を用いたエレクトロ スプレー肯定的なモードで決定されます。14以前詳細しているので、使用前に社内の手順を検証しなければなりません。
法の精度は、検体14によって 94.2% ± 4.53% 97.5% ± 2.94% をだった。0.01 から 10 μ G/ml の校正範囲は臨床設定で使用するため該当する特に ivacaftor lumacaftor 療法の下アクティブ IVA と M1 の非常に低濃度によって報告された当社グループ以前は、潜在的にプラズマのことを考えるルミナンス、広範な IVA 代謝14の結果による CYP3A4 の誘導。各試料の日中精度は 0.05、0.5、および 8 μ g/mL の濃度で同じ日に六つの独立準備の品質管理 (QC) サンプルで評価されました。連続 3 日間六つの独立準備 QC サンプル間日精度を評価しました。正確さと精度は相対標準偏差 (RSD) 経由で算出しました。各 QC サンプルの RSD の値が 15% 未満にする必要があります15。すべての 4 つの分析を示した RSD 15% 未満14。(LOD) の検出と定量化 (LOQ) の下限が確立された: イヴァ LOD 2.50 x 10-3 μ g/mL と 10-3 μ g/mL; x LOQ 7.57m1、LOD 4.57 x 10-4 μ g/mL と LOQ 1.38 x 10-3 μ g/ミリリットルです。M6 の LOD 5.86 x 10-4 μ g/mL と LOQ 1.78 x 10-3 μ g/ミリリットルです。ルミナンス LOD 10-4 μ g/mL x 6.08 と × 10-3 μ g/mL14LOQ 1.84 だった。代表的なクロマト グラムを図 1に示します。100% 水の ACN と 0.1% ギ酸の移動相を用いたガスクロマトグラフィーによる解像度を最適化が得られた (始点で、40: 60 v/v) C8 カラムでグラジエントと (2.6 μ m; 100 Å; 50 mm x 2.1 mm)。勾配分離移動相 B 0 から 1 分; 40% で使用されていたその後、移動相 B 1 分から 2 分; の 40-70%移動相 B 2 分から 2.7 分; の 70% を保有70% から 2.8 分; 2.7 分から移動相 B の 90% に増加移動相 B 2.8 分から 4.0 分目的を洗浄のための 90% を保有最終的に 4.1 分; 4.0 分からモバイル B の 40% に 90% から戻ってください。移動相 B 4.1 分から 6.0 分初期条件 (図 1) のための 40% を保有し。LC の保持時間の通りで M6 1.0 分;M1 1.3 分;イヴァの: 1.55 分;ルミナンスの: 2.3 分 (図 1)。すべての空白の血漿分析検体のいずれかの保持時間との干渉が認められず, も lumacaftor と ivacaftor の組み合わせからの干渉が検出されました。
図 1:ひと血漿 10 μ g/ml のポンプのグラジエントに関連して ivacaftor、lumacaftor、イヴァ M1 IVA M6 のスパイクの代表 LC-MS クロマト グラム。水とポンプ B 100% アセトニ トリルの 0.1% ギ酸 (0 1 分: 40 %b; 1-2: 00%-70% の B; 2-2.7 分: 3.8 4.0 分: 90 %b 洗濯; 2.7 2.8 分: 70% 90% B B 70% で開催 4.0 4.1 分: 90% 40 %b; 4.1 6.0 分: 40 %b で開催)。M/z 452.40 → 453 m/z 422.47 → 423、 m/z 408.49 → 409 m/z 392.49 → 393 イオン遷移は、MS/MS の使用された ivacaftor、イヴァ-M1、イヴァ M6、lumacaftor、それぞれの監視します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 高速液体クロマトグラフィー条件 | |
| 列 | C8;2.6 μ m;100 Å;50 x 2.1 mm |
| ガードカラム | 高速液体クロマトグラフィーのライン フィルター 0.5 μ m;0.004 inID x デプス フィルター |
| フィルター 0.004 inID × | |
| カラム温度: | 30 ° C |
| 移動相 a: | 0.1% 水で FA |
| 移動相 b: | 100% ACN |
| スタート地点で移動相組成 | 60/40 (v/v) |
| サンプル温度: | 4 ° C |
| 注入量: | 5 Μ L |
| 針洗浄 | 80% メタノール 20% 水 300 μ L |
| 流量: | 0.5 mL/分 |
| グラデーション: | 1:00 %b |
| -1-2: 00% - 70% の B | |
| -2.7 分 2: 70 %b にて開催 | |
| -2.7 - 2.8 分: 70% - 90 %b | |
| -2.8 - 4.0 分: 90 %b 洗濯 | |
| -4.0 - 4.1 分: 90% - 40% | |
| 4.1 6.0 分: 40% で開催 | |
| 総実行: | 6 分 |
| 保存期間: | M6 の保存期間: 1.0 分 |
| M1 の保存期間: 1.3 分 | |
| イヴァの保存期間: 1.55 分 | |
| ルミナンスの保存期間: 2.3 分 | |
| MS の条件 | |
| 検出モード: | エレクトロ スプレー肯定的な ESI + |
| イオン スプレー電圧: | 4.5 kV |
| 衝突エネルギー: | 295.9 V |
| 噴霧ガス (窒素): | 3 L/分 |
| CID のガス: | 230 kPa |
| 乾燥ガス (窒素) の流れ: | 20 リットル/分 |
| Q1 前ロッドのバイアス: | - ・ #1 |
表 1: 高速液体クロマトグラフィー MS 条件の詳細。
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Discussion
既報のように、私たちのグループは、初めて開発および HPLC や LCMS 迅速検出と ivacaftor とヒドロキシメチル IVA M1 (アクティブ) とイヴァ カルボン酸 M6 (非アクティブ); その主要代謝物の定量法を検証血漿および CF の患者の14の喀痰中 lumacaftor。以前私たちのグループによって報告されたアッセイ ルミナンス、IVA、イヴァ-M1 とプラズマで IVA M6 の濃度とイヴァ 150 mg/q12 h と定常状態標準治療を受けている CF の患者の喀痰を定量化する採用されました (ラテン語の用語: quaque12 h;12 時間間隔) または 200 mg/q12 h ルミナンス 125 mg/q12 h IVA の組み合わせ14。患者サンプルを大量の高スループット分析のため小さい細孔サイズ逆相クロマトグラフィー コラム C8 を使用して報告されたメソッドを最適化 (2.6 μ m; 100 Å; 50 x 2.1 mm2)、現在ではなくグラデーション溶剤システムアイソクラティック。これは 1 サンプルあたり 6 分に実行時間を短縮します。
この信頼性の高い、新しい方法では、体液で ivacaftor と ivacaftor lumacaftor の組み合わせの治療薬を監視するための簡易、高感度かつ迅速なアプローチを提供しています。医療費を含むと同様、薬の有効性を最大化するために暴露-反応関係を開発する必要性を考えるより敏感なツールは、開発、臨床医を証拠基づかせていた療法と高スループットを使用して支援するために検証する必要があります。分析技術 cf. 当社グループの患者の以前報告して部分的に検証済みの高速液体クロマトグラフィー MS プラズマと CF の患者の14の喀痰で IVA、イヴァ M1、イヴァ-M6、ルミナンスを同時に分析します。Ivacaftor または ivacaftor lumacaftor の組み合わせを受け取っている患者の分析のための一般的な簡単に使用できる分析プロトコルを確立するデータ比較と将来の薬物動態学的研究の結果の解釈を容易にするでしょう。LC MS 技術を使用して体液の IVA、イヴァ M1、イヴァ-M6、輝度を測定は治療アウトカムとの関係暴露-反応関係を探索するための強力なツールを具現化する可能性があります。
もっと一般に、体液の ivacaftor または ivacaftor lumacaftor の組み合わせの高速液体クロマトグラフィー質量分析 CF 患者個別化薬物療法戦略の実装の分子基盤を提供可能性があり、証明するかもしれない可能性があるより頻繁に投与の必要性を示すことでよりコスト効率の高い、高価な ivacaftor または ivacaftor lumacaftor 併用療法を作る理由に便利です。さらに大きな患者に ivacaftor または ivacaftor lumacaftor の組み合わせの薬物動態学的パラメーターを調査する分析手法を臨床薬物動態/薬力学試験に適用し, 機会が生じています。集団。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
J. l. と t. v. は、国立研究所のアレルギーおよび感染症 (NIAID) の健康の国民の協会 (R01 AI111965) によってサポートされます。内容は著者の責任と国立研究所のアレルギーと感染症や健康の国民の協会の公式の見解を必ずしも表さない。三菱商事は、オーストラリア NHMRC 首席研究員です。J. l. はオーストラリア国立保健医療研究評議会 (NHMRC) 主任研究員、および t. v. は、オーストラリア NHMRC 産業キャリア開発レベル 2 研究員。E.K.S は、ASM (微生物学のためのアメリカの社会) の任命された若者大使 2017年でオーストラリアの大学院賞を受賞しています。
この作業の一部は、Australiasian 会議メルボルンに嚢胞性線維症 (2017 年 8 月の 5-8日) 12thで発表されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVA (Cat#S114) | SelleckChem (USA). | ||
| LUMA (Cat#S1565) | SelleckChem (USA). | ||
| IVA-carboxylate (Cat# 510242247CS) | Clearsynth (Canada). | ||
| hydroxymethyl-IVA (Cat# 510240849CS) | Clearsynth (Canada). | ||
| Methanol (MeOH, LC-MS grade), | Sigma-Aldrich | ||
| acetonitrile (ACN, LC-MS grade) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid (FA) | Sigma-Aldrich | ||
| triple-quadrupole Shimadzu 8030 LC-MS | |||
| Phenomenex Kinetex (2.6 µm C8 100 Å; 50 × 2.1mm) | |||
| (KrudKatcher Ultrea HPLC In-Line Filter 0.5 m Depth Filter x 0.004inID). | |||
| 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tube (VWR). | |||
| Eppendorf Centrifuge 5430 | |||
| 13-mm syringe filter (0.45 µm nylon, GRACE, USA) | |||
| [Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 µL, PTFE/Silicone septa]. |
References
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