Summary
AWESAM protokollen beskrevet her er optimal for dyrkning murine astrocytter isoleret fra andre hjerneceller i en hurtig, enkel og billig måde. AWESAM astrocytter udstille spontan Ca2 + signalering, morfologi og gen expression profiler ligner astrocytes i vivo.
Abstract
AWESAM (en low-koste easy stellate enstrocyte method) protokollen indebærer en hurtig, enkel og billig måde at generere store mængder af in vivo-som mus og rotter astrocyte monokulturer : Hjerne celler kan isoleres fra forskellige hjerneregioner, og efter en uge med cellekultur, ikke-astrocytic celler er rystet ved at placere kultur retter på en shaker til 6 h i rugemaskinen. De resterende astrocytter er derefter passaged til nye plader med en astrocyte-specifikke medium (betegnes NB + H). NB + H indeholder lave koncentrationer af heparin-binding EGF-lignende vækst faktor (HBEGF), som bruges i stedet for serum i medium. Efter voksende i NB + H, har AWESAM astrocytter en Stjernehus morfologi og funktion fine processer. Disse astrocytter har desuden mere i vivo-indkvartering genekspression end astrocytter genereret af tidligere udgivne metoder. Ca2 + imaging, vesikel dynamics og andre begivenheder tæt på membranen kan således studeres i fine astrocytic processer i vitro, fxved hjælp af levende celle Konfokal eller JOHANNAS mikroskopi. Især, udstille AWESAM astrocytter også spontan Ca2 + signalering ligner astrocytes i vivo.
Introduction
Astrocytter påvirke hjernefunktion gennem trofiske støtte, blodgennemstrømning, synaptic signalering og plasticitet og intercellulær kommunikation - alle er mekanismer, at centrum omkring de tynde astrocytic processer. AWESAM protokollen beskrevet her giver mulighed for undersøgelse af disse processer uden indblanding fra neuroner og andre glia, som er nyttige f.eks., fordi udtryk for mange proteiner og endda Ca2 + signalering overlapper hinanden på tværs af forskellige hjerne celle typer. Yderligere, denne metode overvinder begrænsningerne af tidligere tilgængelige teknikker. Især vores protokol giver i vivo-som morfologi (Stjernehus astrocytter med tynde processer) og genekspression i en hurtig, let og billig måde.
Celle morfologi, Gen-ekspression, og mange andre lovgivningsprocesser er direkte påvirket af miljøet. I en kultur parabol refererer dette til faktorer udgivet af omkringliggende celler, men også det medium, hvori cellerne er vokset. Astrocytter, HBEGF var tidligere rapporteret at fremkalde en Stjernehus morfologi1 men fandtes også at de differentiere astrocytter2. Dog lavere koncentrationer af HBEGF blev senere brugt til at generere mere i vivo-ligesom astrocytter, identificeret via RNA sequencing i to forskellige protokoller3,4. Desuden astrocyte morfologi ændres med medium sammensætning, uanset protokol4: Neurobasal medium med en lav koncentration af HBEGF er optimal for voksende Stjernehus astrocytter, mens andre mellemstore kompositioner (f.eks., serum-holdige DMEM) producerer polygonal celler (selv i astrocytter frisk isoleret af immunopanning).
AWESAM protokol overvinder ulemper af tidligere teknikker til dyrkning astrocyte monokulturer4. Tidligere teknikker til dyrkning astrocyte monokulturer har følgende ulemper: polygonal morfologi, som er ukarakteristisk Stjernehus astrocytter i vivo (MD metode)5; længde og udgifterne til protokollen (forberede astrocytter fra inducerede pluripotente stamceller tager tre måneder og kræver mange reagenser, herunder dyre vækstfaktorer)6; de lave mængder af materiale (immunopanning metode)3; og nedtrapning differentiering af astrocytter og kravet om en 3D matrix (Puschmann mfl.) 1 , 2. derimod AWESAM-protokollen giver: i vivo-indkvartering morfologi (Stjernehus astrocytter med tynde processer); en hurtig, nem, og billig metode; store mængder af materiale; og mest i vivo-indkvartering genekspression sammenlignet med immunopanned og MD astrocytter. Derudover 2D kultur giver mulighed for undersøgelse af Ca2 + signalering og vesikel genanvendelse i tynde processer og begivenheder tæt på membranen (fxJOHANNAS mikroskopi er ikke muligt i 3D kulturer).
Metoden MD har været flittigt brugt siden offentliggørelsen i 19805, tilbyder en enkel og hurtig teknik til polygonal astrocyte monokulturer. Kort sagt, MD metode indebærer voksende blandet hjerneceller i føtalt kalveserum (FCS)-indeholdende DMEM, efterfulgt af omrystning trin, berige for astrocytter (som alle andre hjerne celle typer løsnes fra fadet) og yderligere kultur i samme medium. DMEM suppleres med FCS bruges til mange andre celletyper, lige fra fibroblaster og adipocytter til forskellige kræft cellelinjer, som alle deler polygonal morfologi udstillet af MD astrocytter i kultur. Indtil den tidlige 2000s7, lille tanke havde været givet til medierne skræddersyet til astrocytter, specielt til at favorisere deres typiske Stjernehus morfologi fundet in vivo. En protokol udgivet i 2011 opnå sådanne Stjernehus morfologi: kaldte metoden immunopanning, den beskæftiger serumfrit medium optimeret til dyrkning astrocytter3. Brug denne metode, er frisk isolerede hjerneceller udsat for en række retter belagt med antistoffer, der er målrettet celle typespecifikke celle overflade proteiner, at berige for astrocytter. Trods de mere i vivo-ligesom morfologi og udtryk profil af immunopanned astrocytter, flertallet af in vitro- undersøgelser stadig stole på metoden MD astrocyte. MD-metoden er enkel og hurtig, mens immunopanning metoden består mere kompliceret og tidskrævende trin på den første dag i kultur (såsom længere enzym fordøjelsen perioder, omhyggelig lagdeling af løsninger af forskellig densitet, immunopanning, sig selv, og flere centrifugering trin - alle før plating). Men ved hjælp af mere specialiserede medium, metoden AWESAM tilbyder både hastigheden af metoden MD og i vivo-indkvartering morfologi af immunopanning-protokollen.
Samlet set AWESAM protokol er nyttigt for at studere mere i vivo-indkvartering astrocytter i 2D monokulturer isoleret fra neuroner og andre glia (som tidligere karakteriseret4 af immunostainings, immunoblots og RNA sekventering). Det giver mulighed for undersøgelse af tynde astrocytic processer, og giver stor tilgængelighed til at visualisere spontan Ca2 + signalering og begivenheder tæt på membran (fxafbildet af JOHANNAS mikroskopi).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg beskrevet her blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for tyske dyrevelfærd.
Bemærk: Tidslinje og vigtigste trin i protokollen er illustreret i figur 1.
1. præparater
-
Forberede følgende løsninger.
- Forberede DMEM + dyrkning polygonal MD astrocytter: DMEM med 10% FCS, 100 U penicillin og 100 µg/mL streptomycin.
- Forberede NB + H dyrkning Stjernehus astrocytter: neurobasal medium med 5 ng/mL HBEGF, 1 x B-27 supplement, 1 x Glutamin supplement, 100 U penicillin og 100 µg/mL streptomycin.
Bemærk: Delprøver af højere koncentrationer af HBEGF kan tilberedes og opbevares ved-20 ° C skal føjes til medium når nødvendigt. - Forberede dissektion medium (10 mM HEPES i HBSS).
- Forberede delprøver af 6-7 mL 0,05% trypsin-EDTA og 6-7 mL 0,25% trypsin-EDTA i 15 mL rør. Disse kan opbevares ved-20 ° C og optøet i et 37 ° C vandbad.
- Dagen før start af protokollen, pels 10 cm vævskultur-behandlede retter med 5 mL af 0,04% polyethylenimine (PEI) hver.
- Den næste dag, fjerne PEI og vaske op med deioniseret vand, destilleret vand to gange. 12 mL DMEM + tilsættes til hver plade og pre reagensglasset i varmeskab ved 37 ° C og 5% CO2 til mindst 30 min før plating celler.
- Forberede området dissektion: I en laminar flow dissektion hætte, sted to 10 cm petriskåle fyldt med dissektion medium på is. For hver hjerne område at være isoleret (fx, cortex, hippocampus), forberede en 15-rør fyldt med 14 mL dissektion medium og holde på is. Spray dissektion værktøjer (fine saks, Dumont #3 og #5 pincet) med 70% ethanol og sted ved siden af dissektion mikroskop i hætten.
2. rotte eller mus hjernen dissektion
Bemærk: Både mus og rotter kan bruges. Dyr, der er ældre end P8 kan også anvendes (vi testet op til P12), men at fjerne meninges vil blive stadig vanskeligere. Yderligere, celle udbytte og sundhed vil mindske, da hjerneceller fra ældre dyr vil have dannet indviklede processer og forbindelser, der kan bryde under væv dissociation, fører til øget celledød. Kortikale præparater er beskrevet her, men andre områder af hjernen kan også bruges.
- Placer 0,05% trypsin-EDTA i et 37 ° C vandbad.
- Aflive dyr (gravide rotter E19 unger eller P0-P8 dyr) ved langsomt at hæve CO2 koncentration, og isolere hjernen. De følgende trin kræver steril teknik.
-
Hvis arbejdet med embryonale væv, først fjerne embryoner fra livmoderen og åbne de embryonale sække, derefter straks afbrød hovedet med en saks. Når alle hoveder er afskåret, overføre dem til pre afkølede dissektion medium.
- Når hovedet er nedsænket i mediet, skal du åbne huden og kraniet (begge er meget bløde i unge dyr) med pincet og knivspids off lillehjernen. Omhyggeligt armen resten af hjernen op og ud af kraniet.
Bemærk: To til fire E19 embryoner udbytte nok væv for mindst otte 10 cm retter af kortikale astrocytter belagt på 500.000 celler pr. parabol på dagen for dissektion.
- Når hovedet er nedsænket i mediet, skal du åbne huden og kraniet (begge er meget bløde i unge dyr) med pincet og knivspids off lillehjernen. Omhyggeligt armen resten af hjernen op og ud af kraniet.
- Til nyfødte eller ældre unger, afbrød hovedet med saks og isolere hjernen af medialt skære huden i en lige linje fra bagsiden af hovedet på spidsen af næsen. Træk huden til side og omhyggeligt skæres kraniet venstre og højre, derefter lift kraniet knogle op. Afbrød lillehjernen, og håndtaget resten af hjernen op og ud af kraniet.
Bemærk: To til tre P0-P8 pups udbytte nok væv for mindst otte 10 cm retter af kortikale astrocytter belagt på 500.000 celler pr. parabol på dagen for dissektion. - Adskille cortex fra den underliggende struktur er midthjernen. Placer pincet i det langsgående revne mellem halvkugler, derefter flytte pincet i mellem cortex og midthjernen strukturer af en halvkugle (vinkelret på en langsgående revne) til knivspids hver halvkugle gratis.
- Brug af pincet, fjerne alle meninges fra hver halvkugle (og dens hippocampus), så adskille hippocampi. Hvis hippocampus astrocytter er nødvendige, skal du flytte hvert hippocampus ind i en 15 mL rør fyldt med 14 mL dissektion medium på is.
- Fjerne yderligere områder fra hver halvkugle cortex, hvis bestemte regioner er påkrævet (f.eks.-frontale cortex). Skære alle kortikale væv skal bruges til at generere astrocytter i stykker ikke større end 1 mm3. Indsamle alle stykker af kortikale væv i en separat 15 mL rør fyldt med dissektion medium på is.
3. Vævscentre fordøjelse og Dissociation
- Når alle væv stykker er indsamlet, vente for dem at slå sig ned til bunden af røret, så Aspirér så meget medium som muligt.
- Tilføje 2-3 mL 0,05% trypsin-EDTA ved hjælp af en serologisk pipette, og Inkuber rør i et 37 ° C vandbad i 20 min.
Bemærk: Frigive alle trypsin-EDTA fra pipette hurtigt at blande væv stykker og giver mulighed for at bosætte sig igen. - Omhyggeligt Aspirér trypsin-EDTA, forlader væv stykker i som lille væske som muligt, i bunden af røret.
- Der tilsættes 5 mL af pre afkølede dissektion medium til at vaske den resterende trypsin-EDTA. Med pipette overfoeres til siden af den øverste del af røret at opnå blanding af væv stykker.
- Opsug dissektion medium, og forlade væv stykker i som lille væske som muligt. Gentag trinnet vask med pre afkølede dissektion medium to gange mere.
- Efter den sidste vask skridt, der tilsættes 1 mL af DMEM + (opvarmet til stuetemperatur) ved hjælp af en 1.000 µL pipette tip, og triturate væv af pipettering op og ned uden at indføre bobler.
Bemærk: Det er vigtigt at undgå at producere bobler, som dette kan ændre pH af løsningen, som astrocytter er nok så nærtagende. - Placer en 100 µm celle si i åbningen af en 50 mL tube og pre våd filter med 4,5 mL pre afkølede DMEM +.
- Afpipetteres 1 mL af dissocierede væv suspension på celle sien og tilføje en anden 4,5 mL pre afkølet DMEM + at vaske cellerne gennem celle si.
4. celle Plating for Astrocyte berigelse af Passaging
- Tælle celler, fxved at fortynde 10 µL af cellesuspension med 10 µL trypan blå og pipettering blanding på en hemocytometer.
- Plade 500.000 celler i 12 mL DMEM + pr. 10 cm parabol.
Bemærk: DMEM + er nyttigt for astrocytic vækst, så mere end for neuroner eller mikroglia. Under omrystning er de fysiske kræfter, der handler på glas coverslips i brønde langt stærkere end dem, der handler på 10 cm retter (uden coverslips). Hvis celler er rystet på 24-godt plader, de bliver usund eller dø. Kun plade astrocytter på 24-godt plader efter omrystning. - Holde cellekulturer i inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i syv dage.
- Dag 6, forberede dagen før ryster og passaging celler, PEI-belagt kultur plader som beskrevet i trin 5.
5. passaging celler
-
Dagen før passaging, pels celle kultur plader med 0,04% PEI.
- Immuncytokemi, viral transduktion eller plasmid Transfektion, bruge 24-godt eller 6-godt plader (hver indeholdende en steriliseret 12 mm 25 mm glas coverslip, henholdsvis).
- Sterilisere glas coverslips ved inkubering i 70% ethanol i mindst 1 time og derefter vaskes tre gange i deioniseret vand, destilleret vand før du placerer coverslips i brøndene.
- Tilføj mindst 70 µL 0,04% PEI pr. 12-mm coverslip i 24-godt plader og 600 µL 0,04% PEI pr. 25 mm coverslip i 6-godt plader.
- For vestlige skamplet eller RNA-Seq analyse, 10 cm retter allerede med cellerne efter dissektion fortsat kan anvendes. Retter behøver kun at blive rystet, derefter cellerne vaskes med 1 x PBS og behandlet med NB + H (ikke overføre til nye retter).
- På dagen i vitro (DIV) 7 efter dissektion, placere 10-cm retter med celler i DMEM + på et laboratorium shaker i rugemaskinen og ryste retter på 110 rpm til 6 h.
- Vaske af PEI fra coated coverslips med deioniseret vand, destilleret vand to gange. Tilføje NB + H medium til plader (500 µL pr. brønd for 24-godt plader og 2 mL pr. brønd for 6-godt plader). Pre reagensglasset plader i varmeskab ved 37 ° C og 5% CO2 mens 10 cm retter ryster, eller i mindst 30 min.
- 20-30 min før slutningen af det 6 h ryster, varm pre 1 x PBS, DMEM +, NB + H og 0,25% trypsin-EDTA til 37 ° C i vandbad.
- Efter 6 h af rysten, tage kultur retter shaker og straks erstatte det medium, (der indeholder rystet-off neuroner, oligodendrocytes, og mikroglia) med 10 mL varmede pre 1 x PBS pr parabol.
Bemærk: Det er vigtigt at straks Opsug den gamle medium med fritliggende celler for at undgå ikke-astrocytic cellerne igen montering. - Fjern PBS og tilsæt 3 mL pre varmede trypsin-EDTA pr. fad. Inkuber hvert fad i 4 min i varmeskab ved 37 ° C og 5% CO2.
Bemærk: Hvis forbereder prøver vestlige skamplet eller RNA-FF., Tilføj ikke trypsin-EDTA. I stedet varmede Erstat PBS med 12 mL pre NB + H, hvorefter kulturer kan placeres tilbage i inkubatoren. - Der tilsættes 5 mL pre varmede DMEM + til 3 mL trypsin-EDTA i hvert fad, afpipetteres celler fra skålen med 5 mL serologisk pipette og indsamle cellesuspension i en 50 mL tube.
Bemærk: Pipette direkte fra bunden af skålen - bør gulvet i skålen bliver klarere, som cellerne frigøre. Kun bruge serum-holdige medium (i stedet for DMEM +), som serum inaktiverer trypsin. - Der centrifugeres cellesuspension ved 3,220 x g ved 20 ° C i 4 min.
- Fjern supernatanten og resuspend celle pellet i 1 mL pre varmes NB + H.
6. celle Plating for endelige Astrocyte kulturer
- Tælle cellerne.
- Plade 20.000 celler pr. brønd i 6-godt plader (i 2 mL NB + H medium pr. brønd) eller 5.000 celler pr. brønd i 24-godt plader (i 500 µL NB + H medium pr. brønd).
- Holde cellekulturer i inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 indtil videre behandling eller analyse.
- Udveksle halve medium en gang om ugen.
Bemærk: I lav-næringsstof miljøer, astrocytter stoppe prolifererende men enhver resterende mikroglia vil formere sig (selv om vores erfaring, ingen mikroglia dukkede op i AWESAM kulturer). Udveksle halve medium, når ugen forhindrer berigelse af ethvert potentielt resterende mikroglia8, og monokulturer forblive sunde i mindst tre uger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Astrocytter, der er co kulturperler med neuroner og dyrket i NB + medium vises Stjernehus efter 2 uger af kulturen (figur 2). Ud over NB + medium, er co kulturperler astrocytter også udsat for ukendte neuron-afledte faktorer, der sandsynligvis bidrager til deres overlevelse og morfologi. Derimod vises MD astrocytter dyrkes i DMEM + som monokulturer (efter ryster andre celletyper før passage) polygonal efter 2 uger. AWESAM astrocytter vokset i NB + H efter omrystning, vises Stjernehus med mange fine processer efter 2 uger af kultur.
Tidligere viste vi, at RNA udtryk profil AWESAM astrocytter er tættere på astrocytter i vivo i forhold til MD og immunopanned astrocytter4. Med hensyn til astrocyte-specifikke protein udtryk udtrykker kortikale astrocytter høje niveauer af ALDH1L1 og lave niveauer af GFAP i vivo12. Dette gælder også for AWESAM astrocytter, og immunfarvning af ALDH1L1, som et cytoplasmatisk enzym, afslører finere detaljer end de cytoskeletal proteiner GFAP (figur 2B).
Bortset fra RNA og protein udtrykket, astrocytter i vivo Vis spontan Ca2 + signalering (dvs.uden eksterne stimulation), men polygonal MD astrocytter in vitro- kræver ofte stimulation til at fremkalde Ca2 + signalering, fxved at tilføje ATP eller glutamat. AWESAM astrocytter udstille spontan Ca2 + signalering i vivo, i både celle organer og fine processer, som kan visualiseres ved viralt transducing celler med den membran-målrettet Lck-GCaMP3 (figur 3). Spontan bølger af Ca2 + gennem hele tilstødende astrocytter også forekomme (fig. 3A). Astrocytic Ca2 + signalering (fig. 3B) i fine processer og microdomains kan analyseres ved hjælp af freeware specifikke astrocytter13.
Figur 1 : Protokol tidslinjen. En tidslinje, der viser de vigtigste trin i AWESAM protokol, herunder den tid det tager for at udføre disse trin på DIV0 (dag af dissektion), DIV7 (dag af passage), og hvad de kan forvente på senere tidspunkter. Det grønne felt illustrerer når celler kan høstes som Stjernehus astrocytter, hvor lysere versus mørkere nuancer repræsenterer mindre versus mere komplekse Stjernehus morfologi og modenhed, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Medium bestemmer morfologi. (A) skematisk viser hvordan astrocyte morfologi ændrer sig, når Co kulturperler med neuroner (som tidligere beskrevet4) vs dyrket som monokulturer, og afhængigt af mediet. Astrocyte-specifik farvning med GFAP skitserer Stjernehus morfologi i co kulturperler og AWESAM astrocytter, og polygonal morfologi i MD astrocytter. (B) GFAP etiketter MD astrocytter kraftigere end ALDH1L1, og ALDH1L1 (men ikke GFAP) skitserer de fine processer af AWESAM astrocytter. Hverken astrocyte monokultur udstiller den neuronale markør MAP2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Spontan Ca2 + signalering i astrocytter. (A) GCaMP-transduced AWESAM astrocytter udstille spontan Ca2 + -begivenheder i hele astrocyte netværk, herunder i de tynde processer (pilespidser). En Ca2 + bølge rejser gennem flere astrocytter fra venstre til højre i billeder fra forskellige tidspunkter, hvor lys farve skildrer områder af høj Ca2 + koncentrationer, og sorte områder repræsenterer ekstracellulære regioner. Billeder blev erhvervet ved hjælp af levende celle Konfokal mikroskopi. (B) Ca2 + koncentrationer ændre i de farvekodede områder i (A) over tid, vist som GCaMP fluorescens intensitet spor, der illustrerer, hvordan en Ca2 + signalering bølge spreder på tværs af flere astrocytter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fire trin i protokollen er kritisk: 1) forberede HBEGF koncentration til netop 5 ng/mL, da små stigninger i koncentrationen kan føre til umodne kulturer, fx10 ng/mL HBEGF vil de differentiere astrocytter4; 2) undgå boblerne i de løsninger, som indeholder væv eller celler, som kan ændre pH og hindrer astrocyte sundhed; 3) pre-equilibrating medier til at opnå den optimale pH og temperatur til at dyrke sunde astrocytter; 4) udveksler kun halv medium en gang om ugen fordi enhver resterende mikroglia er mindre tilbøjelige til at formere sig når tilstrækkelige næringsstoffer er til stede og mediet er udveksles regelmæssigt8 (selvom ingen mikroglia blev fundet i AWESAM kulturer hidtil). For dette sidste punkt er det vigtigt at bemærke, at astrocyte-afledte faktorer inden for kultur ikke bør være helt fjernet, som de kan støtte astrocytic overlevelse, differentiering og spredning.
Det er vigtigt at bruge DIV14 eller ældre kulturer som den modne astrocyte kilde (men transduktion eller Transfektion trin, tidligere kulturer kan bruges) fordi astrocytter yngre end DIV14 har stadig neurale stamceller potentielle9. For viral transduktion, blandede kulturer af neuroner og astrocytter transduced på DIV7 (ved hjælp af adeno-associeret virus) effektivt express viralt transduced normal god landbrugspraksis10. For plasmid Transfektion, DIV10-DIV24 astrocytter bruges ofte og fluorophore-mærkede protein afbildet 2-5 dage senere11. Vores erfaring fungerer både virale transduktion og plasmid Transfektion bedst hvis astrocytter er transduced mellem DIV9 og DIV14. Transfektion og transduktion effektivitet afhænger af konstruktion og metode, men vi finder at Transfektion effektivitet er ~ 20% i astrocyte monokulturer ved hjælp af lipofectamine Transfektion, og adeno-associeret virus (AAV) transduktion effektivitet er () ~ 90% Se vores tidligere arbejde4 for yderligere detaljer, fx, konstruere bruges). Når transducing astrocytter med AAV partikler og transfecting af lipofectamine, tillod vi mindst 5 og 2 dage, henholdsvis for udtryk for konstruktionen. Før transduktion eller Transfektion, bør astrocytter også tillades at genvinde til mindst én dag efter passaging.
Desuden, når forbereder kulturer for at sammenligne RNA/protein udtryk på andet tidspunkt peger, kulturer kan være forgyldt ved forskellige tætheder at opnå tilsvarende mængder af materiale, fx, astrocyte monokulturer høstes på DIV7 og DIV21 kan være forgyldt ved tætheder af 1 x 106 og 500.000 celler pr. 10 cm parabol, henholdsvis. For eksempel, vil hele protein lysate udbyttet være omkring 0,5 mg/mL på DIV14 når høstet efter i første omgang plating 500.000 AWESAM astrocytter på en 10-cm parabol.
AWESAM protokol repræsenterer en hurtig, enkel og billig måde at kultur astrocytter isoleret fra neuroner men med in vivo-som egenskaber af RNA og protein udtryk, morfologi og Ca2 + signalering4, som hidtil tilbydes af nogen anden protokol. AWESAM astrocytter kan anvendes til analyser, der er typiske for celle kultur studier, herunder immuncytokemi, immunoblotting, RNA udtryk analyse, JOHANNAS mikroskopi og Ca2 + imaging4. Især de seneste fremskridt i genetisk kodet Ca2 + indikatorer giver mulighed for visualisering fine astrocytic processer mere detaljeret end klassisk Ca2 + farvestoffer14. Ca2 + signalering, vesikulær optagelse og exocytose i både tykke og tynde astrocytic processer er fysiologisk relevante, som disse processer kan påvirke hjernefunktion trofiske støtte, blodgennemstrømning, synaptic signalering og plasticitet, og intercellulær kommunikation. AWESAM protokollen tillader for studiet af de fine astrocytic processer relevante for hjernens fysiologi15 og sygdom16,17, uden neuronale forstyrrelser og med stor tilgængelighed, in vitro kultur forsyninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi anerkender støtte fra Det Europæiske Forskningsråd (FP7/260916), Alexander von Humboldt-Stiftung (Sofja Kovalevskaja) og Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE1951 og SFB889).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | warm in 37 ºC waterbath before use |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | warm in 37 ºC waterbath before use |
| B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | 50X stock |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 100X stock |
| Penicillin / streptomycin | Gibco | 15070-063 | 50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 µg/ml |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | without L-glutamine |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| HBEGF | Sigma | 4643 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HBSS | Gibco | 14170112 | |
| FCS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | 1X |
| 100 μm nylon cell strainer | BD | 352360 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Hera Cell 240i cell culture incubator | |
| Laboratory shaker | Heidolph | Rotamax 120 | use inside cell culture incubator |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R |
References
- Puschmann, T. B., et al. Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells. Glia. 61 (3), 432-440 (2013).
- Puschmann, T. B., et al. HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins. J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Wolfes, A. C., et al. A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes. J Gen Physiol. 149 (4), (2016).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
- Krencik, R., Zhang, S. -C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).
- Morita, M., et al. Dual regulation of calcium oscillation in astrocytes by growth factors and pro-inflammatory cytokines via the mitogen-activated protein kinase cascade. J Neurosci. 23 (34), 10944-10952 (2003).
- Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).
- Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55 (2), 165-177 (2007).
- Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Res. 1190, 15-22 (2008).
- Malarkey, E. B., Parpura, V. Temporal characteristics of vesicular fusion in astrocytes: examination of synaptobrevin 2-laden vesicles at single vesicle resolution. J Physiol. 589, Pt 17 4271-4300 (2011).
- Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. J Neurosci. 2 (18), 6391-6410 (2012).
- Srinivasan, R., et al. Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).
- Shigetomi, E., et al. Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses. J Gen Physiol. 141 (5), 633-647 (2013).
- Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Otsu, Y., et al. Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling. Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).
- Agarwal, A., et al. Transient Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Induces Microdomain Calcium Transients in Astrocyte Processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).
