Summary
بروتوكول أوسام الموصوفة هنا الأمثل لاستزراع astrocytes مورين بمعزل عن غيرها من خلايا المخ بطريقة سريعة وبسيطة وغير مكلفة. أستروسيتيس أوسام معرض عفوية Ca2 + إشارات ومورفولوجيا والجينات التعبير ملامح مشابهة ل astrocytes في فيفو.
Abstract
أوسام ( لوث-تكلف هعاصي sطلعت ستروسيتي مسلوب) ينطوي البروتوكول بطريقة سريعة وبسيطة وغير مكلفة لتوليد كميات كبيرة من فيفو--مثل الماوس وفار astrocyte الزراعات الأحادية : يمكن عزل خلايا الدماغ من مناطق مختلفة من الدماغ، وبعد أسبوع ثقافة الخلية، تخلصت الخلايا غير أستروسيتيك بوضع أطباق الثقافة على شاكر ح 6 في الحاضنة. ثم يتم باساجيد astrocytes المتبقية في لوحات جديدة مع وسيلة محددة astrocyte (يطلق عليها NB + H). ملحوظة: + ح تحتوي على تركيزات منخفضة من الهيبارين-ملزمة مماثلة مثل عامل النمو (هبيجف)، الذي يستخدم بدلاً من المصل في المتوسط. بعد تزايد في NB + H، قد أستروسيتيس أوسام مورفولوجيا النجمية وميزة العمليات الدقيقة. وعلاوة على ذلك، أن هذه أستروسيتيس أكثر في فيفو--مثل التعبير الجيني من astrocytes المتولدة عن أساليب نشرها مسبقاً. Ca2 + تصوير وديناميات حويصلة، وأحداث أخرى قريبة من الغشاء وبالتالي يمكن دراستها في العمليات أستروسيتيك الجميلة في المختبر، مثلاً، باستخدام الخلايا الحية [كنفوكل] أو مجهرية TIRF. جدير بالذكر أن أستروسيتيس أوسام أيضا يحمل عفوية Ca2 + إشارات مماثلة إلى astrocytes في فيفو.
Introduction
أستروسيتيس تؤثر على وظيفة المخ من خلال الدعم الغذائي وتدفق الدم، وإشارات متشابك واللدونه والاتصالات بين الخلايا--وهي الآليات التي تتمحور حول عمليات أستروسيتيك رقيقة. يسمح البروتوكول أوسام الموصوفة هنا دراسة هذه العمليات دون تدخل من الخلايا العصبية وغيرها إطلاق، ومفيدة مثلاً، للتعبير عن العديد من البروتينات وحتى Ca2 + إشارات التداخل عبر خلايا الدماغ المختلفة أنواع. علاوة على ذلك، هذا الأسلوب يتغلب على القيود المفروضة على التقنيات المتاحة سابقا. على وجه الخصوص، يوفر لنا البروتوكول في فيفو--مثل طريقة رخيصة والتعبير الجيني في سريعة، سهلة، ومورفولوجيا (النجمية astrocytes مع العمليات رقيقة).
مورفولوجيا الخلايا والجينات، والعديد من العمليات التنظيمية الأخرى تتأثر مباشرة بالبيئة. في صحن ثقافة، يشير هذا إلى عوامل الصادرة عن الخلايا المحيطة بها، ولكن أيضا الوسيلة التي تزرع الخلايا. أستروسيتيس، هبيجف أفيد سابقا للحث على مورفولوجيا النجمية1 لكن وجد أيضا إزالة التمييز بين أستروسيتيس2. ومع ذلك، استخدمت تركيزات أقل من هبيجف في وقت لاحق لتوليد المزيد في فيفو--مثل أستروسيتيس كما حددت عن طريق تسلسل الحمض النووي الريبي في اثنين من البروتوكولات المختلفة3،4. وعلاوة على ذلك، تتغير مورفولوجيا astrocyte مع تكوين المتوسطة، بغض النظر عن البروتوكول4: المتوسطة نيوروباسال بتركيز منخفض من هبيجف الأمثل لزراعة النجمية astrocytes، بينما الأخرى التراكيب متوسطة الحجم (مثلاً، مصل الدم المحتوية على دميم) إنتاج خلايا مضلعة (حتى في أستروسيتيس طازجة تم عزلة بواسطة إيمونوبانينج).
بروتوكول أوسام ويتغلب على عيوب الأساليب السابقة لزراعة الزراعات الأحادية أستروسيتي4. التقنيات السابقة لزراعة الزراعات الأحادية astrocyte قد العيوب التالية: مورفولوجيا المضلع، وغير معهود من النجمية astrocytes في فيفو (الأسلوب MD)5؛ طول وتكلفة من البروتوكول (إعداد أستروسيتيس من الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent يأخذ ثلاثة أشهر ويتطلب العديد من الكواشف، بما في ذلك تكلفة عوامل النمو)6؛ كميات قليلة من المواد (طريقة إيمونوبانينج)3؛ والتفريق بين دي astrocytes واشتراط مصفوفة ثلاثية الأبعاد (بوشمان et al.) 1 , 2. وفي المقابل، يوفر البروتوكول أوسام: في فيفو--مثل مورفولوجيا (النجمية astrocytes مع العمليات رقيقة)؛ سريعة وسهلة، وطريقة رخيصة؛ كميات كبيرة من المواد؛ والأكثر في فيفو--مثل التعبير الجيني بالمقارنة مع إيمونوبانيد والعضو المنتدب أستروسيتيس. بالإضافة إلى ذلك، يسمح الثقافة 2D لدراسة Ca2 + الإشارات وإعادة التدوير في عمليات رقيقة، وفي أحداث قريبة من الغشاء حويصلة (مثلاً، TIRF المجهري ليست ممكنة في الثقافات 3D).
وقد استخدمت الأسلوب MD على نطاق واسع منذ صدوره في عام 19805، تقدم تقنية بسيطة وسريعة للزراعات الأحادية astrocyte المضلع. وباختصار، ينطوي الأسلوب MD تنامي خلايا المخ المختلطة في مصل العجل الجنين (FCS)-تحتوي على دميم، تليها تهز الخطوات التي يغني عن astrocytes (كسائر أنواع فصل من الطبق خلايا الدماغ) وكذلك الثقافة في المتوسط نفسها. ويستخدم دميم وتستكمل مع السفح للعديد من أنواع الخلايا الأخرى، بدءاً من الخلايا الليفية و adipocytes خطوط الخلايا السرطان المختلفة، كل منها حصة مورفولوجية المضلع أظهرتها astrocytes العضو المنتدب في الثقافة. حتى أوائل القرن الحادي والعشرين7، يكن الفكر قليلاً نظراً لوسائل الإعلام لتلائم astrocytes، على وجه التحديد لصالح على مورفولوجيا النجمية نموذجي وجدت فيفو في. بروتوكول واحد ونشرت في عام 2011 تحقيق مثل هذا التشكل النجمية: استدعاء الأسلوب إيمونوبانينج، أنها توظف المتوسطة خالية من المصل الأمثل لاستزراع astrocytes3. باستخدام هذا الأسلوب، تتعرض خلايا المخ طازجة معزولة لسلسلة من الأطباق المغلفة بالأجسام المضادة التي تستهدف الخلية الخلية المحددة بنوع البروتينات السطحية، إثراء ل astrocytes. على الرغم من أكثر في فيفو--مثل مورفولوجيا والتعبير الشخصية من أستروسيتيس إيمونوبانيد، لا تزال تعتمد على الأسلوب astrocyte MD معظم الدراسات في المختبر . الأسلوب MD بسيط وسريع، بينما الأسلوب إيمونوبانينج تضم أكثر من خطوات معقدة وتستغرق وقتاً طويلاً اليوم الأول للثقافة (مثل فترات أطول إنزيم الهضم، طبقات حذراً من حلول كثافة مختلفة، إيمونوبانينج نفسها، و عدة الطرد المركزي الخطوات-كل شيء قبل الطلاء). ومع ذلك، باستخدام المتوسط أكثر تخصصا، يقدم الأسلوب أوسام كلا سرعة الأسلوب MD و في فيفو--مثل مورفولوجيا بروتوكول إيمونوبانينج.
عموما، بروتوكول أوسام مفيدة لدراسة أكثر في فيفو--مثل أستروسيتيس في 2D الزراعات الأحادية المعزولة من الخلايا العصبية وإطلاق أخرى (ك تتسم سابقا4 إيمونوستينينجس، إيمونوبلوتس، وتسلسل الحمض النووي الريبي). أنها تسمح لدراسة العمليات أستروسيتيك رقيقة، ويوفر إمكانية كبيرة لتصور Ca2 + إشارات عفوية وأحداث قريبة من الغشاء (مثلاً، تصويرها بالمجهر TIRF).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب على الحيوانات الموصوفة هنا وفقا للمبادئ التوجيهية للرفق بالحيوان الألمانية.
ملاحظة: الجدول الزمني والخطوات الرئيسية للبروتوكول موضحة في الشكل 1.
1-الأعمال التحضيرية
-
إعداد الحلول التالية.
- إعداد دميم + لاستزراع المضلع MD astrocytes: دميم مع FCS 10%، 100 يو البنسلين و 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين.
- إعداد ملحوظة + H لاستزراع النجمية astrocytes: المتوسطة نيوروباسال مع 5 نانوغرام/مل هبيجف، 1 x الملحق B-27، الملحق الجلوتامين x 1، 100 يو البنسلين و 100 ميكروغرام/مل والستربتوميسين.
ملاحظة: يمكن إعداد مختبرين لتركيزات أعلى من هبيجف وتخزينها في-20 درجة مئوية تضاف إلى الوسط كلما دعت الحاجة. - إعداد تشريح المتوسطة (10 ملم حبيس في حبس).
- تحضير مختبرين مل 6-7 من 0.05% التربسين-يدتا ومل 6-7 0.25% التربسين-يدتا في أنابيب 15 مل. وهذه يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية ومذاب في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- اليوم قبل البدء بالبروتوكول، ومعطف الأطباق يعامل زراعة الأنسجة 10 سم مع 5 مل بولييثيلينيميني 0.04% (بي) كل.
- في اليوم التالي، إزالة في جزيرة الأمير إدوارد، وغسل الأطباق بالماء المقطر ومنزوع مرتين. إضافة 12 مل من دميم + لكل لوحة وقبل حجته في الحضانة عند 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل طلاء الخلايا.
- تعد منطقة التشريح: في غطاء تشريح الاندفاق الصفحي، مكان اثنين 10 سم أطباق بيتري مليئة بتشريح المتوسطة على الجليد. لكل مجال المخ لتكون معزولة (مثلاً، اللحاء، الحصين)، إعداد 15-أنبوب مليئة 14 مل تشريح المتوسطة والحفاظ على الجليد. رذاذ وأدوات تشريح (مقص جيد، دومون #3 والملقط #5) مع الإيثانول 70% والمكان بجوار مجهر التشريح في غطاء محرك السيارة.
2-الجرذ أو الفأر تشريح الدماغ
ملاحظة: كل الفئران والجرذان يمكن استخدامها. الحيوانات الأكبر سنا مما يمكن أيضا أن تستخدم P8 (لدينا اختبار حتى P12)، ولكن إزالة السحايا ستصبح متزايدة الصعوبة. علاوة على ذلك، خلية الغلة والصحة سوف تتضاءل، منذ سوف يكون تشكيل خلايا المخ من كبار السن الحيوانات العمليات المعقدة والاتصالات التي قد كسر أثناء تفكك النسيج، مما يؤدي إلى موت الخلية زيادة. الاستعدادات القشرية موضحة هنا، ولكن يمكن أيضا استخدام مناطق الدماغ الأخرى.
- ضع 0.05% التربسين-يدتا في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- Euthanize الحيوانات (الفئران الحوامل الجراء E19، أو الحيوانات P0 P8) بزيادة تركيز أول أكسيد الكربون2 ببطء، وعزل العقل المدبر. تتطلب الخطوات التالية طريقة تعقيم.
-
إذا كان يعمل مع الأنسجة الجنينية، قم أولاً بإزالة الأجنة من الرحم وفتح الأكياس الجنينية، ثم فورا قطع رؤوس مع المقص. عندما يتم قطع جميع الرؤساء، تحويلها إلى تشريح يبرد قبل المتوسطة.
- بمجرد الرؤساء مغمورة في الأجل المتوسط، فتح الجلد والجمجمة (وكلاهما ضعيف جداً في الحيوانات الشباب) مع الملقط وقرصة قبالة المخيخ. رافعة بعناية بقية الدماغ من الجمجمة وأعلى.
ملاحظة: اثنين إلى أربعة أجنة E19 العائد يكفي الأنسجة لاطباق 10 سم على الأقل ثمانية من astrocytes القشرية مطلي في الخلايا 500,000 كل طبق اليوم من تشريح.
- بمجرد الرؤساء مغمورة في الأجل المتوسط، فتح الجلد والجمجمة (وكلاهما ضعيف جداً في الحيوانات الشباب) مع الملقط وقرصة قبالة المخيخ. رافعة بعناية بقية الدماغ من الجمجمة وأعلى.
- الجراء الوليد أو كبار السن، قطع رؤوس مع مقص، وعزل العقل المدبر بقطع الجلد ميديالى في خط مستقيم من الجزء الخلفي الرأس إلى طرف الآنف. سحب الجلد جانبا وعناية قطع الجمجمة اليسار واليمين، ثم رفع الجمجمة العظم. قطع المخيخ، ورافعة بقية الدماغ من الجمجمة وأعلى.
ملاحظة: العائد الجراء P0 P8 اثنين أو ثلاثة يكفي الأنسجة لاطباق 10 سم على الأقل ثمانية من astrocytes القشرية مطلي في الخلايا 500,000 كل طبق اليوم من تشريح. - فصل القشرة عن البنية الأساسية midbrain. ضع الملقط داخل الشق الطولي بين نصفي الكرة الأرضية، ثم حرك الملقط بين الهياكل قشرة و midbrain في نصف الكرة الغربي (متعامد على الشق الطولي) واحد إلى قرصه كل نصف الكرة الأرضية مجاناً.
- استخدام الملقط، إزالة جميع السحايا من كل نصف الكرة الغربي (وعن الحصين)، ثم فصل في هيبوكامبي. إذا كانت مطلوبة astrocytes هيبوكامبال، نقل كل الحصين في أنبوب 15 مل مليئة 14 مل تشريح المتوسطة على الجليد.
- إزالة كذلك المناطق من اللحاء في نصف الكرة الأرضية كل إذا كانت المناطق المحددة المطلوبة (مثلاً، قشرة أمامي). قص أي الأنسجة القشرية لاستخدامها لتوليد أستروسيتيس إلى قطع لا يزيد عن 1 مم3. تجميع كل قطعة من الأنسجة القشرية في أنبوب 15 مل منفصلة مليئة بتشريح المتوسطة على الجليد.
3-الأنسجة الهضم والانفصال
- حالما يتم جمع جميع قطع الأنسجة، الانتظار بالنسبة لهم لتسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوب، ثم نضح متوسطة قدر الإمكان.
- إضافة 2-3 مل من 0.05% التربسين-يدتا استخدام ماصة مصلية، واحتضان هذه الأنابيب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
ملاحظة: إطلاق سراح جميع التربسين-يدتا من ماصة سرعة لخلط قطع الأنسجة وتسمح بتسوية مرة أخرى. - اعقلوها التربسين يدتا، تاركة قطعة النسيج في كسائل قليلاً قدر الإمكان، في الجزء السفلي من الأنبوب بعناية.
- إضافة 5 مل متوسطة تشريح يبرد قبل يغسل التربسين-يدتا المتبقية. "الماصة؛" إلى جانب الجزء العلوي من أنبوب لتحقيق خلط من قطع الأنسجة.
- نضح المتوسطة التشريح، وترك قطع الأنسجة في كسائل صغيرة قدر الإمكان. كرر هذه الخطوة الغسيل مع تشريح يبرد قبل المتوسطة أكثر مرتين.
- بعد هذه الخطوة النهائية الغسيل، إضافة 1 مل من دميم + (تسخينها إلى درجة حرارة الغرفة) باستخدام تلميح ماصة 1,000 ميليلتر، وتريتوراتي الأنسجة التي بيبيتينج وأسفل دون إدخال الفقاعات.
ملاحظة: من المهم تجنب إنتاج فقاعات، كما قد يتغير هذا الرقم الهيدروجيني للحل، الذي astrocytes حساسة جداً. - وضع مصفاة خلية 100 ميكرومتر في افتتاح أنبوب 50 مل والرطب قبل عامل التصفية مع 4.5 مل يبرد قبل دميم +.
- "الماصة؛" 1 مل تعليق الأنسجة منفصلان على مصفاة الخلية وإضافة آخر 4.5 مل يبرد قبل دميم + غسل الخلايا من خلال مصفاة الخلية.
4-خلية الطلاء للإثراء أستروسيتي باساجينج
- حساب عدد الخلايا، مثلاً، بتمييع 10 ميليلتر من تعليق خلية مع 10 ميليلتر تريبان الأزرق وبيبيتينج المزيج على هيموسيتوميتير.
- لوحة 500,000 الخلايا في 12 مل دميم + في صحن 10 سم.
ملاحظة: دميم + مفيد للنمو أستروسيتيك، وأكثر من ذلك للخلايا العصبية أو ميكروجليا. أثناء الهز، القوى المادية كوفيرسليبس الزجاج داخل الآبار أقوى بكثير من تلك التي تعمل على الأطباق 10 سم (بدون كوفيرسليبس). إذا هي تهتز الخلايا على ألواح 24، حسنا، أنها تصبح غير صحية أو يموت. فقط لوحة أستروسيتيس على ألواح 24-جيدا بعد الهز. - تبقى الثقافات الخلية في الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة سبعة أيام.
- في يوم 6، تعد اليوم قبل المصافحة وباساجينج الخلايا، ولوحات الثقافة المغلفة بي كما هو موضح في الخطوة 5.
5-باساجينج الخلايا
-
في اليوم السابق باساجينج، معطف لوحات ثقافة الخلية مع بي 0.04 في المائة.
- إيمونوسيتوتشيميستري، وتوصيل الفيروسية، أو بلازميد تعداء، استخدام لوحات 24-جيدا أو 6-جيدا (كل يحتوي على معقم 12 مم أو 25 مم زجاج ساترة، على التوالي).
- تعقيم كوفيرسليبس الزجاج بالحضانة في الإيثانول 70% على الأقل من ح 1، ثم يغسل ثلاث مرات في الماء المقطر منزوع قبل وضع كوفيرسليبس في الآبار.
- إضافة ميليلتر على الأقل 70 بي 0.04% كل ساترة 12 ملم في لوحات 24-جيدا، وبي 0.04% ميليلتر 600 كل ساترة 25 مم في لوحات 6-جيدا.
- لطخة غربية أو تحليل الحمض النووي الريبي Seq، أطباق 10 سم الفعل تحتوي على الخلايا بعد التشريح الاستمرار في استخدامها. أطباق تحتاج فقط إلى أن تهتز، ثم يتم غسلها مع برنامج تلفزيوني 1 x الخلايا وتعامل مع ملاحظة + H (لا تنقل إلى أطباق جديدة).
- في اليوم في المختبر (DIV) 7 بعد التشريح، ضع الأطباق 10 سم مع الخلايا في دميم + على شاكر مختبر في الحاضنة ويهز الأطباق لفة في الدقيقة 110 ح 6.
- يغسل بي من كوفيرسليبس المغلفة بالماء المقطر ومنزوع مرتين. إضافة ملحوظة + H المتوسطة إلى اللوحات (500 ميليلتر الواحدة وكذلك لوحات 24-جيدا و 2 مل كل بئر للوحات 6-جيدا). قبل حجته اللوحات في الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 بينما تهز الأطباق 10 سم، أو لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- قبل الحارة 20-30 دقيقة قبل نهاية هز ح 6، 1 x برنامج تلفزيوني، دميم +، NB + H، و 0.25% التربسين-أدتا إلى 37 درجة مئوية في حمام الماء.
- بعد الإقلاع أطباق الثقافة شاكر ح 6 من الهز، وفورا استبدال المتوسطة (التي تتضمن اهتزت خارج الخلايا العصبية و oligodendrocytes و microglia) مع 10 مل قبل استعد 1 x PBS كل طبق.
ملاحظة: من المهم فورا نضح المتوسطة القديمة التي تحتوي على خلايا منفصلة لتجنب إعادة إرفاق الخلايا غير أستروسيتيك. - إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 3 مل المعالجون مسبقاً التربسين-يدتا كل طبق. احتضان كل طبق لمدة 4 دقائق في الحضانة عند 37 درجة مئوية و 5% CO2.
ملاحظة: إذا كان إعداد العينات للطخة غربية أو تسلسل الحمض النووي الريبي، لا تقم بإضافة يدتا التربسين. بدلاً من ذلك، استبدال برنامج تلفزيوني مع 12 مل استعد قبل NB + H، بعد ذلك يمكن وضع الثقافات إلى الوراء في الحاضنة. - إضافة 5 مل دميم المعالجون مسبقاً + إلى 3 مل التربسين يدتا في كل طبق "الماصة؛" الخلايا خارج الطبق باستخدام ماصة مصلية 5 مل وجمع تعليق خلية في أنبوب 50 مل.
ملاحظة: ماصة مباشرة من الجزء السفلي من الطبق-الكلمة للطبق ينبغي أن تصبح أكثر وضوحاً كما فصل الخلايا. فقط استخدام المتوسطة المحتوية على مصل (بدلاً من دميم +)، كما يحللها المصل التربسين. - الطرد المركزي بتعليق خلية في 3,220 س ز في 20 درجة مئوية لمدة 4 دقائق.
- إزالة المادة طافية واستعد ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل قبل NB + H.
6-خلية الطلاء للثقافات أستروسيتي النهائي
- عد الخلايا.
- لوحة 20,000 الخلايا كل بئر في لوحات 6-جيدا (في المتوسط NB + ح 2 مل كل بئر) أو الخلايا 5,000 كل بئر في لوحات 24-جيدا (في 500 ميليلتر NB + H المتوسطة الواحدة وكذلك).
- الحفاظ على الثقافات الخلية في الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 حتى تلقي المزيد من العلاج أو التحليل.
- تبادل نصف المتوسط مرة واحدة في أسبوع.
ملاحظة: في بيئات منخفضة في المغذيات، أستروسيتيس وقف تكاثر لكن أي microglia المتبقية سوف تتكاثر (على الرغم من تجربتنا، ظهرت لا microglia في الثقافات أوسام). تبادل نصف المتوسط مرة واحدة أسبوع يمنع الإثراء لأي microglia يحتمل أن تبقى8، والزراعات الأحادية تظل سليمة لمدة ثلاثة أسابيع على الأقل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
النجمية astrocytes مثقف يشترك مع الخلايا العصبية، ونمت في NB + المتوسطة تظهر بعد أسبوعين ثقافة (الشكل 2). بالإضافة إلى ملحوظة + المتوسطة، كما يتعرض astrocytes شارك مثقف للعوامل غير المعروفة المستمدة من الخلايا العصبية التي يرجح أن تساهم في بقائها ومورفولوجيا. وفي المقابل، astrocytes MD نمت في دميم + كالزراعات الأحادية (بعد الهز قبالة أنواع الخلايا الأخرى قبل مرور) تظهر المضلع بعد أسبوعين. أستروسيتيس أوسام التي تزرع في NB + H بعد الهز، تظهر النجمية مع العديد من العمليات الدقيقة بعد أسبوعين ثقافة.
أظهرنا سابقا أن الجيش الملكي النيبالي التعبير astrocytes أوسام أقرب إلى من أستروسيتيس في فيفو بالمقارنة مع MD وإيمونوبانيد أستروسيتيس4. من حيث التعبير البروتين أستروسيتي على حدة، أعرب astrocytes القشرية مستويات عالية من ALDH1L1 ومستويات منخفضة من توصيني في فيفو12. وهذا ينطبق أيضا على أستروسيتيس أوسام، وإيمونوستينينج ALDH1L1، إنزيم هيولى، يكشف عن التفاصيل الدقيقة من البروتين سيتوسكيليتال توصيني (الشكل 2ب).
وبصرف النظر عن تعبير الجيش الملكي النيبالي، والبروتينات، أستروسيتيس في فيفو تظهر عفوية Ca2 + إشارات (أيدون المؤثر الخارجي)، ولكن المضلع MD أستروسيتيس في المختبر غالباً ما تتطلب التحفيز لاستخلاص Ca2 + يشير، مثلاً، عن طريق إضافة ATP أو الغلوتامات. أستروسيتيس أويسام معرض عفوية Ca2 + إشارات في فيفو، في كل من الهيئات الخلية والعمليات الدقيقة التي يمكن تصور بشكل فيروسي ترانسدوسينج الخلايا التي تحتوي غشاء المستهدفة لك-GCaMP3 (الشكل 3). كما تحدث موجات عفوية من Ca2 + في جميع أنحاء أستروسيتيس المجاورة (الشكل 3أ). أستروسيتيك Ca2 + إشارات (الشكل 3ب) في العمليات الدقيقة وميكرودومينس يمكن تحليلها باستخدام مجانية محددة ل astrocytes13.
الشكل 1 : بروتوكول الخط الزمني- مخطط زمني تبين الخطوات الرئيسية لبروتوكول أويسام، بما في ذلك الوقت المستغرق لتنفيذ هذه الخطوات على DIV0 (يوم التشريح)، DIV7 (يوم المرور)، وما يمكن توقعه في نقاط زمنية لاحقة. يوضح المربع الأخضر عند الخلايا يمكن أن تحصد النجمية astrocytes، حيثما كان ذلك أخف مقابل قتامة ظلال تمثل أقل مقابل مورفولوجيا النجمية أكثر تعقيداً والنضج، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : يحدد متوسط مورفولوجيا. التخطيطي (A) تبين كيف مورفولوجيا astrocyte التغييرات عندما شارك مثقف مع الخلايا العصبية (كما هو موضح سابقا4) مقابل نمت كالزراعات الأحادية، واعتماداً على المتوسط. شارك مثقف أستروسيتي الخاصة تلطيخ مع مخططات توصيني مورفولوجية النجمية في أستروسيتيس أوسام، ومورفولوجية المضلع في MD astrocytes. (ب) توصيني تسميات MD astrocytes أكثر بقوة من ALDH1L1، و ALDH1L1 (ولكن لا توصيني) يجمل عمليات غرامة أستروسيتيس أوسام. لا الأحادية astrocyte المعارض علامة العصبية MAP2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : عفوية Ca2 + إشارات في أستروسيتيس- (أ) أوسام ترانسدوسيد جكامب أستروسيتيس المعرض عفوية Ca2 + الأحداث طوال astrocyte الشبكات، بما في ذلك في عمليات رقيقة (رؤوس الأسهم). Ca2 + موجه يسافر من خلال عدة أستروسيتيس من اليسار إلى اليمين في الصور من النقاط الزمنية مميزة، لون الضوء يصور المناطق من Ca2 + تركيزات عالية، حيث تمثل المناطق السوداء المناطق خارج الخلية. الصور تم الحصول عليها باستخدام خلايا حية مجهرية [كنفوكل]. (ب) Ca2 + تركيزات تغيير في مناطق مرمزة في (أ) على مر الزمن، كما هو موضح جكامب fluorescence كثافة آثار توضح كيف Ca2 + إشارات الموجه تنتشر عبر عدة أستروسيتيس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوات الأربع في إطار البروتوكول حرجة: 1) إعداد تركيز هبيجف على وجه التحديد 5 نانوغرام/ملليلتر، حيث يمكن أن تؤدي الزيادات الصغيرة في التركيز للثقافات غير ناضجة، مثلاً، 10 نانوغرام/مل هبيجف سوف يفرق دي astrocytes4؛ 2) تجنب الفقاعات في الحلول التي تحتوي على الأنسجة أو الخلايا التي يمكن تغيير درجة الحموضة وتعرقل astrocyte الصحية؛ 3) اكويليبراتينج من قبل وسائل الإعلام لتحقيق الرقم الهيدروجيني المثلى ودرجة الحرارة لزراعة astrocytes صحية؛ 4) تبادل سوى نصف المتوسط مرة واحدة في أسبوع نظراً لأي microglia المتبقية أقل من المحتمل أن تنتشر عند المواد المغذية الكافية موجودة والوسيلة تبادل بانتظام8 (على الرغم من أن تم العثور على لا ميكروجليا في الثقافات أوسام حتى الآن). لهذه النقطة الأخيرة، من المهم أن نلاحظ أن العوامل المشتقة من أستروسيتي داخل الثقافة لا يجب إزالة تماما، كما أنها قد تدعم بقاء أستروسيتيك والتمايز، وانتشار.
من المهم استخدام DIV14 أو الثقافات القديمة كمصدر astrocyte ناضجة (ولكن يمكن استخدامها لخطوات توصيل أو تعداء، الثقافات السابقة) لأنه لا يزال لدى astrocytes أصغر سنا من DIV14 الخلايا الجذعية العصبية المحتملة9. لتوصيل الفيروسية، مختلطة الثقافات من الخلايا العصبية وأستروسيتيس ترانسدوسيد في DIV7 (باستخدام الفيروسات المرتبطة بالغدد) التعبير عن كفاءة فيروسي ترانسدوسيد التجارة والنقل10. وغالباً ما تستخدم بلازميد تعداء، أستروسيتيس DIV10-DIV24 والبروتينات معلم fluorophore تصويرها 2-5 أيام بعد11. في تجربتنا، توصيل الفيروسية وتعداء بلازميد تعمل بشكل أفضل إذا هي ترانسدوسيد أستروسيتيس بين DIV9 و DIV14. كفاءة تعداء وتوصيل تعتمد على التركيب والأسلوب، ولكن نجد أن الكفاءة تعداء ~ 20% في الزراعات الأحادية astrocyte استخدام تعداء ليبوفيكتاميني، وهو كفاءة توصيل الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف) (~ 90% انظر لدينا العمل السابقة4 لمزيد من التفاصيل، مثلاً، بناء المستخدمة). عندما ترانسدوسينج أستروسيتيس مع جزيئات إف وترانسفيكتينج ليبوفيكتاميني، يسمح لنا على الأقل 5 و 2 يوما، على التوالي، للتعبير عن بنية. قبل توصيل أو تعداء، ينبغي أيضا السماح astrocytes استرداد ليوم واحد على الأقل بعد باساجينج.
وعلاوة على ذلك، عند إعداد الثقافات لمقارنة الحمض النووي الريبي/البروتين التعبير في وقت مختلف النقاط، الثقافات يمكن أن يكون مطلي بكثافات مختلفة لتحقيق كميات مماثلة من المواد، مثلاً، والزراعات الأحادية أستروسيتي أن تحصد في DIV7 ويمكن أن يكون DIV21 مطلي في كثافة 1 × 106 وخلايا 500,000 كل طبق 10 سم، على التوالي. على سبيل المثال، سوف يكون العائد ليستي البروتين كله حول 0.5 ملغ/مل في DIV14 عند حصادها بعد تصفيح 500,000 astrocytes أوسام على طبق 10 سم في البداية.
ويمثل البروتوكول أوسام بطريقة سريعة وبسيطة وغير مكلفة للثقافة أستروسيتيس في عزلة من الخلايا العصبية ولكن مع فيفو-مثل خصائص الحمض النووي الريبي والتعبير البروتين ومورفولوجيا و Ca2 + إشارات4، التي حتى الآن يتم توفيرها من قبل لا بروتوكول آخر. يمكن استخدام أستروسيتيس أوسام للتحليلات التي تعتبر نموذجية لدراسات ثقافة الخلية، بما في ذلك إيمونوسيتوتشيميستري، إيمونوبلوتينج وتحليل الحمض النووي الريبي التعبير، TIRF المجهري و Ca2 + التصوير4. على وجه الخصوص، التقدم الذي أحرز مؤخرا في ترميز وراثيا Ca2 + مؤشرات تسمح بتصور العمليات أستروسيتيك غرامة بتفصيل أكبر من الكلاسيكية Ca2 + صبغات14. Ca2 + إشارات وامتصاص حويصلية والرقابة في عمليات أستروسيتيك سميكة ورقيقة على حد سواء الناحية الفسيولوجية ذات الصلة، كما أن هذه العمليات يمكن أن تؤثر على وظيفة المخ من حيث الدعم الغذائي وتدفق الدم، مما يشير إلى متشابك واللدونه، و الاتصالات بين الخلايا. بروتوكول أوسام يسمح لدراسة العمليات أستروسيتيك غرامة ذات الصلة للدماغ فسيولوجيا15 والمرض16،17، دون تدخل الخلايا العصبية ومع إمكانية كبيرة هذا المختبر لوازم الثقافة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نعترف بتمويل من مجلس البحوث الأوروبي (FP7/260916) وألكسندر فون همبولت-ستيفتونغ (سوفجا كوفاليفسكاجا) والألمانية الأوقيانوغرافية (DE1951 و SFB889).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | warm in 37 ºC waterbath before use |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | warm in 37 ºC waterbath before use |
| B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | 50X stock |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 100X stock |
| Penicillin / streptomycin | Gibco | 15070-063 | 50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 µg/ml |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | without L-glutamine |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| HBEGF | Sigma | 4643 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HBSS | Gibco | 14170112 | |
| FCS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | 1X |
| 100 μm nylon cell strainer | BD | 352360 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Hera Cell 240i cell culture incubator | |
| Laboratory shaker | Heidolph | Rotamax 120 | use inside cell culture incubator |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R |
References
- Puschmann, T. B., et al. Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells. Glia. 61 (3), 432-440 (2013).
- Puschmann, T. B., et al. HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins. J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Wolfes, A. C., et al. A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes. J Gen Physiol. 149 (4), (2016).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
- Krencik, R., Zhang, S. -C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).
- Morita, M., et al. Dual regulation of calcium oscillation in astrocytes by growth factors and pro-inflammatory cytokines via the mitogen-activated protein kinase cascade. J Neurosci. 23 (34), 10944-10952 (2003).
- Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).
- Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55 (2), 165-177 (2007).
- Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Res. 1190, 15-22 (2008).
- Malarkey, E. B., Parpura, V. Temporal characteristics of vesicular fusion in astrocytes: examination of synaptobrevin 2-laden vesicles at single vesicle resolution. J Physiol. 589, Pt 17 4271-4300 (2011).
- Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. J Neurosci. 2 (18), 6391-6410 (2012).
- Srinivasan, R., et al. Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).
- Shigetomi, E., et al. Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses. J Gen Physiol. 141 (5), 633-647 (2013).
- Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Otsu, Y., et al. Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling. Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).
- Agarwal, A., et al. Transient Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Induces Microdomain Calcium Transients in Astrocyte Processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).
