Summary
الجمع بين إيفاكافتور وإيفاكافتور-لوماكافتور هما أدوية جديدة لقوات التحالف. ومع ذلك، لا يزال هناك ندرة في التفاهم على PK/PD والصيدلة. نقدم أسلوب [هبلك]--مايكروسوفت أمثل للتحليل المتزامن إيفاكافتور ووالايضات الرئيسية، ولوماكافتور.
Abstract
عيوب في الجهة الموصلية عبر غشاء التليف الكيسي (CFTR) هي السبب في التليف الكيسي (CF)، هو مرض مع المظاهر الرئوية تهدد الحياة. إيفاكافتور (IVA)، والجمع بين إيفاكافتور-لوماكافتور (لمي) هي اثنين المخدرات اختراق قوات التحالف الجديد أن تعدل مباشرة النشاط والاتجار بها البروتين CFTR معيبة. ومع ذلك، لا يزال هناك ندرة في التفاهم على معلمات الحرائك الدوائية/ميكروبيولوجية والصيدلة إيفاكافتور ولوماكافتور. التقنية [هبلك]-مرض التصلب العصبي المتعدد للتحليل المتزامن لتركيزات إيفاكافتور، هيدروكسيميثيل-إيفاكافتور، إيفاكافتور-كاربوكسيلات، ولوماكافتور في السوائل البيولوجية في المرضى الذين يتلقون القياسية تركيبة إيفاكافتور أو إيفاكافتور-لوماكافتور العلاج قد سبق وضعها في مجموعتنا والتحقق من صحتها جزئيا لمعايير إدارة الأغذية والعقاقير. ومع ذلك، يسمح تحليل الفائق لعدد أكبر من عينات المرضى، مجموعتنا قد الأمثل الأسلوب المبلغ عنها من خلال استخدام عمود كروماتوغرافيا المرحلة عكس حجم مسام أصغر (2.6 ميكرومتر، C8 100؛ 50 x 2.1 ملم) ونظام تدرج المذيبات ( 0-1 دقيقة: 40% ب؛ 1-2 دقيقة: 40-70% ب؛ 2-2.7 دقيقة: عقدت في 70% ب؛ 2.7-2.8 دقيقة: ب 70-90 في المائة؛ 2.8-4.0 دقيقة: 90% ب الغسل؛ 4.0-4.1 دقيقة: 90-40% ب؛ 4.1-6.0 دقيقة: عقد 40% ب) بدلاً من شطف isocratic. وكان الهدف من هذه الدراسة لتقليل الوقت [هبلك]-مرض التصلب العصبي المتعدد تحليل كل عينة كبيرة من ~ 15 دقيقة إلى فقط 6 دقيقة لكل عينة، هو أمر أساسي لتحليل كمية كبيرة من عينات المرضى. هذا الأسلوب المناسب ستكون ذات فائدة كبيرة لدراسات في العلاقات التعرض/الاستجابة لهذه الأدوية تقدم قوات التحالف.
Introduction
التليف الكيسي (CF) أمراض وراثية شيوعاً تشمل الغدد إفرازات المخاط من الرئة والكبد والبنكرياس والأمعاء يسبب فشل الجهاز المتعدد التدريجي، مثل انخفاض وظائف الرئة وقصور البنكرياس1، 2،3. إيفاكافتور (IVA) هو أول إدارة الغذاء والدواء (إدارة الأغذية والعقاقير الأمريكية) ووافقت وكالة الأدوية الأوروبية (EMA) التليف الكيسي عبر غشاء الموصلية منظم (CFTR) بوتينتياتور المخدرات، مع فعالية سريرية تدل على إنتاج كبير تحسن في وظيفة الرئة عبر الغفل في مجموعة فرعية صغيرة من المرضى CF واضعة G551D-CFTR [جليكاين (ز) في موقف 551 هو الاستعاضة عن حمض الأسبارتيك (د)]4،مغلطه الطفرات (~ 4-5% السكان CF)5. وهذا تدار شفويا الزيادات المخدرات القناة CFTR فتح، وبالتالي زيادة تدفق أيون كلوريد ويتصرف في العيب الأساسي الذي يؤدي إلى المظاهر السريرية CF4،6. ولسوء الحظ، إيفا الأحادي ليست فعالة في المرضى مع الطفرة F508del متماثل أكثر شيوعاً [في إطار حذف جين CFTR مما يؤدي إلى فقدان فينيلألانين (و) في موقف 508] الذي ينتج تجمعات CFTR، الذي ينظر إليه في ~ 50% من 7،قوات التحالف السكان8.
في الآونة الأخيرة، منحت إدارة الأغذية والعقاقير موافقة للجمع بين إيفا مع مصحح CFTR لوماكافتور المخدرات. استراتيجية ذكية للجمع بين CFTR مصحح (لوماكافتور، مي) الذي ينقذ F508del CFTR إلى سطح الخلية مع المغير (IVA) الذي يقوي التي تعالج النشاط قناة CFTR، فعالية يوسع إطار العلاج لمعظم السكان CF5 . تظل هناك أسئلة حول ما إذا كانت هذه الأدوية ستفي بوعودها كما ظهر عدد من التقارير المتضاربة أن يلقي الشك على الفعالية السريرية9،10. بالإضافة إلى ذلك، تم إدخال تحسينات على وظيفة الرئة فقط متواضعة (2.6-4% للجمع بين إيفاكافتور-لوماكافتور) مقارنة بالنجاح الذي تحقق مع إيفا الأحادي في المرضى تحمل تحور (10.6-12.5 في المائة) G551D8. محتملة معادية المخدرات-المخدرات التفاعلات بين إيفا ومي أن تحد من فعالية السريرية للجمع بين إيفاكافتور-لوماكافتور تأتي من خصائص الحرائك الدوائية أقل من مثالية7،11. يتم استقلاب إيفا على نطاق واسع بالأنزيمات السيتوكروم P450 (CYP)، أساسا إلى المستقلب نشط هيدروكسيميثيل-إيفا (إيفا-M1، M1) ونموذج غير نشط إيفا-كاربوكسيلات (إيفا-M6، M6)7،12. CYP3A4 محفز لمي، من ناحية أخرى، لا يتم استقلاب على نطاق واسع، ويفرز إلى حد كبير دون تغيير في البراز11. كما حمل مستحثات CYP3A4 الأيض الفسفرة، يمكن تخفيض تركيزات إيفاكافتور (الركيزة CYP3A4). وعلاوة على ذلك، إيفا ومي جزيئات مسعور جداً وملزمة ~ 99% لبروتينات البلازما، مما يحد بشكل كبير1،تركيز خالية من المخدرات (نشط)13.
جماعياً، قد تأتي هذه العوامل معا للحد من فعالية السريرية للجمع بين إيفاكافتور-لوماكافتور. فإنه ليس من المعروف ما إذا كانت تركيزات البلازما المثلى تتحقق تحت نظام الجرعة الحالية للجمع بين إيفاكافتور-لوماكافتور أو إذا عتبة العلاجية هو الإبقاء على8. في الوقت الحاضر، هناك ندرة في المعلومات المتعلقة بالمعلمات الحرائك الدوائية مثل ذروة وتركيزات البلازما حالة ثابتة من إيفاكافتور أو إيفاكافتور-لوماكافتور. نظراً لوحظ أيض إيفاكافتور ولوماكافتور، رصد علاقات التعرض/الاستجابة شرط أساسي لتحقيق نظم الجرعة المثلى للعلاج إيفاكافتور أو إيفاكافتور-لوماكافتور. مؤخرا نشرت مجموعتنا أول أسلوب [هبلك]/LC-مرض التصلب العصبي المتعدد لرصد علاقات التعرض/الاستجابة لايفا ومي14. أبلغ عن لا تقنيات بديلة لقياس تركيزات إيفاكافتور، والايض، ولوماكافتور حتى الآن. للسماح بتحليل الفائق الجماعية المريض أكبر، وتخفيض هائل في وقت التحليل، مجموعتنا قد تحسين أسلوب الإبلاغ عنها عن طريق استخدام عمود كروماتوغرافيا المرحلة عكس حجم مسام أصغر ونظام تدرج للمذيبات التي يقلل من تكلفة وأوقات التشغيل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على الموافقة للأخلاقيات من موناش جامعة البشرية بحوث أخلاقيات اللجنة (موهريك)-
1. تطبيق المقايسة: "جمع العينات المريض"
- تسجيل الوقت عندما يأخذ المريض الجرعة القياسية من 150 ملغ إيفاكافتور أو إيفاكافتور 125 ملغ/lumacaftor 200 مغ.
- ملاحظة انخفاض في الوقت المحدد عندما يتم جمع عينة دم المريض.
ملاحظة: نوصي بجمع عينات من 4-5 على مدى دورة وقت 24 ساعة. إذا أمكن جمع عينة واحدة فقط، النقطة الزمنية المشار إليها هي 2.5-4 ح وظيفة إيفاكافتور أو إيفاكافتور-لوماكافتور تركيبة الجرعات سوف تكون تركيزات ج كحد أقصى في حالة مستقرة قابلة للتحقيق بعد > 5 أيام معاملة على التوالي- - جمع 4-5 مل دم في أنابيب زرقاء غير المعالجة المتاحة تجارياً-
- بعد جمع الدم كله، تسمح للدم تجلط بتركها دون عائق في درجة حرارة الغرفة-
ملاحظة: وهذا عادة ما يستغرق 15-30 دقيقة
إزالة - الجلطة قبل سينتريفوجينج في 1,000 2,000 س ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في أجهزة الطرد مركزي مبردة. تعيين المادة طافية الناتجة البلازما.
- عقب الطرد المركزي، فورا نقل المادة طافية (البلازما) في أنبوب البولي بروبلين نظيفة باستخدام ماصة باستور. تمت تسمية البلازما أنبوب مع "معرف المريض" (مثلاً، 1 المريض)، المخدرات تدار (مثلاً، الجمع بين إيفاكافتور-لوماكافتور)، والوقت عينة المريض المجمعة (مثلاً، ح 2.5 بعد انتهاء الجرعة).
- المحافظة على العينات عند 2-8 درجة مئوية أثناء المناولة. وبمجرد الانتهاء من معالجة، تخزين العينات في – 20 ° C. السفينة
- إذا لزم الأمر، مع ساعي معتمدة لمعهد تحليل عينات.
ملاحظة: يتم شحنها في الثلج الجاف حتى وصول العينات ويجب أن يبقى على – 80 درجة مئوية حتى التحليل.
2. إعداد وتجهيز العينات التي تكبدتها والمعايير
ملاحظة: البلازما من السذاجة المانحين صحي للعلاج إيفاكافتور/لوماكافتور تم الحصول عليها من "الصليب الأحمر الأسترالي". لضمان السلامة، ينبغي أن تظل جميع العينات ومعايير في 2-8 درجة مئوية أثناء جمع وتجهيز. وبمجرد الانتهاء من معالجة، تخزين العينات في – 20 ° C.
- تزن إيفا وايفا-كاربوكسيلات، هيدروكسيميثيل-إيفا والتي ستكون بمثابة مرجع للمعايير الداخلية لمي- إعداد
- حلين الأوراق المالية المستقلة لكل أكثر (M1 وايفا ومي، M6) في الميثانول الصف LC-MS 100 ميكروغرام/مل وإلى 10 ميكروغرام/مل.
ملاحظة: المركبات سوف تنتهي بعد 10 أيام على benchtop. - طازجة إعداد LC-MS المعايرة معايير قبل كل تشغيل التحليلية بتمييع المعايير المعايرة حلول الأسهم في البلازما البشرية لتحقيق أثر التركيزات: 0.01، 0.025، 0.05، 0.1، 0.2، 0.5، 1.0، 2.5، 5.0، 10.0 ميكروغرام/مل. هذه العينات هي المشار إليها كمعايير.
- يعجل بالبروتينات وإعداد 0.1% حمض الفورميك (FA) في الاسيتو الانيتريل (ACN، الصف LC-MS) ويترك في الثلاجة حتى الحاجة.
3. المعالجة المسبقة للعينات التي تكبدتها والمعايير
- تسمح كلا عينات البلازما المريض وفارغة حجته إلى درجة حرارة الغرفة.
- دوامة لخلط كل عينة البلازما لمدة 15 ثانية لكل عينة.
- نقل قاسمة 100 ميليلتر أما البلازما فارغة للمعايير أو لتحليل عينات المرضى في أنبوب ميكروسينتريفوجي البولي بروبلين 1.5 مل. إضافة
- إيفا القياسية الداخلية في كل من هذه الأنابيب القياسية (مثلاً، 0.01، 0.025، 0.05، 0.1، 0.2، 0.5، 1.0، 2.5، 5.0، 10.0 ميكروغرام/مل لتغطية نطاق التركيز المحتملة) وإغلاق الغطاء، ودوامه لملاحظة س. 2-3 هذا المعيار الداخلي فقط إضافة إلى البلازما فارغة ويتم إضافة لا المعايير الداخلية لعينات المرضى.
- كرر الخطوة 3.4. للمعايير الداخلية الأخرى M1، M6، ومي-
- تدور أسفل كل أنبوبة بإيجاز لضمان أنه لا توجد أية قطرات على الغطاء.
- إضافة 200 ميليلتر من المزيج من 0.1% فا في تزاول في كل أنبوب يعجل ببروتينات البلازما.
- دوامة الخليط بقوة لحوالي 15 س.
- السماح بأنابيب الوقوف لمدة 10 دقائق في الثلاجة.
- الطرد المركزي في 10,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية، إذا كان ذلك ممكناً-
- تصفية قاسمة 200 ميليلتر من المادة طافية من خلال عامل تصفية حقنه 13 مم في قنينة [هبلك] 1.5 مل.
- نقل 100 ميليلتر من المادة طافية في القنينة LC-مرض التصلب العصبي المتعدد للتحليل [هبلك]-MS.
4. [هبلك]-مرض التصلب العصبي المتعدد "تحليل"
ملاحظة: أجرى تحليل [هبلك]--مايكروسوفت على نظام LC MS يقترن مطياف الرباعي الثلاثي الشامل (الجدول 1).
- بدوره على نظام LC MS، ضع العلبة مع العينات في السيارات-أخذ العينات-
- إرفاق العمود عمود حرس والاتصال بنظام LC-MS.
- إرفاق كل زجاجات من مراحل المتنقلة (زجاجة ج: 100% تزاول؛ وزجاجة ب 0.1% حمض الفورميك في المياه) وحجته نظام LC-MS.
- دمج المعلمات التالية في البروتوكول LC-MS.
- تقسيم تدفق المرحلة المحمول قبل دخول مطياف الشامل بنسبة 2:1 (النفايات: مدخل MS).
- القيام شطف تدرج بمعدل 0.5 مل/دقيقة باستخدام مرحلة متنقلة تتألف من حمض الفورميك تزاول و 0.1% 100% في المياه تدفق (ابتداء من نقطة في حيز، v/v). علما بأن نسبة حجم المرحلة المتنقلة يتغير طوال التحليل.
- تعمل مطياف الشامل بطريقة تاين اليكتروسبراي إيجابية.
- تأكد من أن الإعدادات LC-مرض التصلب العصبي المتعدد كما يلي: أيون رذاذ الجهد 4.5 كيلوفولت، الطاقة الاصطدام 295.9 الخامس، nebulizing الغاز: النيتروجين في 3 لتر في الدقيقة؛ والغاز الاصطدام: الأرجون؛ وتجفيف الغاز تدفق 20 لتر في الدقيقة، وعدسة الجهد Q3:-22 الخامس، ديسولفيشن درجة حرارة 250 درجة مئوية مع كتلة حرارة درجة حرارة 400 درجة مئوية.
- حقن 10 ميليلتر حجم كل عينة.
- كشف تحليلها باستخدام عدة رد فعل الرصد (MRM). رصد التحولات أيون من m/z 392.49 → 393، m/z 408.49 → 409، m/z 422.47 → 423 و m/z 452.40 → 453 إيفا وايفا-M1، إيفا-M6 ومي، على التوالي.
ملاحظة: الأسلوب الأمثل حديثا لم يتم التحقق من صحة تماما وفقا لمعايير إدارة الأغذية والعقاقير-
5. منحنيات المعايرة
- منحنيات المعايرة بناء مرض التصلب العصبي المتعدد-LC قبل كل تشغيل التحليلية باستخدام العلاقة بين نسب المنطقة ذروة كل من تحليلها الأربعة على المستوى الداخلي والمعايرة القياسية الاسمية تركيزات إيفاكافتور (إيفا-M1، إيفا-M6 أو لمي) داخل البرنامج إعدادات LC-MS.
ملاحظة: الخطوات الدقيقة لبناء منحنى المعايرة فيعتمد على نموذج LC MS المعدات المستخدمة. قد تكون هذه المعلومات متوفرة في دليل المعدات. - القيام بتحليل انحدار خطي المربعات الصغرى بالترجيح 1/ج 2 استناداً المعاملة بالمثل لتركيزات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لقد مؤخرا أبلغ أسلوب، التحقق من صحتها جزئيا لمعايير إدارة الأغذية والعقاقير، على ثلاثي-الرباعي LC-مرض التصلب العصبي المتعدد ونظام كاشف [هبلك]، باستخدام عمود C8 (5 ميكرومتر، معرف 3.9 مم x 50 مم) مع المرحلة متنقلة تتألف من حمض الفورميك تزاول و 0.1% 100% في الماء (تشكل ، v/v) معدل تدفق من 1 مل/دقيقة. ولوحظ ارتباط خطي من القمم على مدى تركيز يتراوح من 0.01 إلى 10 ميكروغرام/مل في البلازما البشرية لجميع نواتج الأيض، إيفاكافتور، إيفا-M1، إيفا-M6، ولوماكافتور14. هنا وقد تم تحسين هذا الأسلوب للسماح بشكل كبير تخفيض LC مرات الاحتفاظ بها، ومن ثم إدارة الوقت الكامل للمقايسة، هو أمر أساسي لتحليل كمية كبيرة من العينات السريرية الفائق. كان الأمثل في التحليل من خلال استخدام عمود كروماتوغرافيا المرحلة عكس حجم مسام أصغر ونظام المذيبات تدرج بدلاً من شطف isocratic، تقليل وقت كل عينة من ~ 15 دقيقة فقط 6 دقيقة. مصممون تحليلها في وضع اليكتروسبراي إيجابية باستخدام عدة رد فعل الرصد (MRM). الإجراء يجب التحقق من الداخل قبل الشروع في الاستخدام، كما أننا قد سبق بالتفصيل14.
كان دقة الأسلوب 94.2% ± ± 4.53 إلى 97.5% 2.94%، اعتماداً على أكثر14. النطاق المعايرة من 0.01 إلى 10 ميكروغرام/مل قابلاً للتطبيق لاستخدامها في الإعداد السريرية، لا سيما نظراً لأن تحت العلاج إيفاكافتور-لوماكافتور، وتركيزات منخفضة جداً من نشاط إيفا و M1 وأبلغت مجموعتنا سابقا، في البلازما يحتمل أن تحريض CYP3A4 بمي، الذي ينتج الأيض إيفا واسعة14. تم تقييم دقة اليوم داخل كل أكثر مع ست عينات للاستعداد بشكل مستقل مراقبة الجودة (مراقبة الجودة) في اليوم نفسه بتركيزات قدرها 0.05 و 0.5 و 8 ميكروغرام/مل. تم تقييم دقة اليوم بين الوكالات مع ست عينات المعدة بشكل مستقل لمراقبة الجودة في ثلاثة أيام متتالية. وحسبت والدقة عن طريق الانحراف المعياري النسبي (RSD). لكل عينة مراقبة الجودة، يجب أن تكون القيم تحديد وضع اللاجئ أقل من 15%15. أظهرت جميع التحاليل أربع قيم تحديد مركز اللاجئ لأقل من 15%14. تم إنشاء الحد الأدنى للكشف (اللد) والكمي (لوك): لايفا اللد 2.50 × 10-3 ميكروغرام/مل و 7.57 لوك × 10-3 ميكروغرام/مل؛ ل M1، اللد 4.57 x 10-4 ميكروغرام/مل ولوك 1.38 x 10-3 ميكروغرام/مل؛ ل M6 اللد 5.86 x 10-4 ميكروغرام/مل ولوك 1.78 x 10-3 ميكروغرام/مل؛ لمي اللد كان 6.08 × 10-4 ميكروغرام/مل ولوك 1.84 × 10-3 ميكروغرام/مل14. Chromatogram نموذجي يرد في الشكل 1. حصلت حل الكروماتوغرافي أمثل استخدام مرحلة متنقلة من حمض الفورميك تزاول و 0.1% 100% في المياه (ابتداء من نقطة في حيز، v/v) مع شطف تدرج في عمود C8 (ميكرومتر 2.6; 100؛ 50 مم x 2.1 ملم). واستخدمت فصل التدرج مع 40% مرحلة المحمول ب من 0 إلى 1 دقيقة؛ ثم مرحلة 40%-70% جوال ب من 1 دقيقة إلى 2 دقيقة؛ عقد 70% مرحلة المحمول ب من 2 دقيقة إلى دقيقة 2.7؛ زيادة من 70% إلى 90% مرحلة الجوال ب من 2.7 دقيقة إلى 2.8 دقيقة؛ عقد 90% مرحلة المحمول ب من 2.8 دقيقة إلى دقيقة 4.0 للغسيل الأغراض؛ وأخيراً العودة من 90% إلى 40% ب الجوال من مين 4.0 إلى 4.1 دقيقة؛ ثم عقد 40% المرحلة المتنقلة ب من 4.1 دقيقة بدقيقة 6.0 للظروف الأولية (الشكل 1). أوقات استبقاء LC على النحو التالي ل M6 1.0 دقيقة؛ ل M1 1.3 دقيقة؛ لايفا: 1.55 دقيقة؛ لمي: 2.3 دقيقة (الشكل 1). في جميع عينات البلازما فارغة، لوحظ عدم التدخل مع الوقت الاحتفاظ بأي من التحاليل، كما تم الكشف عن التدخل من مزيج إيفاكافتور مع لوماكافتور.
الشكل 1 : Chromatogram ممثل LC-مرض التصلب العصبي المتعدد من البلازما البشرية ارتفعت مع 10 ميكروغرام/مل إيفا-M6، إيفا-M1، ولوماكافتور، وإيفاكافتور فيما يتعلق شطف التدرج من مضخة. حمض الفورميك 0.1% في مياه ومضخة الاسيتو الانيتريل 100% ب (0-1 دقيقة: 40% ب; % 1--02:00 ص-70% ب؛ 2-2.7 دقيقة: المعقود في 70% ب؛ ب 2.7-2.8 دقيقة: 70%-90%؛ ب 3.8-4.0 دقيقة: 90% الغسيل؛ ب 4.0-4.1 دقيقة: 90 ٪-40 ٪؛ ودقيقة 4.1-6.0: عقد 40% ب). واستخدمت الانتقالات أيون m/z 392.49 ← 393، m/z 408.49 ← 409، m/z 422.47 ← 423 و m/z 452.40 ← 453 MS/MS رصد إيفاكافتور وايفا-M1، إيفا-M6 ولوماكافتور، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| شروط [هبلك] | |
| العمود | جيم-8؛ 2.6 ميكرومتر؛ Å 100؛ 50 x 2.1 ملم |
| عمود الحرس | [هبلك] مرشح في خط 0.5 ميكرومتر؛ تصفية عمق × 0.004 اينيد |
| تصفية × 0.004 اينيد | |
| درجة الحرارة في العمود: | 30 درجة مئوية |
| المرحلة المتنقلة ج: | 0.1% اتحاد كرة القدم في الماء |
| مرحلة الجوال ب: | تزاول 100% |
| تكوين "المرحلة المحمول" في نقطة البداية | 60/40 (v/v) |
| درجة حرارة العينة: | 4 درجة مئوية |
| حجم الحقن: | 5 ميليلتر |
| أغسل إبرة | والميثانول 80%، 20% المياه 300 ميليلتر |
| معدل التدفق: | 0.5 مل/دقيقة |
| التدرج: | 01:00 ص % ب |
| -% 1-02:00 ص-70% ب | |
| -2-2.7 دقيقة: عقدت في 70% ب | |
| --2.7-2.8 دقيقة: 70%-90% ب | |
| -2.8-4.0 دقيقة: 90% ب الغسيل | |
| -4.0-4.1 دقيقة: 90%-40% | |
| -4.1-6.0 دقيقة: عقد 40 في المائة، | |
| مجموع تشغيل: | 6 دقائق |
| مرات الاحتفاظ بها: | مدة الاستبقاء M6: 1.0 دقيقة |
| مدة الاستبقاء M1: 1.3 دقيقة | |
| مدة الاحتفاظ بايفا: 1.55 دقيقة | |
| الوقت الاستبقاء لمي: 2.3 دقيقة | |
| ظروف مرض التصلب العصبي المتعدد | |
| الكشف عن النمط: | اليكتروسبراي ESI إيجابية + |
| أيون رذاذ الجهد: | 4.5 كيلو فولت |
| الطاقة الاصطدام: | 295.9 V |
| Nebulizing غاز (النيتروجين): | 3 لتر في الدقيقة |
| سيد الغاز: | الجيش الشعبي الكوري 230 |
| تجفيف تدفق غاز (النيتروجين): | 20 لتر في الدقيقة |
| قضيب قبل Q1 التحيز: | --آند #1 |
الجدول 1: تفاصيل الشروط [هبلك]-مرض التصلب العصبي المتعدد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وكما ذكر سابقا، قد مجموعتنا للمرة الأولى المتقدمة والتحقق من صحة أسلوب [هبلك] و LC-مرض التصلب العصبي المتعدد للكشف السريع والتحديد الكمي إيفاكافتور وايضه الرئيسية هيدروكسيميثيل-إيفا M1 (نشطة) وايفا-كاربوكسيلات M6 (غير نشط)؛ ولوماكافتور في البلازما والبصاق من مرضى التليف الكيسي14. الفحص عنها مجموعتنا سابقا استخدمت بنجاح لقياس تركيز لمي وايفا وايفا-M1، وايفا-M6 في البلازما والبصاق CF المرضى الذين يخضعون للعلاج القياسي حالة مستقرة مع إيفا 150 ملغ/q12 ح (المصطلحات اللاتينية: كاك ح 12؛ مرة واحدة كل 12 ح) أو 200 ملغ/q12 ح لمي-125 ملغ/q12 ح إيفا تركيبة14. لتحليل كميات كبيرة من عينات المرضى الفائق، أننا قد الإبلاغ عن الأسلوب الأمثل باستخدام عمود كروماتوغرافيا المرحلة عكس حجم مسام أصغر C8 (2.6 ميكرومتر؛ 100؛ 50 x 2.1 مم2) ونظام المذيبات تدرج بدلاً من الحالية شطف إيسوكراتيك. وهذا يقلل من إدارة الوقت إلى دقيقة 6 لكل عينة.
يوفر هذا الأسلوب يمكن الاعتماد عليها ورواية نهج بسيطة وحساسة وسريعة لرصد العقاقير العلاجية للجمع بين إيفاكافتور وإيفاكافتور-لوماكافتور في السوائل البيولوجية. نظراً للحاجة إلى تطوير علاقات التعرض/الاستجابة تعظيم فعالية المخدرات فضلا عن احتواء تكاليف الرعاية الصحية، تحتاج إلى أدوات أكثر حساسية تطويرها والتحقق من صحتها لمساعدة الأطباء في استخدام العلاجات المبنية على الأدلة والفائق التقنيات التحليلية للمرضى الذين يعانون من راجع مجموعتنا قد سبق أن أبلغ تم التحقق من صحتها جزئيا [هبلك]-مرض التصلب العصبي المتعدد لتحليل في نفس الوقت مي وايفا-M6، إيفا وايفا-M1 في البلازما والبصاق من مرضى التليف الكيسي14. وضع بروتوكول تحليلية المشتركة وسهلة الاستخدام للتحليل للمرضى الذين يتلقون مجموعة إيفاكافتور أو إيفاكافتور-لوماكافتور ييسر مقارنة البيانات، وتفسير النتائج من دراسات الحرائك الدوائية مستقبلا. وقد تجسد قياس إيفا وايفا-M1، إيفا-M6 ومي في السوائل البيولوجية باستخدام تقنيات LC-مرض التصلب العصبي المتعدد أداة قوية لاستكشاف علاقة التعرض/الاستجابة فيما يتعلق بالنتائج العلاجية.
وبصورة أعم، قد توفر أساس جزيئي لتنفيذ استراتيجيات pharmacotherapeutic فردية مع المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي [هبلك]-مرض التصلب العصبي المتعدد تحليل تركيبة إيفاكافتور أو إيفاكافتور-لوماكافتور في السوائل البيولوجية وقد يثبت مفيدة على أساس جعل العلاج المركب إيفاكافتور أو إيفاكافتور-لوماكافتور مكلفة أكثر فعالة من حيث التكلفة، التي يحتمل أن تكون الإشارة إلى الحاجة إلى جرعات أقل تواترا. عن طريق تطبيق الأسلوب التحليلي المقترح للدراسات السريرية الحرائك الدوائية/ميكروبيولوجية، نشأ الفرصة لمواصلة التحقيق المعلمات الحرائك الدوائية للجمع بين إيفاكافتور أو إيفاكافتور-لوماكافتور على مريض أكبر الجماعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ج. ل. وبرنامج T.V. معتمدة من قبل "المعهد الوطني للحساسية" والأمراض المعدية (نييد) من "المعاهد الوطنية للصحة" (R01 AI111965). المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية أو المعاهد الوطنية للصحة. مولودية هو زميل أبحاث الأسترالي NHMRC الرئيسي. ج. ل. هو الأسترالية الوطنية للصحة ومجلس البحوث الطبية (NHMRC) زميل أبحاث، والتلفزيونية الأسترالية NHMRC صناعة الوظيفي تطوير مستوى 2 زميل أبحاث. E.K.S هو 2017 السفير يونغ المعين للحرفي والصغير الحجم (الجمعية الأمريكية لعلم الأحياء المجهرية) ومعتمد من قبل "منح الدراسات العليا الأسترالية".
أجزاء من هذا العمل قدم في 12th المؤتمر أوسترالياسيان "التليف الكيسي في ملبورن" (5-8عشر من آب/أغسطس عام 2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVA (Cat#S114) | SelleckChem (USA). | ||
| LUMA (Cat#S1565) | SelleckChem (USA). | ||
| IVA-carboxylate (Cat# 510242247CS) | Clearsynth (Canada). | ||
| hydroxymethyl-IVA (Cat# 510240849CS) | Clearsynth (Canada). | ||
| Methanol (MeOH, LC-MS grade), | Sigma-Aldrich | ||
| acetonitrile (ACN, LC-MS grade) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid (FA) | Sigma-Aldrich | ||
| triple-quadrupole Shimadzu 8030 LC-MS | |||
| Phenomenex Kinetex (2.6 µm C8 100 Å; 50 × 2.1mm) | |||
| (KrudKatcher Ultrea HPLC In-Line Filter 0.5 m Depth Filter x 0.004inID). | |||
| 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tube (VWR). | |||
| Eppendorf Centrifuge 5430 | |||
| 13-mm syringe filter (0.45 µm nylon, GRACE, USA) | |||
| [Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 µL, PTFE/Silicone septa]. |
References
- Schneider, E. K., et al. Drug-drug plasma protein binding interactions of ivacaftor. J Mol Recognit. 28 (6), 339-348 (2015).
- Solomon, M., Leatte, P. N. Treatments for Cystic fibrosis. , (2009).
- O'Sullivan, B. P., Flume, P. The clinical approach to lung disease in patients with cystic fibrosis. Semin Respir Crit Care Med. 30 (5), 505-513 (2009).
- Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
- Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. 373 (3), 220-231 (2015).
- Hadida, S., et al. Discovery of N-(2,4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl)-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide (VX-770, ivacaftor), a potent and orally bioavailable CFTR potentiator. J Med Chem. 57 (23), 9776-9795 (2014).
- FDA. FDA Advisory Commitee Briefing Material VERTEX-FDA Pulmonary-Allergy drugs advisory commitee. 98 , VERTEX Pharmaceuticals Incorporated. (2015).
- Holmes, D. False dawn for cystic fibrosis disease modifiers? Nat Rev Drug Discov. 13 (10), 713-714 (2014).
- Veit, G., et al. Some gating potentiators, including VX-770, diminish DeltaF508-CFTR functional expression. Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297 (2014).
- Cholon, D. M., et al. Potentiator ivacaftor abrogates pharmacological correction of DeltaF508 CFTR in cystic fibrosis. Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297 (2014).
- EMA, Assessment report ORKAMBI (ivacaftor/lumacaftor) European medicines agency. , (2015).
- VERTEX. Vertex prescribing infomation. , (2015).
- Matthes, E., et al. Low free drug concentration prevents inhibition of F508del CFTR functional expression by the potentiator VX-770 (ivacaftor). Br J Pharmacol. 173 (3), 459-470 (2016).
- Schneider, E. K., et al. Development of HPLC and LC-MS/MS methods for the analysis of ivacaftor, its major metabolites and lumacaftor in plasma and sputum of cystic fibrosis patients treated with ORKAMBI or KALYDECO. J Chrom B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1038, 57-62 (2016).
- Su, Q., et al. An LC-MS/MS method for the quantitation of cabozantinib in rat plasma: application to a pharmacokinetic study. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 985, 119-123 (2015).
