Summary
Ivacaftor 和 Ivacaftor-lumacaftor 结合是两个新的 CF 药物。然而, 在他们的 PK/PD 和药理学方面仍然缺乏了解。本文提出了一种优化的 HPLC-MS 技术, 同时分析 ivacaftor 及其主要代谢产物, 以及 lumacaftor。
Abstract
囊性纤维化膜传导调节剂 (CFTR) 的缺陷是囊肿纤维化 (CF) 的病因, 是一种具有生命危险的肺部表现的疾病。Ivacaftor (Ivacaftor) 和 lumacaftor (LUMA) 结合是两种新的突破性药物, 直接调节有缺陷的 CFTR 蛋白的活性和贩运。然而, 对药代动力学/药效学参数和 ivacaftor 和 lumacaftor 的药理研究仍然缺乏认识。高效液相色谱-MS 技术同时分析接受标准 ivacaftor 或 ivacaftor-lumacaftor 结合的 ivacaftor、羟甲基 ivacaftor、ivacaftor 羧酸和 lumacaftor 在生物体液中的浓度治疗之前, 我们的小组和部分验证的 FDA 标准。然而, 为了允许高通量分析更多的患者样本, 我们组通过使用较小孔径的反相色谱柱 (2.6 µm、C8 100 Å; 50 x 2.1 mm) 和梯度溶剂系统对报告的方法进行了优化 (0-1 分钟: 40% B;1-2 分钟: 40-70% B;2-2. 7 分钟: 举行在 70% B;2.7-2.8 分: 70-90% B;2.8-4.0 分钟: 90% B 洗涤;4.0-4.1 分: 90-40% B;4.1-6.0 分钟: 举行在 40% B) 而不是一个等洗脱。本研究的目的是将每样样品的高效液相色谱-MS 分析时间从 ~ 15 分钟减少到每样6分钟, 这对于分析大量患者样本是必不可少的。这种权宜之计的方法将有相当大的效用, 研究的接触反应的关系, 这些突破 CF 药物。
Introduction
囊性纤维化 (CF) 是一种常见的遗传性疾病, 涉及的外分泌粘液腺体的肺, 肝, 胰, 和肠道导致渐进性多衰竭, 如肺功能减退和胰不足1, 2,3。Ivacaftor (美国食品和药物管理局) 和欧洲药物管理局 (EMA) 批准囊性纤维化反式膜电导调节剂 (CFTR) 增药物, 其临床疗效显著G551D-CFTR 的小子集的 cf 患者肺功能改善的临床研究 [甘氨酸 (G) 在位置551中被天门冬氨酸 (D)] 义突变 (CF 种群的 4-5%)4,5。这种口服药物增加了 CFTR 通道开放, 从而增加了氯离子流和作用于主要缺陷, 导致的临床表现 CF4,6。不幸的是, 在更常见的纯合 F508del 突变的患者中, CFTR 单药的单一性是不有效的 [在帧删除的错误, 导致在位置508的苯丙氨酸 (F) 的损失, 这在50%CF 填充7,8。
最近, FDA 批准了与 CFTR 校正药物 lumacaftor 的结合。巧妙的策略, 结合 CFTR 校正器 (lumacaftor, LUMA), 这将 F508del-CFTR 到细胞表面的调制器 (伊娃) 加强 CFTR 通道活动, 有效地扩大治疗窗口的大多数 CF 人口5.关于这些药物是否能履行他们的诺言的问题仍然存在, 因为一些相互矛盾的报告已经出现, 对他们的临床功效产生了怀疑9,10。此外, 肺功能的改善只是适度的 (2.6-4% 的 ivacaftor-lumacaftor 组合) 相比, 成功地在 G551D 突变 (10.6-12.5%)8患者单药单一治疗。潜在的拮抗药物-药物相互作用可能限制 ivacaftor-lumacaftor 结合的临床疗效的 LUMA, 来自其不太理想的药代动力学属性7,11。在细胞色素 P450 酶 (CYP) 的作用下, 主要对活性代谢产物羟甲基--IVA-M1、M1) 和非活动形态 (IVA-M6, M6)7,12进行了广泛的代谢。CYP3A4 诱导 LUMA, 另一方面, 没有广泛的代谢和主要排泄不变的粪便11。由于 CYP3A4 诱导诱导细胞色素代谢, ivacaftor (CYP3A4 基质) 浓度可降低。此外, 两个 LUMA 都是非常疏水性分子和99% 绑定到血浆蛋白, 这极大地限制了自由 (有效) 药物浓度1,13。
总的来说, 这些因素可能聚集在一起, 限制了 ivacaftor-lumacaftor 结合的临床疗效。目前尚不清楚 ivacaftor-lumacaftor 组合的剂量方案是否达到最佳血浆浓度, 或者治疗阈值是否保持在8。目前, 关于 ivacaftor 或 ivacaftor lumacaftor 的药代动力学参数如峰值和稳态等离子体浓度的信息缺乏。鉴于 ivacaftor 和 lumacaftor 的新陈代谢, 对接触反应关系的监测是实现 ivacaftor 或 ivacaftor-lumacaftor 疗法最佳剂量方案的必要条件。我们的小组最近出版了第一个 HPLC/LC-MS 方法, 以监测的接触-反应关系的 LUMA 和14。目前还没有其他方法来测量 ivacaftor、其代谢物和 lumacaftor 的浓度。为了让更大的患者集体的高通量分析, 并大大减少分析时间, 我们组通过使用较小孔径的反相色谱柱和梯度溶剂系统优化了报告的方法,降低成本和运行时间。
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Protocol
对道德的认可是由蒙纳士大学人类研究伦理委员会 (MUHREC) 获得的.
1. 分析的应用: 患者样本收集
- 记录患者服用标准剂量的150毫克 ivacaftor 或 ivacaftor 125 毫克/lumacaftor 200 毫克的时间。
- 记下病人血样采集的确切时间.
注: 我们建议在24小时的课程中收集4-5 样本。如果只有一个样品的集合是可能的, 被表明的时间点是 2.5-4 h 岗位 ivacaftor 或 ivacaftor-lumacaftor 组合药量作为 C 最大 集中在稳定状态将是可实现的在和 #62 以后; 5 天连续治疗. - 收集4-5 毫升的血液在商业上可用未经处理的蓝色管.
- 在收集完整个血液后, 让血液凝结, 使其在室温下不受干扰.
注意: 这通常需要15-30 分钟. - 离心在1,000-2、000 x g 处将血块移除, 在4和 #176 中为10分钟; C 在冷冻离心机中。将产生的上清液指定为等离子体.
- 在离心后, 立即将上清 (等离子) 转化为使用巴斯德吸管的清洁聚丙烯管。用患者 ID ( 例如 , 患者 1), 使用药物 ( 例如 , ivacaftor-lumacaftor 组合) 和病人样本收集时间 ( 如 , 2.5 h post-dosage) 来标记血浆管.
- 在处理过程中维护2-8 和 #176 的样品;处理完成后, 将样品存放在 #8211; 20 和 #176; C.
- 如有必要, 请将经批准的信使的样品运送到分析研究所.
注: 样品要在干冰运到到达时, 并应保存在和 #8211; 80 和 #176; C 直到分析.
2。发生的样品和标准的准备和处理
注意: 来自健康献血者的血浆和 #239; ve ivacaftor/lumacaftor 治疗是从澳大利亚红十字会获得的。为确保产品的完整性, 所有样品/标准应保持在2-8 和 #176; C 在收集和处理过程中。处理完成后, 将样品存放在 #8211; 20 和 #176; C.
- 称其为内部标准的参考, 并对其进行权衡, 并对其进行 LUMA。
- 在100和 #181 中, 为每种分析物 (M1、M6 和 LUMA) 分别准备两个独立的库存解决方案: LC-MS 级甲醇; g/毫升; 10 和 #181; g/毫升.
注: 化合物将在台式10天后过期. - 在每个分析运行之前, 通过稀释校准标准的库存解决方案, 以实现以下浓度: 0.01、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0 和10.0、#181,这些示例被称为标准.
- 沉淀蛋白质, 准备0.1% 甲酸 (FA) 在乙腈 (ACN, LC 级), 并留在冰箱, 直到需要.
3。已发生的样品和标准的预处理
- 允许患者和空白血浆样品平衡到室温.
- 涡旋将每个样品的每个等离子体样本混合到十五年代.
- 传输100和 #181; 将空白等离子体分为标准或患者样品, 用于分析1.5 毫升聚丙烯离心管.
- 在每个标准管中添加内部标准的 "," ( 例如 , 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 和 #181; g/毫升, 以涵盖潜在的浓度范围), 关闭盖子, 和涡流 10.0 s. 注意, 内部标准仅添加到空白血浆和没有内部标准被增加到患者样品.
- 重复步骤 3.4. 其他内部标准 M1、M6 和 LUMA.
- 简单地向下旋转每个管, 以确保盖子上没有液滴.
- 添加200和 #181; 0.1% FA 的混合 ACN 到每管中沉淀血浆蛋白.
- 在大约十五年代的时候强烈地漩涡混合物.
- 允许管子在冰箱中站立10分钟.
- 离心 1万 x g 为10分钟, 在4和 #176; C, 如果可能的话.
- 筛选200和 #181; 通过 13 mm 注射器过滤器将上清液分为1.5 毫升 HPLC 瓶.
- 将100和 #181; 将上清的 L 转化为 LC-ms 瓶, 进行 HPLC 分析.
4。高效液相色谱-ms 分析
注意: 在 LC-ms 系统上进行了高效液相色谱分析, 并结合三极质谱仪 ( 表 1 )。
- 打开 LC-MS 系统, 将纸盒与样中的示例一起放置.
- 将列附加到保护列并连接到 LC-MS 系统.
- 附加两个流动相瓶 (瓶 A: 100% ACN; 瓶子 B: 水中的0.1% 甲酸) 和平衡的 LC-MS 系统.
- 将下列参数合并到 LC-MS 协议中.
- 在以2:1 的比率 (废物: MS 入口) 进入质谱仪之前, 拆分流动相流.
- 使用在水中包含 100% ACN 和0.1% 甲酸的流动相, 在0.5 毫升/分钟的流速下执行梯度洗脱 (起始点在40:60、v/v)。请注意, 在整个分析过程中, 移动阶段的体积百分比会发生变化.
- 以正电喷雾电离模式操作质谱仪.
- 确保 LC-MS 设置如下: 离子喷雾电压 4.5 kV, 碰撞能量295.9 伏, 雾化气体: 氮气在3升/分; 碰撞气体: 氩气; 干燥气体流量20升/分, 透镜电压 Q3:-22 V, 去温度250和 #176; C 带热块温度为400和 #176; C.
- 注入10和 #181; 每个样本的 L 体积.
- 使用多反应监测 (MRM) 检测分析。监视 m/z 392.49 和 #8594 的离子跃迁; 393, m/z 408.49 和 #8594; 409, m/z 422.47 和 #8594; 423 和 m/z 452.40 和 #8594; 分别为 IVA-M1、IVA-M6 和 LUMA.
注意: 根据 FDA 的标准, 新的优化方法尚未完全验证.
5。校准曲线
- 在每个分析运行前构造 LC-MS 校准曲线, 使用四分析的峰值面积比值与内部标准之间的关系, 以及校准标准的标称浓度ivacaftor (IVA-M1、IVA-M6 或 LUMA) 在 LC-MS 设置程序中.
注: 校准曲线构造的精确步骤取决于所使用的 LC-MS 设备的模型。此信息可在设备手册中获得. - 根据浓度的倒数, 通过加权 1/C 执行线性最小二乘法回归分析.
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Representative Results
我们最近报告了一种方法, 部分验证了 FDA 的标准, 在三重四极 LC MS 和 HPLC 检测系统, 使用 C8 柱 (5 µm, 3.9 mm x 50 mm 身份) 与流动相组成的 100% ACN 和0.1% 甲酸在水中 (40:60, v/v) 的流速为1毫升/分钟。在人类血浆中, 所有代谢物、ivacaftor、Iva-M1、Iva-M6 和 lumacaftor14的浓度范围从0.01 到10µg/毫升都观察到峰值的线性相关性。此方法已经过优化, 使 LC 保留时间大大减少, 因此, 该检测的完整运行时间对大量临床样品的高通量分析至关重要。通过使用较小孔径的反相色谱柱和梯度溶剂体系, 而不是等洗脱, 将每样样品的时间从 ~ 15 分钟缩短到仅6分钟, 从而优化了该检测。采用多反应监测 (MRM) 确定了分析的电喷雾阳性模式。此过程应在使用前 in-house 验证, 如我们先前详细介绍的14。
该方法的精确度为94.2% ±4.53% 到97.5% ± 2.94%, 具体取决于分析物14。校准范围从0.01 到10µg/毫升是适用于临床设置, 特别是鉴于在 ivacaftor lumacaftor 治疗, 非常低浓度的活性和 M1 的报告, 我们的组先前, 在血浆可能由于CYP3A4 的诱导 LUMA, 导致大面积的代谢紊乱14。对每种分析物的内准确度进行评估, 并在同一天在浓度为0.05、0.5 和8µg/毫升的六个独立准备的质量控制 (QC) 样品。对 inter-day 的准确度进行了评估, 六个独立准备的 QC 样品连续三天。通过相对标准偏差 (RSD) 计算精度和精度。对于每个 QC 示例, RSD 值应小于 15%15。所有四分析显示 RSD 值小于 15%14。检测下限 (lod) 和量化 (LOQ) 已建立: 对于 2.50 x 10-3 µg/ml 和 LOQ 7.57 x 10-3 µg/ml;对于 M1, LOD 4.57 x 10-4 µg/ml 和 LOQ 1.38 x 10-3 µg/ml;对于 M6 LOD 5.86 x 10-4 µg/ml 和 LOQ 1.78 x 10-3 µg/ml;对于 LUMA LOD 是 6.08 x 10-4 µg/毫升和 LOQ 1.84 x 10-3 µg/ml14。典型的色谱显示在图 1中。利用 100% ACN 和0.1% 甲酸在水中的流动相 (起始点在40:60、v/v) 上, 通过 C8 柱上的梯度洗脱 (2.6 µm; 100 Å; 50 mm x 2.1 mm) 获得了优化的色谱分辨率。采用梯度分离法, 将40% 的移动相 B 从0到1分钟;然后 40%-70% 的移动阶段 B 从1分钟到2分钟;持有70% 的移动阶段 B 从2分钟到2.7 分钟;从70% 到90% 的移动阶段 B 从2.7 分钟增加到2.8 分钟;持有90% 的移动阶段 B 从2.8 分钟到4.0 分钟的洗涤目的;最后从90% 到40% 的移动 B 从4.0 分钟返回到4.1 分钟;然后持有40% 的移动阶段 B 从4.1 分钟到6.0 分钟的初始条件 (图 1)。LC 保留时间如下 M6 1.0 分钟;为 M1 1.3 分钟;为: 1.55 分钟;对于 LUMA: 2.3 分钟 (图 1)。在所有的空白等离子体样品中, 均未观察到任何一个分析的保留时间, 也没有从 ivacaftor 与 lumacaftor 的结合中检测到干扰。
图 1:用10µg IVA-M6、IVA-M1、lumacaftor 和 ivacaftor 与泵的梯度洗脱相关联的人血浆的代表 LC-MS 色谱.0.1% 甲酸在水和泵 B 100% 乙腈 (0-1 分: 40% b; 1-2 分钟: 40%-70% b; 2-2. 7 分钟: 举行在 70% b; 2.7-2.8 分钟: 70%-90% b; 3.8-4.0 min: 90% b 洗涤; 4.0-4.1 min: 90%-40% b; 4.1 分钟-6.0 分钟: 40% 到分。m/z 392.49 →393的离子转换, m/ z 408.49 → 409, m/ z 422.47 →423和m/z 452.40 →453分别用于 ivacaftor、M1、IVA-M6 和 lumacaftor 的 ms/毫秒监测。请单击此处查看此图的较大版本.
| HPLC 条件 | |
| 列 | C8;2.6 µm;100Å;50 x 2.1 毫米 |
| 守卫专栏 | 高效液相色谱在线过滤0.5 µm;深度滤镜 x 0.004 inID |
| 过滤器 x 0.004 inID | |
| 柱温: | 30° c |
| 移动阶段 A: | 0.1% FA 在水中 |
| 移动阶段 B: | 100% ACN |
| 起始点的流动相组成 | 60/40 (v/五) |
| 样品温度: | 4° c |
| 注塑量: | 5µL |
| 洗针 | 80% 甲醇, 20% 水300µL |
| 流量: | 0.5 毫升/分 |
| 梯度: | -1 分钟: 40% B |
| -1-2 分钟: 40%-70% B | |
| -2-2.7 分钟: 在 70% B 举行 | |
| -2.7-2.8 分钟: 70%-90% B | |
| -2.8-4.0 分钟: 90% B 洗 | |
| -4.0-4.1 分: 90%-40% | |
| -4.1-6.0 分钟: 举行在 40%, | |
| 总运行: | 6分钟 |
| 保留时间: | M6 的保留时间: 1.0 分钟 |
| M1 的保留时间: 1.3 分钟 | |
| 滞留时间: 1.55 分钟 | |
| LUMA 的保留时间: 2.3 分钟 | |
| MS 条件 | |
| 检测模式: | 电喷雾阳性 |
| 离子喷雾电压: | 4.5 kV |
| 碰撞能量: | 295.9 V |
| 雾化气体 (氮气): | 3升/分 |
| CID 气体: | 230人民军 |
| 干燥气体 (氮气) 流量: | 20升/分 |
| Q1 前杆偏置: | -#1 |
表 1: HPLC-质谱的详细情况。
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Discussion
如前所述, 我们的小组首次开发和验证了高效液相色谱和 LC-MS 法快速检测和定量 ivacaftor 及其主要代谢物羟甲基 M1 (活性) 和 M6 (不活泼);lumacaftor 在 CF 患者血浆和痰液中的浓度为14。本组报告的检测方法成功地用于定量测定 CF 患者的血浆和痰中 LUMA、IVA-M1、IVA-M6 的浓度, 采用150毫克/q12 h (拉丁语术语: quaque12 小时;每12小时一次) 或200毫克/q12 h LUMA-125 毫克/q12 h 综合体组合14。对于大量的患者样品的高通量分析, 我们通过使用较小孔径的反相色谱柱 C8 (2.6 µm; 100 Å; 50 x 2.1 mm2) 和梯度溶剂系统而不是电流来优化报告方法。等洗脱。这样可以将运行时间减少到每样6分钟。
这种可靠和新颖的方法提供了一个简单, 灵敏和快速的方法, 治疗药物监测 ivacaftor 和 ivacaftor-lumacaftor 结合在生物流体。鉴于需要发展接触反应关系, 以最大限度地提高药物功效, 并包含医疗保健费用, 需要开发和验证更敏感的工具, 以协助临床医生使用循证疗法和高通量分析技术为患者从 cf. 我们的小组以前报告了部份地被证实的 HPLC-MS 为同时分析 IVA-M1, IVA-M6, 和 LUMA 在血浆和痰在 cf 患者14。为分析接受 ivacaftor 或 ivacaftor-lumacaftor 结合的患者建立一个通用和易于使用的解析协议, 将有助于对未来药代动力学研究结果进行数据比较和解释。使用 LC-MS 技术测量生物体液中的 IVA-M1、IVA-M6 和 LUMA 可能是探索与治疗结果相关的接触反应关系的有力工具。
更一般地, ivacaftor 或 ivacaftor-lumacaftor 结合在生物体液中的 HPLC 分析可能为实施个体化的治疗策略提供了分子基础, 并可能证明有用的理由, 使昂贵的 ivacaftor 或 ivacaftor lumacaftor 组合疗法更具成本效益, 可能表明需要减少频繁剂量。将该分析方法应用于临床药物动力学/药效学研究中, 有机会进一步研究 ivacaftor 或 ivacaftor-lumacaftor 结合对大患者的药代动力学参数。集体.
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
. 和电视得到国立卫生研究院 ( R01 AI111965 ) 国家反应和传染性疾病研究所 ( NIAID ) 的支持。内容完全是作者的责任, 并不一定代表国家过敏和传染性疾病研究所或国立卫生研究院的官方观点。MC 是澳大利亚澳洲的主要研究员。. 是澳大利亚国家卫生与医学研究委员会 (澳洲) 高级研究员, 而电视是澳大利亚澳洲行业职业发展2级研究员。杨永强 S 是一个任命的年轻大使2017为 ASM (美国微生物学协会) 并且由澳洲研究生奖支持。
这项工作的一部分是在 12th Australiasian 会议上囊性纤维化在墨尔本 (5-8th 2017年8月)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVA (Cat#S114) | SelleckChem (USA). | ||
| LUMA (Cat#S1565) | SelleckChem (USA). | ||
| IVA-carboxylate (Cat# 510242247CS) | Clearsynth (Canada). | ||
| hydroxymethyl-IVA (Cat# 510240849CS) | Clearsynth (Canada). | ||
| Methanol (MeOH, LC-MS grade), | Sigma-Aldrich | ||
| acetonitrile (ACN, LC-MS grade) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid (FA) | Sigma-Aldrich | ||
| triple-quadrupole Shimadzu 8030 LC-MS | |||
| Phenomenex Kinetex (2.6 µm C8 100 Å; 50 × 2.1mm) | |||
| (KrudKatcher Ultrea HPLC In-Line Filter 0.5 m Depth Filter x 0.004inID). | |||
| 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tube (VWR). | |||
| Eppendorf Centrifuge 5430 | |||
| 13-mm syringe filter (0.45 µm nylon, GRACE, USA) | |||
| [Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 µL, PTFE/Silicone septa]. |
References
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