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Medicine

Ivacaftor, इसके प्रमुख चयापचयों, और सिस्टिक फाइब्रोसिस रोगियों के जैविक तरल पदार्थ में Lumacaftor के नैदानिक नमूनों के उच्च प्रवाह विश्लेषण के लिए अनुकूलित LC-ms/

Published: October 15, 2017 doi: 10.3791/56084
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Drug Delivery, Disposition and Dynamics, Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Monash University, 2Monash Biomedicine Discovery Institute, Department of Microbiology, Monash University

Summary

Ivacaftor और Ivacaftor-lumacaftor संयोजन दो नए CF दवाओं रहे हैं । हालांकि, अभी भी उनके PK/पीडी और औषध विज्ञान पर समझ की कमी है । हम ivacaftor और उसके प्रमुख चयापचयों के एक साथ विश्लेषण के लिए एक अनुकूलित HPLC-एमएस तकनीक वर्तमान, और lumacaftor ।

Abstract

सिस्टिक फाइब्रोसिस ट्रांस झिल्ली कंडक्टर नियामक (CFTR) में दोष सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) के कारण, जीवन के साथ एक रोग फुफ्फुसीय अभिव्यक्तियों की धमकी दे रहे हैं । Ivacaftor (IVA) और Ivacaftor-lumacaftor (लूमा) संयोजन दो नई सफलता CF दवाओं कि सीधे गतिविधि और दोषपूर्ण CFTR-प्रोटीन की तस्करी को मिलाना है । हालांकि, वहां अभी भी pharmacokinetic/pharmacodynamic मानकों और ivacaftor और lumacaftor के औषध विज्ञान पर समझ की कमी है । मानक ivacaftor या carboxylate-lumacaftor संयोजन प्राप्त करने वाले रोगियों में जैविक द्रव्यों में ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-ivacaftor, और lumacaftor की सांद्रता के एक साथ विश्लेषण के लिए HPLC-एमएस तकनीक थेरेपी पहले हमारे समूह द्वारा विकसित किया गया है और आंशिक रूप से एफडीए मानकों को मांय । हालांकि, रोगी नमूनों की एक बड़ी संख्या के उच्च प्रवाह विश्लेषण की अनुमति देने के लिए, हमारे समूह एक छोटे ताकना आकार रिवर्स चरण क्रोमैटोग्राफी स्तंभ (२.६ µm, C8 १०० Å; ५० x २.१ मिमी) और एक ढाल विलायक प्रणाली के उपयोग के माध्यम से रिपोर्ट की विधि अनुकूलित है ( 0-1 min: ४०% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 मिनट: ७०% B पर आयोजित; 2.7-2.8 मिनट: 70-90% B; 2.8-4.0 min: ९०% B धुलाई; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 मिनट: एक isocratic रेफरेंस के बजाय ४०% B पर आयोजित किया गया । इस अध्ययन के लक्ष्य के प्रति नमूना नाटकीय रूप से HPLC-एमएस विश्लेषण समय कम ~ 15 मिनट से नमूना है, जो रोगी के नमूनों की एक बड़ी राशि के विश्लेषण के लिए आवश्यक है प्रति केवल 6 मिनट के लिए किया गया था । यह समीचीन विधि जोखिम में अध्ययन के लिए काफी उपयोगिता की होगी इन सफलता CF दवाओं की प्रतिक्रिया रिश्तों ।

Introduction

सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) एक आम आनुवंशिक फेफड़े, जिगर, अग्ंयाशय के रिसाव बलगम ग्रंथियों को शामिल रोग है, और इस तरह के फेफड़े समारोह और अग्नाशय कमी में गिरावट के रूप में प्रगतिशील बहु अंग विफलता, कारण आंतों1, 2,3. Ivacaftor (IVA) पहला खाद्य और औषधि प्रशासन है (एफडीए-अमेरिका) और यूरोपीय दवाओं एजेंसी (EMA) को मंजूरी दी सिस्टिक फाइब्रोसिस ट्रांस-झिल्ली कंडक्टर नियामक (CFTR) potentiator दवा, एक महत्वपूर्ण उत्पादन सबूत नैदानिक प्रभावकारिता के साथ G551D-CFTR [glycine (G) स्थिति ५५१ में एक छोटे सबसेट में placebo पर फेफड़े समारोह में सुधार एसपारटिक एसिड (डी) द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है] (CF जनसंख्या का ~ 4-5%))4,5. इस मौखिक रूप से प्रशासित दवा CFTR चैनल खोलने बढ़ जाती है, इस प्रकार क्लोराइड आयन प्रवाह में वृद्धि और प्राथमिक दोष है कि CF4,6के नैदानिक अभिव्यक्तियों की ओर जाता है पर अभिनय. दुर्भाग्य से, IVA मोनोथेरापी अधिक आम homozygous F508del उत्परिवर्तन के साथ रोगियों में प्रभावी नहीं है [CFTR जीन के फ्रेम विलोपन में जो फेनिलएलनिन (एफ) की स्थिति ५०८ पर परिणाम में जो परिणाम CFTR में देखा है, जो ~ ५०% CF जनसंख्या7,8.

हाल ही में, एफडीए CFTR पढ़नेवाला दवा lumacaftor के साथ IVA के संयोजन के लिए स्वीकृति प्रदान की है । एक CFTR पढ़नेवाला (lumacaftor, लूमा) जो F508del चैनल गतिविधि CFTR के साथ सेल की सतह के लिए IVA-potentiates बचाता है, जो प्रभावी ढंग से CF जनसंख्या के सबसे करने के लिए उपचार खिड़की का विस्तार के संयोजन की चालाक रणनीति5 . सवाल पर रहना है कि इन दवाओं विरोधी रिपोर्टों के एक नंबर के रूप में अपना वादा पूरा होगा कि उनके नैदानिक प्रभावकारिता9,10पर डाली संदेह उभरा है । इसके अतिरिक्त, फेफड़े समारोह में सुधार केवल मामूली थे (2.6-4% ivacaftor-lumacaftor संयोजन के लिए) एक G551D उत्परिवर्तन (10.6-12.5%)8असर रोगियों में IVA मोनोथेरापी के साथ प्राप्त की सफलता की तुलना में । IVA और लूमा के बीच संभावित विरोधी दवा दवा बातचीत है कि संभावित ivacaftor-lumacaftor संयोजन के नैदानिक प्रभावकारिता सीमा अपने आदर्श pharmacokinetic गुण7,11से कम से आते हैं । IVA बड़े पैमाने पर cytochrome P450 एंजाइमों (सिप) द्वारा metabolized है, मुख्य रूप से एक सक्रिय metabolite hydroxymethyl-IVA (IVA-m1, m1) और एक निष्क्रिय रूप IVA-carboxylate (IVA-M6, M6)7,12। CYP3A4 उत्प्रेरण लूमा, दूसरे हाथ पर, बड़े पैमाने पर metabolized नहीं है और काफी हद तक मल में अपरिवर्तित रूप से उत्सर्जित है11. के रूप में CYP3A4 उत्प्रेरण cytochrome चयापचय प्रेरित, ivacaftor (CYP3A4 सब्सट्रेट) सांद्रता कम किया जा सकता है. इसके अलावा, दोनों IVA और लूमा बहुत hydrophobic अणुओं रहे है और ~ ९९% प्लाज्मा प्रोटीन, जो काफी सीमा मुक्त (सक्रिय) दवा एकाग्रता1,13के लिए बाध्य ।

सामूहिक रूप से, इन कारकों ivacaftor-lumacaftor संयोजन की नैदानिक प्रभावकारिता को सीमित करने के लिए एक साथ आ सकता है । यह ज्ञात नहीं है कि इष्टतम प्लाज्मा सांद्रता ivacaftor-lumacaftor संयोजन के लिए वर्तमान खुराक आहार के तहत प्राप्त कर रहे हैं या यदि चिकित्सीय दहलीज8बनाए रखा है । वर्तमान में, इस तरह के पीक और स्थिर ivacaftor या ivacaftor-lumacaftor के प्लाज्मा सांद्रता के रूप में pharmacokinetic मानकों के बारे में जानकारी की धनाभाव है । ivacaftor और lumacaftor के नोट चयापचय को देखते हुए, जोखिम की निगरानी-प्रतिक्रिया रिश्तों ivacaftor या ivacaftor-lumacaftor चिकित्सा के लिए इष्टतम खुराक परहेजों को प्राप्त करने के लिए अपेक्षित है. हमारे समूह ने हाल ही में IVA और लूमा14के एक्सपोज़र-प्रतिसाद संबंधों की निगरानी के लिए पहली HPLC/ ivacaftor, इसके चयापचयों, और lumacaftor की सांद्रता मापने की कोई वैकल्पिक तकनीक आज तक सूचित नहीं की गई है । करने के लिए एक बड़ा सामूहिक रोगी के उच्च प्रवाह विश्लेषण की अनुमति और नाटकीय रूप से विश्लेषण समय को कम करने के लिए, हमारे समूह के एक छोटे ताकना आकार रिवर्स चरण क्रोमैटोग्राफी कॉलम और एक ढाल विलायक प्रणाली के उपयोग के माध्यम से रिपोर्ट विधि अनुकूलित है कि लागत और रनिंग टाइंस कम कर देता है ।

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Protocol

< p वर्ग = "jove_content" > नैतिकता के लिए अनुमोदन मोनाश विश्वविद्यालय मानव अनुसंधान नैतिकता समिति (MUHREC) से प्राप्त किया गया था ।

< p class = "jove_title" > 1. परख के आवेदन: रोगी नमूना संग्रह

  1. जब रोगी या तो १५० मिलीग्राम ivacaftor या ivacaftor १२५ मिलीग्राम/lumacaftor २०० मिलीग्राम की उनके मानक खुराक लेता है समय रिकॉर्ड.
    2. रोगी रक्त का नमूना एकत्र किया जाता है जब सही समय नीचे
  2. नोट.
    नोट: हम एक 24 एच समय पाठ्यक्रम पर 4-5 नमूनों का संग्रह करने की सलाह देते हैं । यदि केवल एक नमूना का संग्रह संभव है, संकेत दिया समय बिंदु है 2.5-4 h पोस्ट ivacaftor या ivacaftor-lumacaftor संयोजन खुराक के रूप में सी मैक्स स्थिर अवस्था में सांद्रता प्राप्त होगी & #62 के बाद; लगातार इलाज के 5 दिन.
  3. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अनुपचारित नीले ट्यूबों में रक्त की 4-5 मिलीलीटर इकट्ठा ।
  4. पूरे रक्त के संग्रह के बाद, यह कमरे के तापमान पर परेशान छोड़ने के द्वारा खून का थक्का करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    नोट: यह आमतौर पर लेता है 15-30 min.
  5. में 10 मिनट के लिए 1000-2000 x g पर केंद्रापसारक द्वारा थक्का निकालें 4 & #176; C एक प्रशीतित केंद्रापसारक में । परिणामी supernatant प्लाज्मा.
    6. के रूप में निर्दिष्ट
  6. निंनलिखित केंद्रापसारक, तुरंत एक स्वच्छ supernatant ट्यूब में (प्लाज्मा) हस्तांतरण एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर । रोगी आईडी के साथ प्लाज्मा ट्यूब लेबल ( जैसे , रोगी 1), प्रशासित दवा ( जैसे , ivacaftor-lumacaftor संयोजन), और समय रोगी नमूना एकत्र किया गया था ( उदा , २.५ एच पोस्ट खुराक).
  7. हैंडलिंग के दौरान 2-8 & #176; ग पर नमूने बनाए । एक बार हैंडलिंग पूरा हो गया है, पर स्टोर नमूनों & #8211; 20 & #176; C.
  8. यदि आवश्यक हो, विश्लेषण संस्थान के लिए एक अनुमोदित कूरियर के साथ जहाज के नमूने ।
    नोट: नमूनों को शुष्क बर्फ पर आने तक भेज दिया जाता है और इसे & #8211 पर रखा जाना चाहिए; ८० & #176; ग तक analysis.
< p class = "jove_title" > 2. खर्च किए गए नमूनों और मानकों की तैयारी और संसाधन

< p class = "jove_content" > नोट: स्वस्थ दानदाताओं से प्लाज्मा ना & #239; ivacaftor/lumacaftor थेरेपी के लिए ve ऑस्ट्रेलियाई रेड क्रॉस से प्राप्त किया गया था । अखंडता को सुनिश्चित करने के लिए संग्रह और प्रसंस्करण के दौरान 2-8 & #176; C पर सभी नमूनों/मानकों को रखा जाना चाहिए । एक बार हैंडलिंग पूरा हो गया है, पर संग्रह नमूने & #8211; 20 & #176; ग.

  1. बाहर वजन IVA, IVA-carboxylate, hydroxymethyl-IVA, और लूमा जो आंतरिक मानकों के लिए एक संदर्भ के रूप में काम करेगा ।
  2. में एलसी-MS ग्रेड लूमा में प्रत्येक analyte (IVA, M1, M6 और मेथनॉल) के दो स्वतंत्र स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें १०० & #181; g/ml और 10 & #181; g/ml.
    नोट: यौगिकों benchtop.
    3. पर 10 दिनों के बाद समाप्त हो जाएगी
  3. नए सिरे से तैयार नियंत्रण रेखा-एमएस अंशांकन मानक मानव प्लाज्मा में अंशांकन मानक स्टॉक समाधान के कमजोर पड़ने के बाद से प्रत्येक विश्लेषणात्मक चलाने के लिए निंनलिखित सांद्रता प्राप्त करने के लिए: ०.०१, ०.०२५, ०.०५, ०.१, ०.२, ०.५, १.०, २.५, ५.०, और १०.० & #181; g/mL । इन नमूनों को मानक के रूप में संदर्भित किया जाता है ।
  4. करने के लिए प्रोटीन हाला, तैयार ०.१% acetonitrile (ACN, LC-एमएस ग्रेड) में फार्मिक एसिड (एफए) और फ्रिज में छोड़ जब तक की जरूरत है ।
< p class = "jove_title" > 3. खर्च किए गए नमूनों और मानकों का पूर्व उपचार

  1. कमरे के तापमान के लिए equilibrate करने के लिए दोनों रोगी और खाली प्लाज्मा नमूनों की अनुमति दें ।
  2. भंवर प्रति नमूना 15 एस के लिए प्रत्येक प्लाज्मा नमूना मिश्रण करने के लिए ।
  3. अंतरण a १०० & #181; aliquot मानकों या विश्लेषण के लिए एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में रोगी के नमूने के लिए या तो रिक्त प्लाज्मा के एल.
  4. मानक ट्यूबों में से प्रत्येक में आंतरिक मानक IVA जोड़ें ( उदा , ०.०१, ०.०२५, ०.०५, ०.१, ०.२, ०.५, १.०, २.५, ५.०, और १०.० & #181; g/mL संभावित एकाग्रता श्रेणी को कवर करने के लिए), लिड बंद करें, और के लिए भंवर 2-3 s. ध्यान दें कि आंतरिक मानक केवल है खाली प्लाज्मा को जोड़ा और कोई आंतरिक मानक रोगी नमूनों में जोड़ा जाता है ।
  5. दोहराएँ चरण ३.४. के लिए अन्य आंतरिक मानक M1, M6, और लूमा.
  6. प्रत्येक ट्यूब संक्षेप में नीचे स्पिन यह सुनिश्चित करने के लिए कि ढक्कन पर कोई बूंदें नहीं हैं ।
  7. Add २०० & #181; ACN में ०.१% एफए के मिश्रण के एल प्रत्येक ट्यूब में प्लाज्मा प्रोटीन हाला.
  8. भंवर के बारे में 15 एस
    9. के लिए जोरदार मिश्रण
  9. ट्यूबों फ्रिज में 10 मिनट के लिए खड़े करने की अनुमति दें ।
  10. केंद्रापसारक पर १०,००० x g पर 10 मिनट के लिए 4 & #176; C, यदि संभव हो तो.
  11. फ़िल्टर a २०० & #181; L aliquot supernatant के माध्यम से एक 13 मिमी सिरिंज फिल्टर में एक १.५ मिलीलीटर HPLC शीशी.
  12. अंतरण १०० & #181; HPLC-ms विश्लेषण के लिए LC-ms शीशी में supernatant के एल.
< p class = "jove_title" > 4. HPLC-एमएस विश्लेषण

< p class = "jove_content" > नोट: HPLC-ms विश्लेषण एक नियंत्रण रेखा पर किया गया था-ms सिस्टम ट्रिपल quadrupole मास स्पेक्ट्रोमीटर ( Table 1 ) के साथ युग्मित.

  1. LC-MS सिस्टम पर बारी, ऑटो नमूना में नमूनों के साथ ट्रे रखें.
  2. एक गार्ड स्तंभ के लिए स्तंभ संलग्न और नियंत्रण रेखा से कनेक्ट-एमएस प्रणाली.
  3. मोबाइल चरणों की दोनों बोतलों (बोतल ए: १००% ACN; बोतल बी: ०.१% पानी में फार्मिक एसिड) और equilibrate नियंत्रण रेखा-MS प्रणाली संलग्न करें ।
  4. निंन पैरामीटर को LC-MS प्रोटोकॉल में शामिल करें ।
    1. एक 2:1 अनुपात (अपशिष्ट: एमएस प्रवेश) में जन स्पेक्ट्रोमीटर में प्रवेश करने से पहले मोबाइल चरण प्रवाह विभाजित ।
    2. ०.५ मिलीलीटर/मिनट की एक प्रवाह दर पर एक ढाल रेफरेंस प्रदर्शन एक मोबाइल १००% ACN और ०.१% पानी में अंलीय एसिड से मिलकर चरण का उपयोग कर (प्रारंभ बिंदु पर 40:60, v/ ध्यान दें कि विश्लेषण भर में मोबाइल चरण परिवर्तन की मात्रा प्रतिशत.
    3. एक सकारात्मक electrospray ionization विधा में जन स्पेक्ट्रोमीटर को संचालित करते हैं.
    4. सुनिश्चित करें कि नियंत्रण रेखा-MS सेटिंग्स निंनानुसार हैं: आयन स्प्रे वोल्टेज ४.५ केवी, टक्कर ऊर्जा २९५.९ वी, nebulizing गैस: 3 एल पर नाइट्रोजन/टक्कर गैस: आर्गन; सुखाने गैस प्रवाह 20 l/मिनट, लेंस वोल्टेज Q3:-22 V, desolvation तापमान २५० & #176; सी हीट ब्लॉक के साथ तापमान ४०० & #176; C.
    5. इंजेक्षन 10 & #181; L वॉल्यूम प्रति नमूना.
      6. मल्टीपल रिएक्शन मॉनिटरिंग (MRM) का उपयोग कर
    6. डिटेक्ट analytes । m/z ३९२.४९ & #8594 के आयन संक्रमणों की निगरानी; ३९३, m/z ४०८.४९ & #8594; ४०९, m/z ४२२.४७ & #8594; ४२३ और m/z ४५२.४० & #8594; ४५३ फॉर IVA, IVA-M1, IVA-M6 and लूमा, क्रमशः.
      नोट: नए अनुकूलित विधि अभी तक पूरी तरह से एफडीए मानकों के अनुसार मांय किया जाना है ।
< p class = "jove_title" > 5. अंशांकन curves

  1. एक विश्लेषणात्मक चार analytes के आंतरिक मानक और अंशांकन मानक नाममात्र की सांद्रता के लिए प्रत्येक के शिखर क्षेत्र के अनुपात के बीच संबंधों का उपयोग कर चलाने से पहले नियंत्रण रेखा-एमएस अंशांकन curves का निर्माण ivacaftor (IVA-M1, IVA-M6 या लूमा) के भीतर LC-MS सेटिंग्स प्रोग्राम.
    नोट: अंशांकन वक्र के निर्माण के लिए सटीक कदम नियंत्रण रेखा-एमएस उपकरणों का इस्तेमाल किया जा रहा के मॉडल पर निर्भर है । यह जानकारी उपकरण मैनुअल में उपलब्ध हो सकता है ।
  2. 1/C 2 को सांद्रता के पारस्परिक के अनुसार भारित करके रेखीय कम-वर्ग प्रतिगमन विश्लेषण निष्पादित करें ।

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Representative Results

हम हाल ही में एक विधि की सूचना दी है, आंशिक रूप से एफडीए मानकों के लिए मान्य, एक ट्रिपल-quadrupole नियंत्रण रेखा पर-MS और एक HPLC डिटेक्टर सिस्टम, एक C8 स्तंभ का उपयोग कर (5 µm, ३.९ मिमी x ५० मिमी आईडी) के साथ मोबाइल चरण १००% ACN और ०.१% पानी में फार्म का एसिड से मिलकर (40:60 , v/v) 1 मिलि/मिनट की एक प्रवाह दर पर । चोटियों का एक रैखिक सहसंबंध सभी चयापचयों, ivacaftor, Iva-M1, Iva-M6, और lumacaftor14के लिए मानव प्लाज्मा में ०.०१ से 10 µ g/एमएल के लिए एक एकाग्रता सीमा से अधिक मनाया गया था । यहां इस विधि को नाटकीय रूप से कम नियंत्रण रेखा प्रतिधारण समय की अनुमति अनुकूलित किया गया है और, इसलिए, परख, जो नैदानिक नमूनों की एक बड़ी राशि का उच्च प्रवाह विश्लेषण के लिए आवश्यक है की पूरी चल समय है । परख एक छोटे ताकना आकार रिवर्स के उपयोग के माध्यम से अनुकूलित किया गया था चरण क्रोमैटोग्राफी कॉलम और एक ढाल विलायक प्रणाली के बजाय एक isocratic रेफरेंस, ~ 15 मिनट से केवल 6 मिनट के लिए नमूना प्रति समय को कम करने । analytes electrospray सकारात्मक मोड में कई प्रतिक्रिया निगरानी (MRM) का उपयोग कर निर्धारित कर रहे हैं । प्रक्रिया में मान्य किया जाना चाहिए घर का उपयोग करने से पहले, के रूप में हम पहले से14विस्तृत है ।

विधि की सटीकता ९४.२% ± ४.५३% ९७.५% ± २.९४% करने के लिए, analyte14के आधार पर किया गया था । अंशांकन सीमा ०.०१ से 10 µ g/mL नैदानिक सेटिंग में उपयोग के लिए लागू है, विशेष रूप से दी गई है कि ivacaftor-lumacaftor थेरेपी के अंतर्गत, सक्रिय IVA और M1 के बहुत कम सांद्रता हमारे समूह द्वारा पहले सूचित किया गया, प्लाज्मा में संभावित कारण लूमा, जो व्यापक IVA चयापचय14में परिणाम द्वारा CYP3A4 की प्रेरण । प्रत्येक analyte की इंट्रा डे सटीकता छह स्वतंत्र रूप से तैयार गुणवत्ता नियंत्रण (QC) नमूनों के साथ ०.०५, ०.५ की सांद्रता पर एक ही दिन पर मूल्यांकन किया गया था, और 8 µ g/एमएल । लगातार तीन दिन पर छह स्वतंत्र रूप से तैयार QC नमूनों के साथ अंतर दिवसीय सटीकता का मूल्यांकन किया गया । सटीकता और परिशुद्धता सापेक्ष मानक विचलन (RSD) के माध्यम से गणना की गई । प्रत्येक QC नमूने के लिए, RSD मान 15%15से कम होना चाहिए । सभी चार analytes 15%14से कम के RSD मान दिखाई दिए । पता लगाने की निचली सीमा (लोद) और ठहराव (LOQ) की स्थापना की गई: IVA लोद २.५० x 10-3 µ g/एमएल और LOQ ७.५७ x 10-3 µ g/ M1 के लिए, लोद ४.५७ x 10-4 µ g/ml और LOQ १.३८ x 10-3 µ g/ml; के लिए M6 लोद ५.८६ x 10-4 µ g/ml और LOQ १.७८ x 10-3 µ g/ml; के लिए लूमा लोद ६.०८ x 10-4 µ g/ml और LOQ १.८४ x 10-3 µ g/एमएल14था । एक ठेठ वर्णलेख चित्रा 1में दिखाया गया है । एक अनुकूलित क्रोमेटोग्राफिक संकल्प के एक मोबाइल चरण का उपयोग कर प्राप्त किया गया था १००% ACN और ०.१% पानी में फार्मिक एसिड (प्रारंभिक बिंदु पर 40:60, v/C8 स्तंभ पर एक ग्रेडिएंट रेफरेंस के साथ (२.६ µm; १०० Å; ५० mm x २.१ mm). ढाल जुदाई मोबाइल चरण बी के ४०% के साथ 0 से 1 मिनट के लिए इस्तेमाल किया गया था; फिर 40%-मोबाइल चरण बी के ७०% 1 मिनट से 2 मिनट के लिए; 2 मिनट से २.७ मिनट के लिए मोबाइल चरण B का ७०% होल्डिंग; २.७ मिनट से २.८ मिनट के लिए मोबाइल चरण बी के ९०% से ७०% की वृद्धि; धुलाई प्रयोजनों के लिए ४.० मिनट के लिए २.८ मिनट से मोबाइल चरण बी का ९०% होल्डिंग; अंत में ९०% से मोबाइल बी के ४०% ४.० मिनट से ४.१ मिनट के लिए लौट रहे हैं; फिर मोबाइल चरण B के ४०% को प्रारंभिक स्थितियों के लिए ६.० मिनट से ४.१ मिनट तक दबाए रखें (चित्र 1) । नियंत्रण रेखा प्रतिधारण बार M6 १.० मिनट के लिए निंनानुसार थे; M1 १.३ मिनट के लिए; IVA के लिए: १.५५ min; लूमा के लिए: २.३ मिनट (चित्र 1) । सभी खाली प्लाज्मा नमूनों में, या तो analytes के प्रतिधारण समय के साथ कोई हस्तक्षेप नहीं देखा गया था, और न ही lumacaftor के साथ ivacaftor के संयोजन से हस्तक्षेप का पता चला था.

Figure 1
चित्र 1 : प्रतिनिधि LC-MS वर्णलेख मानव प्लाज्मा की 10 µ g/एमएल के साथ नुकीला IVA-M6, IVA-M1, lumacaftor, और ivacaftor के ग्रेडिएंट रेफरेंस के संबंध में पम्प. एक ०.१% पानी और पंप में फार्म का अंल b १००% acetonitrile (0-1 मिनट: ४०% b; 1-2 मिनट: 40%-७०% b; 2-2.7 मिनट: ७०% b पर आयोजित; 2.7-2.8 मिनट: 70%-९०% b; 3.8-4.0 मिनट: ९०% b वाशिंग; 4.0-4.1 मिनट: 90%-४०% b; 4.1-6.0 मिनट: ४०% b पर आयोजित) । m/z ३९२.४९ → ३९३ के आयन संक्रमण, m/z ४०८.४९ → ४०९, m/ z ४२२.४७ → ४२३ और m/z ४५२.४० → ४५३ ivacaftor, IVA-M1, IVA-M6 और lumacaftor, क्रमशः के एमएस/ms मॉनिटरिंग के लिए उपयोग किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

HPLC अटी
स्तंभ c8; २.६ µm; १०० Å; ५० x २.१ मिमी
गार्ड कॉलम HPLC में लाइन फिल्टर ०.५ µm; गहराई फ़िल्टर x ०.००४ इन्द
फ़िल्टर x ०.००४ इन्द
स्तंभ तापमान: 30 डिग्री सेल्सियस
मोबाइल फेज एक: पानी में ०.१% एफए
मोबाइल चरण B: १००% ACN
प्रारंभिक बिंदु पर मोबाइल चरण संरचना ६०/४० (v/
नमूना तापमान: 4 ° c
इंजेक्शन की मात्रा: 5 µ l
सुई धोने ८०% मेथनॉल, २०% पाणी ३०० µ l
प्रवाह दर: ०.५ मिलीलीटर/
ढाल: -1 min: ४०% B
-1-2 min: ४०%-७०% B
-2-२.७ min: ७०% B पर आयोजित
-२.७-२.८ min: ७०%-९०% B
-२.८-४.० मिनट: ९०% बी धुलाई
-४.०-४.१ मिनट: ९०%-४०%
-४.१-६.० मिनट: ४०% पर आयोजित किया,
कुल रन: 6 मिनट
अवधारण समय: M6 के लिए अवधारण समय: १.० मिनट
M1:१.३ मिनट के लिए अवधारण समय
IVA के लिए अवधारण समय: १.५५ मिनट
लूमा के लिए अवधारण समय: २.३ मिनट
एमएस शर्तें
डिटेक्शन मोड: electrospray पॉजिटिव ईएसआई +
आयन स्प्रे वोल्टेज: ४.५ केवी
टक्कर ऊर्जा: २९५.९ वि
Nebulizing गैस (नाइट्रोजन): 3 एल/
सीआईडी गैस: २३० केपीए
सुखाने गैस (नाइट्रोजन) प्रवाह: 20 L मिनट/
Q1 पूर्व रॉड पूर्वाग्रह: -& #1
६०;      ५ वी ce: -25 वी Q3 पूर्व रॉड पूर्वाग्रह: -5 वी वर्तमान इंटरफ़ेस: ०.१ यूए Desolvation तापमान: २५० ° c गर्मी ब्लॉक तापमान: ४०० ° c IVA एम जेड/ ३९२.४९ → ३९३ M1 एम जेड/ ४०८.४९ → ४०९ M6 एम जेड/ ४२२.४७ → ४२३ लूमा एम जेड/ ४५२.४० → ४५३

तालिका 1: HPLC-MS शर्तों का विवरण ।

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Discussion

जैसा कि पहले की रिपोर्ट, हमारे समूह के लिए पहली बार विकसित किया है और तेजी से पता लगाने और ivacaftor और उसके प्रमुख चयापचयों hydroxymethyl-IVA M1 (सक्रिय) और IVA-carboxylate M6 (निष्क्रिय) के ठहराव के लिए एक HPLC और नियंत्रण रेखा-एमएस विधि की पुष्टि; और CF रोगियों के प्लाज्मा और थूक में lumacaftor14. हमारे समूह ने बताया परख पहले सफलतापूर्वक लूमा, IVA, IVA-M1, और IVA-M6 के प्लाज्मा और CF IVA १५० मिलीग्राम/q12 ज के साथ स्थिर राज्य मानक चिकित्सा के दौर से गुजर रोगियों के थूक में की एकाग्रता यों तो इस्तेमाल किया गया था (लैटिन शब्दावली: quaque 12 ज; एक बार हर 12 ज) या २०० मिलीग्राम/q12 h लूमा-१२५ mg/q12 h IVA संयोजन14. मरीज के नमूनों की बड़ी मात्रा का उच्च प्रवाह विश्लेषण के लिए, हम एक छोटे ताकना आकार रिवर्स-चरण क्रोमैटोग्राफी स्तंभ C8 (२.६ µm; १०० Å; ५० x २.१ mm2) और एक ढाल विलायक प्रणाली के बजाय वर्तमान का उपयोग करके रिपोर्ट विधि अनुकूलित है isocratic का रेफरेंस है । यह प्रति नमूना 6 मिनट के लिए चल रहे समय कम कर देता है ।

यह विश्वसनीय और उपंयास विधि जैविक तरल पदार्थ में ivacaftor और ivacaftor-lumacaftor संयोजन के चिकित्सीय दवा की निगरानी के लिए एक सरल, संवेदनशील और तेजी से दृष्टिकोण प्रदान करता है । जोखिम-प्रतिक्रिया संबंधों को अधिकतम करने के लिए दवा प्रभावकारिता के रूप में अच्छी तरह के रूप में शामिल स्वास्थ्य देखभाल लागत को विकसित करने की आवश्यकता को देखते हुए, और अधिक संवेदनशील उपकरण विकसित करने की आवश्यकता है और सबूत के उपयोग में चिकित्सकों सहायता के लिए मांय-आधारित चिकित्सा और उच्च प्रवाह cf से पीड़ित रोगियों के लिए विश्लेषणात्मक तकनीक. हमारे समूह पहले एक आंशिक रूप से मान्य HPLC-MS के लिए एक साथ IVA, IVA-M1, IVA-M6, और प्लाज्मा और CF रोगियों के थूक में लूमा का विश्लेषण के लिए रिपोर्ट किया गया है14. ivacaftor या ivacaftor-lumacaftor संयोजन प्राप्त रोगियों के विश्लेषण के लिए एक आम और आसान करने के लिए उपयोग विश्लेषणात्मक प्रोटोकॉल की स्थापना डेटा की तुलना और भविष्य के pharmacokinetic अध्ययन के परिणामों की व्याख्या की सुविधा होगी । IVA मापने, IVA-M1, IVA-M6, और लूमा के जैविक तरल पदार्थ में नियंत्रण रेखा का उपयोग कर-एमएस तकनीक जोखिम की खोज के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रतीक हो सकता है चिकित्सीय परिणामों के संबंध में प्रतिक्रिया संबंध ।

अधिक आम तौर पर, HPLC-एमएस विश्लेषण ivacaftor या ivacaftor-lumacaftor संयोजन के जैविक तरल पदार्थ में CF से पीड़ित रोगियों के साथ व्यक्तिगत pharmacotherapeutic रणनीतियों के कार्यांवयन के लिए एक आणविक आधार प्रदान कर सकता है और साबित हो सकता है संभावित कम लगातार खुराक के लिए की आवश्यकता का संकेत द्वारा, महंगा ivacaftor या ivacaftor-lumacaftor संयोजन चिकित्सा अधिक लागत प्रभावी बनाने के आधार पर उपयोगी है । नैदानिक pharmacokinetic/pharmacodynamic अध्ययन करने के लिए प्रस्तावित विश्लेषणात्मक विधि लागू करके, अवसर आगे एक बड़ा रोगी पर ivacaftor या ivacaftor-lumacaftor संयोजन के pharmacokinetic मापदंडों की जांच करने के लिए पैदा हुई है सामूहिक.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

जीएल और टीवी राष्ट्रीय एलर्जी और संक्रामक रोग (NIAID) के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01 AI111965) के संस्थानों द्वारा समर्थित हैं । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि एलर्जी और संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थान या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं । एम सी एक ऑस्ट्रेलियाई NHMRC प्रिंसिपल रिसर्च फेलो है । जे. एल. एक ऑस्ट्रेलियाई राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (NHMRC) वरिष्ठ अनुसंधान फेलो है, और टीवी एक ऑस्ट्रेलियाई NHMRC उद्योग कैरियर विकास स्तर 2 रिसर्च फेलो है । ई. के. एस एएसएम (अमेरिकन सोसायटी फॉर माइक्रोबायोलॉजी) के लिए एक नियुक्त युवा राजदूत २०१७ है और ऑस्ट्रेलियन स्नातकोत्तर पुरस्कार से समर्थित है.
इस काम के भागों में 12वें Australiasian संमेलन में सिस्टिक फाइब्रोसिस पर मेलबोर्न में प्रस्तुत किया गया था (5-8 अगस्त २०१७ केगु ) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IVA (Cat#S114)  SelleckChem (USA). 
LUMA (Cat#S1565)  SelleckChem (USA). 
IVA-carboxylate (Cat# 510242247CS)  Clearsynth (Canada). 
hydroxymethyl-IVA (Cat# 510240849CS)  Clearsynth (Canada). 
Methanol (MeOH, LC-MS grade),  Sigma-Aldrich
acetonitrile (ACN, LC-MS grade)  Sigma-Aldrich
formic acid (FA)  Sigma-Aldrich
triple-quadrupole Shimadzu 8030 LC-MS 
Phenomenex Kinetex (2.6 µm C8 100 Å; 50 × 2.1mm)
(KrudKatcher Ultrea HPLC In-Line Filter 0.5 m Depth Filter x 0.004inID). 
1.5 mL polypropylene microcentrifuge tube (VWR). 
Eppendorf Centrifuge 5430
13-mm syringe filter (0.45 µm nylon, GRACE, USA) 
[Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 µL, PTFE/Silicone septa]. 

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References

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चिकित्सा अंक १२८ Ivacaftor lumacaftor HPLC-एमएस सिस्टिक फाइब्रोसिस प्लाज्मा थूक जैविक तरल पदार्थ
Ivacaftor, इसके प्रमुख चयापचयों, और सिस्टिक फाइब्रोसिस रोगियों के जैविक तरल पदार्थ में Lumacaftor के नैदानिक नमूनों के उच्च प्रवाह विश्लेषण के लिए अनुकूलित LC-ms/
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Schneider, E. K., Reyes-Ortega, F.,… More

Schneider, E. K., Reyes-Ortega, F., Li, J., Velkov, T. Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients. J. Vis. Exp. (128), e56084, doi:10.3791/56084 (2017).

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