Summary
Combinazione di ivacaftor e ivacaftor-lumacaftor sono due nuovi farmaci CF. Tuttavia, c'è ancora una carenza di comprensione sulle loro PK/PD e farmacologia. Presentiamo una tecnica ottimizzata di HPLC-MS per l'analisi simultanea di ivacaftor e suoi metaboliti principali e lumacaftor.
Abstract
Difetti nel regolatore di conduttanza del trans-membrana di fibrosi cistica (CFTR) sono la causa della fibrosi cistica (CF), una malattia con le manifestazioni polmonari mortali. Ivacaftor (IVA) e combinazione di ivacaftor-lumacaftor (LUMA) sono due nuovi farmaci svolta CF che modulano direttamente l'attività e il traffico della proteina CFTR difettosa. Tuttavia, c'è ancora una carenza di comprensione sui parametri di farmacocinetica/farmacodinamica e la farmacologia di ivacaftor e lumacaftor. La tecnica HPLC-MS per l'analisi simultanea delle concentrazioni di ivacaftor, idrossimetil-ivacaftor, ivacaftor-carbossilato e lumacaftor nei fluidi biologici in pazienti che ricevono la combinazione standard di ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor la terapia è stata precedentemente sviluppato dal nostro gruppo e parzialmente convalidata a norme FDA. Tuttavia, per consentire l'analisi di alto-rendimento di un numero maggiore di campioni di pazienti, il nostro gruppo ha ottimizzato il metodo segnalato attraverso l'uso di una colonna di cromatografia a fase inversa di dimensioni dei pori più piccolo (2,6 µm, C8 100 Å; 50 x 2.1 mm) e un sistema solvente gradiente ( 0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: detenuta al 70% B; 2,7-2,8 min: 70-90% B; 2,8-4,0 min: 90% lavaggio B; 4.0-4,1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: detenuta al 40% B) invece di un'eluizione isocratica. L'obiettivo di questo studio era quello di ridurre i tempi di analisi di HPLC-MS per campione drammaticamente da ~ 15 min a solo 6 min per campione, che è essenziale per l'analisi di una grande quantità di campioni di pazienti. Questo metodo vantaggioso sarà di notevole utilità per gli studi di relazioni esposizione-risposta tra queste droghe CF svolta.
Introduction
Fibrosi cistica (CF) è una comune malattia genetica che coinvolge le ghiandole esocrine muco di polmone, fegato, pancreas e intestino provocando progressiva insufficienza multi-organo, come ad esempio un declino della funzione polmonare e insufficienza pancreatica1, 2,3. Ivacaftor (IVA) è il primo Food and Drug Administration (FDA-US) e Agenzia europea dei medicinali (EMA) ha approvato la fibrosi cistica trans-membrana conduttanza regolatore (CFTR) potenziatore farmaco, con efficacia clinica dimostra producendo un significativo miglioramento nella funzione polmonare rispetto al placebo in un piccolo sottoinsieme dei pazienti CF cuscinetto G551D-CFTR [glicina (G) in posizione 551 è sostituita da acido aspartico (D)] mutazione di senso sbagliato (~ 4-5% della popolazione CF)4,5. Questo oralmente amministrato droga aumenta il canale CFTR aprire, così aumentando il flusso di ioni cloruro e che agiscono per il difetto primario che conduce alle manifestazioni cliniche di CF4,6. Purtroppo, l'IVA in monoterapia non è efficace in pazienti con la mutazione F508del omozigote più comune [in omissione della struttura del gene CFTR che provoca la perdita di fenilalanina (F) in posizione 508] che si traduce in misfolded CFTR, che è visto in circa 50% di la popolazione CF7,8.
Recentemente, il FDA ha concesso l'approvazione per la combinazione di IVA con il correttore CFTR droga lumacaftor. La strategia intelligente di combinare un correttore CFTR (lumacaftor, LUMA) che salva F508del-CFTR alla superficie delle cellule con un modulatore (IVA) che rafforza l'attività canale CFTR, efficacemente si espande la finestra di trattamento per la maggior parte della popolazione CF5 . Domande rimangono sopra se queste droghe soddisfare loro promessa come un numero di rapporti conflittuali è emerse che messo in dubbio sulla loro efficacia clinica9,10. Inoltre, miglioramenti nella funzione polmonare sono stati solo modesti (2.6-4% per la combinazione di ivacaftor-lumacaftor) rispetto al successo raggiunto con IVA in monoterapia in pazienti portatori di una mutazione (10.6-12,5%) di G551D8. Potenziali interazioni farmaco-farmaco antagonista tra IVA e LUMA che potenzialmente limitare l'efficacia clinica di ivacaftor-lumacaftor combinazione provengono dalla sua proprietà farmacocinetiche meno ideale7,11. IVA è ampiamente metabolizzata dagli enzimi del citocromo P450 (CYP), principalmente per un metabolita attivo idrossimetil-IVA (IVA-M1, M1) e una forma inattiva IVA-carbossilato (IVA-M6, M6)7,12. Induttore del CYP3A4, LUMA, d'altra parte, non è ampiamente metabolizzato e in gran parte viene escreta immodificata nelle feci11. Come induttori di CYP3A4 inducono il metabolismo del citocromo, concentrazioni di ivacaftor (substrato del CYP3A4) potrebbero essere ridotto. Inoltre, sia IVA e LUMA sono molecole molto idrofobe e sono ~ 99% legato alle proteine plasmatiche, che limita notevolmente la concentrazione di farmaco libero (attivo)1,13.
Collettivamente, questi fattori possono essere venuta insieme a limitare l'efficacia clinica di combinazione di ivacaftor-lumacaftor. Non è noto se le concentrazioni plasmatiche ottimali sono raggiunti sotto l'attuale regime di dosaggio per combinazione di ivacaftor-lumacaftor o se la soglia terapeutica è mantenuta8. Attualmente, ci è una scarsità di informazioni per quanto riguarda i parametri farmacocinetici come il picco e le concentrazioni plasmatiche allo steady-state di ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor. Dato il metabolismo noto di ivacaftor e lumacaftor, monitoraggio delle relazioni esposizione-risposta è il requisito per raggiungere regimi di dosaggio ottimale per il trattamento di ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor. Il nostro gruppo ha recentemente pubblicato il primo metodo HPLC/LC-MS per il monitoraggio delle relazioni di esposizione-risposta di IVA e LUMA14. Nessun tecniche alternative di misurare le concentrazioni di ivacaftor, suoi metaboliti e lumacaftor sono stato segnalato fin qui. Per consentire l'analisi di alto-rendimento di un collettivo più grande paziente e ridurre drasticamente i tempi di analisi, il nostro gruppo ha ottimizzato il metodo segnalato attraverso l'uso di una colonna di cromatografia a fase inversa di dimensioni dei pori più piccola e un sistema solvente gradiente che riduce i costi e tempi di esecuzione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
approvazione per l'etica è stata ottenuta da Monash University umana ricerca etica Comitato (MUHREC).
1. applicazione del dosaggio: raccolta del campione di paziente
- registrare il momento in cui il paziente prende loro dose standard di 150 mg ivacaftor o /lumacaftor di 125 mg di ivacaftor 200 mg.
- Nota giù l'ora esatta quando il campione di sangue del paziente è raccolto.
Nota: Si consiglia la raccolta di campioni di 4-5 sopra un corso di tempo di 24 ore. Se la raccolta di un solo campione è possibile, il punto di tempo indicato è 2.5-4 h post ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor combinazione dosaggio come C max le concentrazioni allo steady state sarà raggiungibile dopo > 5 giorni di trattamento consecutivo. - Raccogliere 4-5 mL di sangue in provette blu non trattati commercialmente disponibile.
- Dopo la raccolta del sangue intero, permettere al sangue di coagularsi lasciando indisturbati a temperatura ambiente.
Nota: Questo di solito richiede 15-30 min. - Rimuovere il coagulo mediante centrifugazione a 1.000-2.000 x g per 10 min a 4 ° C in una centrifuga refrigerata. Designare il surnatante risultante come plasma.
- Dopo la centrifugazione, immediatamente trasferire il surnatante (plasma) in una provetta pulita in polipropilene utilizzando una pipetta Pasteur. Etichetta il plasma tube con l'ID del paziente (ad es., 1 paziente), il farmaco somministrato (ad es., combinazione di ivacaftor-lumacaftor) e tempo campione del paziente era raccolti (ad esempio, post-dosaggio 2,5 h).
- Mantenere i campioni a 2-8 ° C durante la movimentazione. Una volta completata la gestione, conservare i campioni a – 20 ° C.
- Se necessario, nave campioni con un corriere autorizzato all'Istituto analyzing.
Nota: I campioni devono essere spediti su ghiaccio secco fino all'arrivo e deve essere tenuti a – 80° C fino all'analisi.
2. Preparazione ed elaborazione di campioni sostenute e standard
Nota: Plasma da donatori sani naive alla terapia di ivacaftor/lumacaftor è stato ottenuto dalla croce rossa australiana. Per garantire l'integrità, tutti campioni/standard dovrebbe essere mantenuto a 2-8 ° C durante la raccolta e l'elaborazione. Una volta completata la gestione, conservare i campioni a – 20 ° C.
- Pesare IVA, IVA-carbossilato, idrossimetil-IVA e LUMA che servirà come riferimento per le altre norme interne.
- Preparare due soluzioni di riserva indipendente di ciascun analita (IVA, M1, M6 e LUMA) in metanolo LC-MS a 100 µ g/mL e a 10 µ g/mL.
Nota: Composti scade dopo 10 giorni sul banco. - Appena preparare gli standard di calibrazione di LC-MS prima di ogni esecuzione analitica diluendo gli standard di calibrazione soluzioni stock in plasma umano per realizzare a seguito di concentrazioni: 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 e 10.0 µ g/mL. Questi campioni sono indicati come standard.
- Di precipitare le proteine, preparare acido formico 0.1% (FA) in acetonitrile (ACN, grado di LC-MS) e lasciare in frigorifero fino a quando necessario.
3. Pretrattamento dei campioni sostenute e standard
- consentire entrambi campioni di plasma paziente e vuoto stabilizzare a temperatura ambiente.
- Vortice di mescolare ogni campione di plasma per 15 s per esempio.
- Trasferire un'aliquota di 100 µ l di entrambi plasma vuoto per standard o campioni per l'analisi in una provetta da 1,5 mL in polipropilene microcentrifuga.
- Aggiungere l'IVA standard interna in ciascuna delle provette standard (ad es., 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 e 10.0 µ g/mL per coprire la gamma potenziale di concentrazione), chiudere il coperchio e agitare con vortex per 2-3 s. nota che standard interno è solo aggiunto al plasma vuoto e standard interno non è aggiunto ai campioni dei pazienti.
- Ripetere il punto 3.4. per le altre norme interne M1, M6 e LUMA.
- Spin giù ogni tubo brevemente per garantire che non ci sono nessun goccioline sul coperchio.
- Aggiungere 200 µ l della miscela dello 0,1% FA in ACN in ciascuna provetta per precipitare le proteine del plasma.
- Vortice la miscela vigorosamente per circa 15 s.
- Consentire tubi riposare per 10 minuti in frigorifero.
- Centrifugare a 10.000 x g per 10 min a 4 ° C, se possibile.
- Filtrare un'aliquota di 200 µ l del surnatante attraverso un filtro per siringa 13 mm in una fiala di 1,5 mL HPLC.
- Trasferire 100 µ l del surnatante nel flaconcino di LC-MS per l'analisi di HPLC-MS.
4. Analisi HPLC-MS
Nota: The HPLC-MS analisi è stata eseguita su un sistema LC-MS accoppiato con lo spettrometro di massa triplo quadrupolo (tabella 1).
- Girare sul sistema LC-MS, posizionare il vassoio con i campioni nel auto-campionatore.
- Fissare la colonna a una colonna di guardia e connettersi al sistema LC-MS.
- Collegare entrambe le bottiglie di fasi mobili (bottiglia r: 100% ACN; bottiglia b: 0,1% acido formico in acqua) ed equilibrare il sistema LC-MS.
- Incorporare i seguenti parametri del protocollo di LC-MS.
- Dividere il flusso della fase mobile prima di entrare lo spettrometro di massa in un rapporto 2:1 (rifiuti: MS inlet).
- Eseguire un'eluizione di pendenza ad una portata di 0,5 mL/min utilizzando una fase mobile composto da 100% di acido formico ACN e 0,1% in acqua (partenza alle 40: 60, v/v). Si noti che la percentuale di volume della fase mobile cambia nel corso di analisi.
- Operare lo spettrometro di massa in una modalità di ionizzazione electrospray positivo.
- Assicurarsi che le impostazioni di LC-MS sono i seguenti: tensione di ioni spray 4,5 kV, energia di collisione 295,9 V, gas di nebulizzazione: azoto a 3 L/min; gas di collisione: argon; essiccazione gas portata 20 L/min, tensione Q3 dell'obiettivo:-22 V, desolvatazione temperatura 250 ° C con un blocco di calore temperatura di 400 ° C.
- Iniettare 10 µ l per campione.
- Rilevare analiti usando la reazione più monitoraggio (MRM). Monitorare le transizioni dello ione m/z 392.49 → 393, m/z 408.49 → 409, m/z 422.47 → 423 e m/z 452.40 → 453 per IVA, IVA-M1, IVA-M6 e LUMA, rispettivamente.
Nota: Il metodo appena ottimizzato ha ancora completamente essere convalidati secondo le norme FDA.
5. Curve di calibrazione
- costrutto la LC-MS curve di calibrazione prima di ogni esecuzione analitica utilizzando il rapporto tra i rapporti di area di picco di ciascuna delle quattro analiti di standard interno e le concentrazioni nominali standard di calibrazione di ivacaftor (IVA-M1, IVA-M6 o LUMA) all'interno del programma di impostazioni di LC-MS.
Nota: La procedura esatta per la costruzione della curva di taratura dipende dal modello di LC-MS attrezzature utilizzate. Queste informazioni possono essere disponibili nel manuale attrezzature. - 1/C 2 secondo il reciproco delle concentrazioni di ponderazione per eseguire analisi di regressione di minimi quadrati lineari.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Recentemente abbiamo segnalato un metodo convalidato parzialmente ai campioni della FDA, su un triplo quadrupolo LC-MS e un sistema rivelatore HPLC, utilizzando una colonna C8 (5 µm, 3,9 mm x 50 mm di diametro interno) con la fase mobile composto da 100% ACN e 0,1% acido formico in acqua (40: 60 v/v) con una portata di 1 mL/min. Una correlazione lineare dei picchi è stata osservata in un intervallo di concentrazione da 0,01 a 10 µ g/mL in plasma umano per tutti i metaboliti, ivacaftor, Iva-M1, M6 Iva e lumacaftor14. Qui questo metodo è stato ottimizzato per consentire drammaticamente ridotto LC tempi di ritenzione e, di conseguenza, il tempo di esecuzione completo del test, che è essenziale per l'analisi di alto-rendimento di una grande quantità di campioni clinici. Il dosaggio è stato ottimizzato attraverso l'utilizzo di una colonna di cromatografia a fase inversa di dimensioni dei pori più piccola e un sistema solvente gradiente invece un'eluizione isocratica, riducendo il tempo per campione da ~ 15 min a soli 6 min. Gli analiti sono determinati in modalità positiva electrospray usando la reazione più monitoraggio (MRM). La procedura deve essere convalidata internamente prima dell'uso, come abbiamo precedentemente dettagliate14.
La precisione del metodo è stata 94,2% ± 4,53 al 97,5% ± 2.94%, a seconda l' analita14. Il campo di taratura da 0,01 a 10 µ g/mL è applicabile per l'utilizzo in ambito clinico, in particolare, dato che nell'ambito della terapia di ivacaftor-lumacaftor, concentrazioni molto basse di attivo IVA e M1 sono state segnalate dal nostro gruppo in precedenza, nel plasma potenzialmente causa di l'induzione di CYP3A4 da LUMA, che si traduce in vasto IVA metabolismo14. La precisione intra-day di ciascun analita è stata valutata con sei campioni preparati in modo indipendente di controllo di qualità (QC) lo stesso giorno alle concentrazioni di 0,05 e 0,5 8 µ g/mL. La precisione inter-giorno è stata valutata con sei campioni QC indipendentemente preparati per tre giorni consecutivi. Accuratezza e precisione sono stati calcolati tramite la deviazione standard relativa (RSD). Per ciascun campione di controllo di qualità, i valori RSD dovrebbero essere inferiore al 15%15. Tutti gli quattro analiti hanno mostrato valori RSD inferiore al 15%14. Il limite inferiore di rilevabilità (LOD) e quantificazione (LOQ) sono stati stabiliti: per IVA LOD 2,50 x 10-3 µ g/mL e LOQ 7,57 x 10-3 µ g/mL; per M1, LOD 4.57 x 10-4 µ g/mL e LOQ 1,38 x 10-3 µ g/mL; per M6 LOD 5.86 x 10-4 µ g/mL e LOQ 1.78 x 10-3 µ g/mL; per LUMA LOD era 6.08 x 10-4 µ g/mL e LOQ 1.84 x 10-3 µ g/mL14. Un tipico cromatogramma è illustrato nella Figura 1. Una risoluzione cromatografica ottimizzata è stata ottenuta usando una fase mobile del 100% di acido formico ACN e 0,1% in acqua (partenza alle 40: 60, v/v) con un'eluizione di pendenza su una colonna C8 (2,6 µm; 100 Å; 50 mm x 2,1 mm). La separazione di gradiente è stata utilizzata con 40% di fase mobile B da 0 a 1 min; quindi 40% - 70% della fase mobile B da 1 min a 2 min; detengono il 70% della fase mobile B da 2 min a 2,7 min; aumento dal 70% al 90% della fase mobile B dal min 2,7 al 2,8 min; tenendo il 90% della fase mobile B da min 2,8 a 4,0 min per il lavaggio di scopi; finalmente ritorno dal 90% al 40% del mobile B da 4,0 min a 4,1 min; quindi detenendo il 40% della fase mobile B da 4,1 min a 6,0 min per condizioni iniziali (Figura 1). I tempi di ritenzione di LC erano come segue per M6 1.0 min; per M1 1.3 min; per IVA: 1,55 min; per LUMA: 2,3 min (Figura 1). In tutti i campioni di plasma in bianco, è stata osservata alcuna interferenza con il tempo di ritenzione di entrambi gli analiti, né era interferenza rilevata dalla combinazione di ivacaftor con lumacaftor.
Figura 1 : Rappresentante LC-MS cromatogramma di plasma umano addizionato con 10 µ g/mL di IVA-M6, IVA-M1, lumacaftor e ivacaftor in relazione l'eluizione di pendenza della pompa. Un acido formico 0,1% in acqua e pompa B 100% acetonitrile (0-1 min: 40% B; 1-2:00 %-70% B; 2-2.7 min: detenuta al 70% B; 2,7-2,8 min: 70%-90% B; 3,8-4,0 min: 90% B lavatrice; 4.0-4,1 min: 90%-40% B; 4.1-6.0 min: detenuta al 40% B). Le transizioni dello ione di m/z 392.49 → 393, m/z 408.49 → 409, m/z 422.47 → 423 e m/z 452.40 → 453 sono state utilizzate per MS/MS monitoraggio di ivacaftor, IVA - M1, M6 IVA e lumacaftor, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Condizioni HPLC | |
| Colonna | C8; 2.6 µm; 100 Å; 50 x 2.1 mm |
| Colonna di guardia | HPLC In linea filtro 0,5 µm; Filtro di profondità x 0,004 inID |
| Filtro x 0,004 inID | |
| Temperatura della colonna: | 30 ° C |
| Fase mobile a: | 0,1% FA in acqua |
| Fase mobile b: | 100% ACN |
| Composizione della fase mobile al punto di partenza | 60 / 40 (v/v) |
| Temperatura del campione: | 4 ° C |
| Volume di iniezione: | 5 Μ l |
| Lavaggio dell'ago | 80% metanolo, 20% acqua 300 µ l |
| Tasso di flusso: | 0,5 mL/min |
| Pendenza: | 1:00 % B |
| -1-2:00 % - 70% B | |
| -2-2,7 min: detenuta al 70% B | |
| -2,7 - 2,8 min: 70% - 90% B | |
| -2,8 - 4,0 min: 90% B lavaggio | |
| -4,0 - 4,1 min: 90% - 40% | |
| -4.1-6,0 min: detenuta al 40%, | |
| Totale di esecuzione: | 6 min |
| Tempi di ritenzione: | Tempo di ritenzione per M6: min 1,0 |
| Tempo di ritenzione per M1: 1,3 min | |
| Tempo di ritenzione per IVA: 1,55 min | |
| Tempo di ritenzione per LUMA: 2,3 min | |
| Condizioni di MS | |
| Modalità di rilevazione: | elettrospray ESI positiva + |
| Tensione di spruzzo dello ione: | 4.5 kV |
| Energia di collisione: | 295,9 V |
| Ampolla nebulizzatrice Gas (azoto): | 3 L/min |
| Gas di CID: | 230 kPa |
| Essiccazione di flusso di gas (azoto): | 20 L/min |
| Polarizzazione di Q1 pre-asta: | - & #1 |
Tabella 1: Dettagli delle condizioni HPLC-MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Come precedentemente segnalato, il nostro gruppo ha per la prima volta sviluppato e convalidato un metodo HPLC e LC-MS per tempestiva rilevazione e quantificazione di ivacaftor e dei suoi principali metaboliti M1 idrossimetil-IVA (attivo) e IVA-carbossilato M6 (inattivo); e lumacaftor nel plasma e dell'espettorato di pazienti CF14. Il saggio segnalato dal nostro gruppo precedentemente è stato usato con successo per quantificare la concentrazione di LUMA, IVA, IVA-M1 e IVA-M6 nel plasma ed espettorato di pazienti con fibrosi cistica sottoposti a terapia standard allo stato stazionario con IVA 150 mg /q12 h (terminologia latina: quaque 12 h; una volta ogni 12 h) o 200 mg /q12 h LUMA-125 mg /q12 h IVA combinazione14. Per l'analisi ad alta velocità di grandi quantità di campioni di pazienti, abbiamo ottimizzato il metodo segnalato utilizzando una colonna di cromatografia a fase inversa dimensioni dei pori più piccola C8 (2,6 µm; 100 Å; 50 x 2.1 mm2) e un sistema solvente gradiente invece la corrente eluizione isocratica. Questo riduce il tempo di esecuzione a 6 min per campione.
Questo metodo affidabile e romanzo offre un approccio semplice, sensibile e rapido per monitoraggio terapeutico del farmaco di combinazione di ivacaftor e ivacaftor-lumacaftor nei fluidi biologici. Data la necessità di sviluppare i rapporti di esposizione-risposta per massimizzare l'efficacia dei farmaci, nonché di contenere i costi dell'assistenza sanitaria, strumenti più sensibili devono essere sviluppati e convalidati per aiutare i clinici nell'utilizzo di terapie basate sull'evidenza e ad alta velocità tecniche analitiche per i pazienti affetti da CF. il nostro gruppo ha precedentemente segnalato un parzialmente convalidato HPLC-MS per analizzare simultaneamente IVA, IVA-M1, IVA-M6 e LUMA nel plasma e dell'espettorato di pazienti CF14. Che istituisce un protocollo analitico comune e facile da usare per l'analisi dei pazienti trattati con ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor combinazione faciliterebbe il confronto dei dati e interpretazione dei risultati di futuri studi farmacocinetici. IVA, IVA-M1, IVA-M6 e LUMA di misurazione nei fluidi biologici utilizzando tecniche LC-MS potrebbe incarnare un potente strumento per esplorare la relazione esposizione-risposta in relazione i risultati terapeutici.
Più in generale, analisi di HPLC-MS di ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor combinazione nei fluidi biologici potrebbero fornire una base molecolare per l'attuazione di strategie farmacoterapeutica individualizzate con pazienti affetti da CF e possono risultare utile per motivi di rendere più redditizio, la terapia di combinazione di ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor costosa potenzialmente indicando la necessità di una somministrazione meno frequente. Applicando il metodo analitico proposto agli studi clinici di farmacocinetica/farmacodinamica, è sorto l'opportunità per indagare ulteriormente i parametri farmacocinetici di ivacaftor o ivacaftor-lumacaftor combinazione su un paziente maggiore collettivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
J.L. e T.V. sono supportati dal National Institute of Allergy e malattie infettive (NIAID) dei National Institutes of Health (R01 AI111965). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institute of Allergy e malattie infettive o il National Institutes of Health. MC è un australiano NHMRC Principal Research Fellow. J. L. è un Australian National Health and Medical Research Consiglio (NHMRC) Senior Research Fellow, e T.V. è un australiano NHMRC industria carriera sviluppo livello 2 Research Fellow. E.K.S è un nominato giovane ambasciatore 2017 per ASM (American Society for Microbiology) ed è supportato da Australian Postgraduate Award.
Parti di questo lavoro è stato presentato presso la 12th Australiasian conferenza sulla fibrosi cistica In Melbourne (5-8th di agosto 2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVA (Cat#S114) | SelleckChem (USA). | ||
| LUMA (Cat#S1565) | SelleckChem (USA). | ||
| IVA-carboxylate (Cat# 510242247CS) | Clearsynth (Canada). | ||
| hydroxymethyl-IVA (Cat# 510240849CS) | Clearsynth (Canada). | ||
| Methanol (MeOH, LC-MS grade), | Sigma-Aldrich | ||
| acetonitrile (ACN, LC-MS grade) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid (FA) | Sigma-Aldrich | ||
| triple-quadrupole Shimadzu 8030 LC-MS | |||
| Phenomenex Kinetex (2.6 µm C8 100 Å; 50 × 2.1mm) | |||
| (KrudKatcher Ultrea HPLC In-Line Filter 0.5 m Depth Filter x 0.004inID). | |||
| 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tube (VWR). | |||
| Eppendorf Centrifuge 5430 | |||
| 13-mm syringe filter (0.45 µm nylon, GRACE, USA) | |||
| [Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 µL, PTFE/Silicone septa]. |
References
- Schneider, E. K., et al. Drug-drug plasma protein binding interactions of ivacaftor. J Mol Recognit. 28 (6), 339-348 (2015).
- Solomon, M., Leatte, P. N. Treatments for Cystic fibrosis. , (2009).
- O'Sullivan, B. P., Flume, P. The clinical approach to lung disease in patients with cystic fibrosis. Semin Respir Crit Care Med. 30 (5), 505-513 (2009).
- Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
- Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. 373 (3), 220-231 (2015).
- Hadida, S., et al. Discovery of N-(2,4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl)-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide (VX-770, ivacaftor), a potent and orally bioavailable CFTR potentiator. J Med Chem. 57 (23), 9776-9795 (2014).
- FDA. FDA Advisory Commitee Briefing Material VERTEX-FDA Pulmonary-Allergy drugs advisory commitee. 98 , VERTEX Pharmaceuticals Incorporated. (2015).
- Holmes, D. False dawn for cystic fibrosis disease modifiers? Nat Rev Drug Discov. 13 (10), 713-714 (2014).
- Veit, G., et al. Some gating potentiators, including VX-770, diminish DeltaF508-CFTR functional expression. Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297 (2014).
- Cholon, D. M., et al. Potentiator ivacaftor abrogates pharmacological correction of DeltaF508 CFTR in cystic fibrosis. Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297 (2014).
- EMA, Assessment report ORKAMBI (ivacaftor/lumacaftor) European medicines agency. , (2015).
- VERTEX. Vertex prescribing infomation. , (2015).
- Matthes, E., et al. Low free drug concentration prevents inhibition of F508del CFTR functional expression by the potentiator VX-770 (ivacaftor). Br J Pharmacol. 173 (3), 459-470 (2016).
- Schneider, E. K., et al. Development of HPLC and LC-MS/MS methods for the analysis of ivacaftor, its major metabolites and lumacaftor in plasma and sputum of cystic fibrosis patients treated with ORKAMBI or KALYDECO. J Chrom B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1038, 57-62 (2016).
- Su, Q., et al. An LC-MS/MS method for the quantitation of cabozantinib in rat plasma: application to a pharmacokinetic study. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 985, 119-123 (2015).
