Summary
Det AWESAM-protokollet som beskrivs här är optimal för odling murina astrocyter i isolering från andra hjärnceller på ett snabbt, enkelt och billigt sätt. AWESAM astrocyter uppvisar spontana Ca2 + signalering, morfologi och gen uttryck profiler liknar astrocyter i vivo.
Abstract
AWESAM (en low-kosta easy stellate enstrocyte metod) protokollet medför en snabb, enkel och billig sätt att generera stora mängder i vivo-gillar mus och råtta Astrocyten monokulturer : Hjärnceller kan isoleras från olika hjärnregioner, och efter en vecka av cellodling, icke-astrocytic celler skakas genom att placera de kultur-rätterna på en shaker för 6 h i inkubatorn. Återstående astrocyterna är sedan överförda i nya plattor med en Astrocyten-specifika medium (kallas NB + H). NB + H innehåller låga halter av heparin-bindande EGF-liknande tillväxtfaktor (HBEGF), som används i stället för serum i medium. Efter växer i NB + H, har AWESAM astrocyter en stjärnformade morfologi och funktion fina processer. Dessutom dessa astrocyter har mer in-vivo-gillar genuttryck än astrocyter som genereras av tidigare publicerade metoder. Ca2 + imaging, vesikler dynamics och andra händelser nära membranet kan därmed studeras i fina astrocytic processer i vitro, t.ex., använder levande cell confocal eller Frida mikroskopi. Särskilt uppvisar AWESAM astrocyter också spontana Ca2 + signalering liknar astrocyter i vivo.
Introduction
Astrocyter påverka hjärnans funktion genom trofiska stöd, blodflödet, synaptisk signalering och plasticitet och kommunikationen - som alla är mekanismer som center runt tunn astrocytic processerna. AWESAM protokollet beskrivs här tillåter att studera dessa processer utan inblandning från nervceller och andra glia, vilket är användbart t.ex., eftersom uttrycket av många proteiner och även Ca2 + signalering överlappar över olika hjärncell typer. Ytterligare, denna metod övervinner begränsningar av tidigare tillgängliga teknik. I synnerhet våra protokoll ger in-vivo-gillar morfologi (stjärnformade astrocyter med tunn processer) och genuttryck i en snabb, lätt och billigt sätt.
Cellmorfologi, genuttryck och många andra tillsynsprocesser påverkas direkt av miljön. I en kultur maträtt avser faktorer som släpptes av omgivande celler, men också det medium där cellerna odlas. För astrocyter, HBEGF var tidigare rapporterats inducera en stjärnformade morfologi1 men konstaterades också att de skilja astrocyter2. Dock lägre koncentrationer av HBEGF användes senare för att generera mer i vivo-gillar astrocyter som identifierats via RNA-sekvensering i två olika protokoll3,4. Dessutom Astrocyten morfologi ändras med medellång sammansättning, oavsett protokoll4: Neurobasal medium med en låg koncentration av HBEGF är optimal för växande stjärnformade astrocyter, medan andra medelstora kompositioner (t.ex., serum som innehåller DMEM) producera månghörniga celler (även i astrocyterna nymalen isolerat av immunopanning).
Protokollet AWESAM övervinner nackdelarna med tidigare tekniker för växande Astrocyten monokulturer4. Tidigare metoder för odling Astrocyten monokulturer har följande nackdelar: polygonal morfologi, som kännetecknar stjärnformade astrocyter i vivo (MD-metoden)5. längden och kostnaden för protokoll (förbereda astrocyter från inducerade pluripotenta stamceller tar tre månader och kräver många reagenser, inklusive dyra tillväxtfaktorer)6. de låga mängder material (immunopanning metod)3. och de differentiering av astrocyter och kravet på en 3D matrix (Puschmann et al.) 1 , 2. däremot AWESAM protokollet ger: in-vivo-gillar morfologi (stjärnformade astrocyter med tunn processer); en snabb, lätt och billig metod; stora mängder material; och mest in-vivo-gillar genuttryck jämfört med immunopanned och MD astrocyter. Dessutom 2D kultur möjliggör studier av Ca2 + signalering och vesikler återvinning i tunn processer och händelser nära membranet (t.ex., Frida mikroskopi är inte möjligt i 3D kulturer).
Metoden MD har använts flitigt sedan dess publikation i 19805, erbjuder en enkel och snabb teknik för polygonal Astrocyten monokulturer. I korthet innebär metoden MD växande blandade hjärnceller i fetalt kalvserum (FCS)-innehållande DMEM, följt av skakningar steg som berika för astrocyter (som alla andra hjärncell typer loss från skålen) och ytterligare kultur i samma medium. DMEM kompletteras med FCS används för många andra celltyper, alltifrån fibroblaster och adipocyter till olika cancer cellinjer, varav alla dela polygonal morfologi utställda av MD astrocyter i kultur. Fram till det tidiga 2000-tal7, liten tanke hade varit ges till media skräddarsys astrocyter, speciellt för att gynna deras typiska stjärnformade morfologi hittade i vivo. Protokoll publicerades 2011 uppnår sådan stjärnformade morfologi: anropat metoden immunopanning, sysselsätter serumfritt medium optimerad för odling astrocyter3. Med den här metoden, utsätts nymalen isolerade hjärnceller för en rad rätter överdragna med antikroppar som är riktade till cell typspecifika cell ytproteiner, att berika för astrocyter. Trots den mer in-vivo-som morfologi och uttryck profil immunopanned astrocyter, majoriteten av in vitro- studier fortfarande förlitar sig på metoden MD Astrocyten. MD metoden är enkel och snabb, medan metoden immunopanning består av mer komplexa och tidskrävande steg den första dagen av kultur (såsom enzym matsmältningen längre, försiktig skiktning av lösningar av olika densitet, immunopanning sig, och flera centrifugering steg - alla före plätering). Men med hjälp av mer specialiserade medium, metoden AWESAM erbjuder både hastighet metoden MD och den in-vivo-gillar morfologi av protokollet immunopanning.
Sammantaget protokollet AWESAM är användbar för att studera mer i vivo-gillar astrocyter i 2D monokulturer isolerade från nervceller och andra glia (som tidigare kännetecknas4 av immunostainings, immunoblots och RNA-sekvensering). Den möjliggör att studera tunn astrocytic processer och ger stor tillgänglighet för att visualisera spontana Ca2 + signalering och händelser nära membranet (t.ex., fotograferad av Frida mikroskopi).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök som beskrivs här har utförts i enlighet med riktlinjerna för tyska djurskydd.
Obs: Tidslinjen och huvudsteg i protokollet illustreras i figur 1.
1. förberedelser
-
Förbered följande lösningar.
- Förbereda DMEM + odling polygonal MD astrocyter: DMEM med 10% FCS, 100 U penicillin och 100 µg/mL streptomycin.
- Förbereda NB + H odlingsskålar stjärnformade astrocyter för: neurobasal medium med 5 ng/mL HBEGF, 1 x B-27 tillägg, 1 x glutamin tillägg, 100 U penicillin och 100 µg/mL streptomycin.
Obs: Alikvoter av högre koncentrationer av HBEGF kan förberedas och förvaras vid-20 ° C ska läggas till mediet när det behövs. - Förbereda dissektion medium (10 mM HEPES i HBSS).
- Förbereda alikvoter av 6-7 mL 0,05% trypsin-EDTA och 6-7 mL 0,25% trypsin-EDTA i 15 mL rör. Dessa kan lagras vid-20 ° C och tinade i 37 ° C vattenbad.
- Dagen innan start protokollet, coat 10 cm vävnadsodling-behandlade rätter med 5 mL 0,04% polyethylenimine (PEI) varje.
- Nästa dag, ta bort PEI och diska med avjoniserat, destillerat vatten två gånger. Tillsätt 12 mL DMEM + till varje platta och pre jämvikta i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2 i minst 30 min före plätering celler.
- Förbereda området dissektion: I en dissektion LAF, förlägger två 10 cm petriskålar fylld med dissektion medium på is. För varje hjärna att vara isolerade (t.ex., cortex, hippocampus), förbereda en 15-tub fylld med 14 mL dissektion medium och hålla på is. Spray dissektion verktyg (fin sax, Dumont #3 och #5 tången) med 70% etanol och plats bredvid dissektion mikroskopet i huven.
2. råtta eller mus hjärnan dissektion
Obs: Både möss och råttor kan användas. Djur som är äldre än P8 kan också användas (vi testade upp till P12), men att ta bort hjärnhinnorna blir allt svårare. Ytterligare, den cell avkastning och hälsa kommer att minska eftersom hjärnceller från äldre djur kommer har bildat intrikata processer och anslutningar som kan bryta under vävnad dissociation, vilket leder till ökad celldöd. Presenteras här kortikala preparat, men andra regioner i hjärnan kan också användas.
- Placera 0,05% trypsin-EDTA i 37 ° C vattenbad.
- Avliva djur (gravida råttor för E19 pups eller P0-P8 djur) genom att sakta höja CO2 -koncentration och isolera hjärnor. Följande steg kräver steril teknik.
-
Om arbetar med embryonal vävnad, först bort embryon från livmodern och öppna den embryonala säckar, sedan omedelbart avskurna huvuden med sax. När alla huvuden är avskurna, överföra dem till nedkylda dissektion medium.
- När cheferna är nedsänkt i mediet, öppna huden och skallen (båda är mycket mjuk i unga djur) med pincett och nypa av lillhjärnan. Försiktigt spaken resten av hjärnan upp och ur skallen.
Obs: Två till fyra E19 embryon ge tillräckligt vävnad för minst åtta 10 cm rätter av kortikala astrocyter pläterade på 500 000 celler per maträtt på dagen för dissektion.
- När cheferna är nedsänkt i mediet, öppna huden och skallen (båda är mycket mjuk i unga djur) med pincett och nypa av lillhjärnan. Försiktigt spaken resten av hjärnan upp och ur skallen.
- För nyfödda eller äldre valpar, avskurna huvuden med sax och isolera hjärnor genom medialt skära huden i en rak linje från baksidan av huvudet till spetsen av näsan. Dra ut huden åt sidan och noggrant skära den skalle vänster och höger, sedan hiss skallen bena upp. Skär av lillhjärnan, och spaken resten av hjärnan upp och ur skallen.
Obs: Två till tre P0-P8 pups ge tillräckligt vävnad för minst åtta 10 cm rätter av kortikala astrocyter pläterade på 500 000 celler per maträtt på dagen för dissektion. - Separata cortex från den underliggande strukturen i mellanhjärnan. Placera pincetten inom de längsgående spricka mellan hjärnhalvorna, flytta sedan tången mellan ena hjärnhalvan (vinkelrät mot den längsgående sprickan) cortex och mellanhjärnan strukturer att nypa varje halvklotet gratis.
- Använda tången, ta bort alla hjärnhinnorna från varje halvklotet (och dess hippocampus), sedan separera hippocampi. Om Hippocampus astrocyter krävs, flytta varje hippocampus i en 15 mL tub fylld med 14 mL dissektion medium på is.
- Ta bort ytterligare områden från varje halvklotets cortex om specifika regioner är nödvändiga (t.ex., frontala cortex). Skär några kortikal vävnad som ska användas för att generera astrocyter i bitar inte är större än 1 mm3. Samla alla bitar av kortikal vävnad i en separat 15 mL tub fylld med dissektion medium på is.
3. vävnad matsmältningen och Dissociation
- När alla vävnad bitar samlas in, vänta för dem att bosätta sig till botten av röret och sedan aspirera så mycket medel som möjligt.
- Tillsätt 2-3 mL 0,05% trypsin-EDTA med serologiska pipett och inkubera rören i ett vattenbad på 37 ° C i 20 min.
Obs: Släpp alla trypsin-EDTA från pipetten snabbt att blanda vävnad bitarna och låt sedimentera igen. - Aspirera försiktigt den trypsin-EDTA, lämnar vävnad bitar i som lite vätska som möjligt, på botten av röret.
- Tillsätt 5 mL av nedkylda dissektion medium att tvätta bort den återstående trypsin-EDTA. Överför med pipett till sidan av den övre delen av röret för att uppnå blandning av vävnad bitar.
- Aspirera dissektion medium, och lämna vävnad bitar i som lite vätska som möjligt. Upprepa detta tvätt med nedkylda dissektion medium dubbelt mer.
- Efter det sista tvätt, tillsätt 1 mL DMEM + (värmas till rumstemperatur) med en 1000 µL pipettspetsen och pulverisera vävnaden genom pipettering upp och ner utan att införa bubblor.
Obs: Det är viktigt att undvika bubblor, eftersom detta kan förändra pH i lösningen, som astrocyter är ganska känsliga. - Placera en sil med 100 µm i cellen i öppnandet av en 50 mL tub och pre våt filtret med 4,5 mL av nedkylda DMEM +.
- Pipettera 1 mL dissocierade vävnad suspension på cell silen och lägga till ytterligare 4,5 mL före kyls DMEM + att tvätta cellerna genom cell Silen.
4. cell plätering för Astrocyten berikning av Passaging
- Räkna cellerna, t.ex., genom att späda 10 µL cellsuspension med 10 µL trypan blå och pipettering mixen på en hemocytometer.
- Tallrik 500.000 celler i 12 mL DMEM + per 10-cm skålen.
Obs: DMEM + är bra för astrocytic tillväxt, mer så än för nervceller eller mikroglia. Under skakningar är de fysiska krafter som verkar på glas coverslips inom brunnar mycket starkare än de som agerar på de 10-cm rätterna (utan coverslips). Om celler skakas på 24 brunnar, de blir ohälsosamma eller dö. Bara plattan astrocyter på 24 brunnar efter omskakning. - Håll cellkulturer i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2 i sju dagar.
- På dag 6, förbereda dagen före skakar och passaging celler, PEI-belagd kultur plattorna som beskrivs i steg 5.
5. passaging celler
-
Dagen innan passaging, coat cell kultur plattor med 0,04% PEI.
- För immuncytokemi, viral transduktion eller plasmid transfection, använda 24-väl eller 6-väl plattor (vardera med en steriliserad 12 mm eller 25 mm täckglas, respektive).
- Sterilisera glas coverslips genom inkubation i 70% etanol för minst 1 h, sedan tvätta tre gånger i avjoniserat, destillerat vatten innan du placerar coverslips i brunnarna.
- Tillsätt minst 70 µL 0,04% PEI per 12-mm täckglas i 24 brunnar och 600 µL 0,04% PEI per 25 mm täckglas i 6 brunnar.
- Western blot eller RNA-Seq analys, 10 cm rätter som redan innehåller celler efter dissektion kan fortsätta att användas. Rätter behöver bara skakas, då cellerna tvättas med 1 x PBS och behandlade med NB + H (överförs inte till nya rätter).
- På dagen i vitro (DIV) 7 efter dissektion, placera 10-cm rätter med celler DMEM + på en laboratorium shaker i inkubatorn och skaka av rätter på 110 rpm för 6 h.
- Tvätta bort PEI från belagda coverslips med avjoniserat, destillerat vatten två gånger. Lägga till NB + H medium plattorna (500 µL per brunn för 24 brunnar och 2 mL per brunn för 6-väl plåtar). Pre jämvikta plattorna i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2 medan de 10 cm rätterna skakar, eller för minst 30 min.
- 20-30 min före utgången av 6 h skakning, varma före 1 x PBS, DMEM +, NB + H och 0,25% trypsin-EDTA till 37 ° C i vattenbadet.
- Efter 6 h av skakningar, ta kultur rätterna av shaker och omedelbart ersätta mediet (som innehåller skakas-off nervceller, oligodendrocyter, och mikroglia) med 10 mL värmde före 1 x PBS per maträtt.
Obs: Det är viktigt att omedelbart aspirera gamla medium som innehåller fristående celler för att undvika icke-astrocytic cellerna åter fästa. - Ta bort PBS och tillsätt 3 mL före värmde trypsin-EDTA per maträtt. Inkubera varje maträtt för 4 min i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2.
Obs: Om förbereder prover för Western blot eller RNA-Seq, Lägg inte till trypsin-EDTA. I stället värmde Ersätt PBS med 12 mL före NB + H, varefter kulturer kan placeras tillbaka i inkubatorn. - Tillsätt 5 mL före värmde DMEM + att den 3 mL trypsin-EDTA i varje maträtt, Pipettera cellerna bort skålen med 5 mL serologiska pipett och samla cellsuspensionen i en 50 mL tub.
Obs: Pipetten direkt från botten av skålen - golvet i skålen bör bli tydligare som cellerna lossa. Endast använda serum-innehållande medium (i stället för DMEM +), som serum inactivates trypsin. - Centrifugera cellsuspension vid 3 220 x g vid 20 ° C under 4 minuter.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1 mL före värmde NB + H.
6. cell plätering för slutliga Astrocyten kulturer
- Räkna cellerna.
- Tallrik 20 000 celler per brunn i 6-väl plattor (i 2 mL NB + H medium per brunn) eller 5 000 celler per brunn i 24 brunnar (i 500 µL NB + H medium per brunn).
- Håll cellkulturer i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2 tills vidare behandling eller analys.
- Utbyta halv medlet en gång i veckan.
Obs: I låg-näringsämne miljöer, astrocyter stoppa frodas men eventuella återstående mikroglia kommer att föröka sig (även om vår erfarenhet visades inga mikroglia i AWESAM kulturer). Utbyte av halva medlet en gång i veckan förhindrar anrikning av någon potentiellt återstående mikroglia8, och monokulturer förblir friska under minst tre veckor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Astrocyter som tillsammans odlade med nervceller och odlas i NB + medium visas stjärnformade efter 2 veckor av kultur (figur 2). Utöver NB + medium utsätts Co odlade astrocyterna också för okänd neuron-derived faktorer som sannolikt bidrar till deras överlevnad och morfologi. Däremot visas MD astrocyter vuxit i DMEM + som monokulturer (efter skakar av andra celltyper innan passage) polygonal efter 2 veckor. AWESAM astrocyter odlas i NB + H efter omskakning, visas stjärnformade med många fina processer efter 2 veckor av kultur.
Vi visade tidigare att RNA uttryck profil AWESAM astrocyter är närmare astrocyter i vivo jämfört med MD och immunopanned astrocyter4. När det gäller Astrocyten-specifika proteinuttryck uttrycka kortikala astrocyter höga ALDH1L1 och låga nivåer av förpliktelserna i vivo12. Detta gäller även AWESAM astrocyter och immunfärgning av ALDH1L1, som ett cytoplasmiska enzym, avslöjar finare detaljer än det cytoskeletal proteinet Fredsgenomförande (figur 2B).
Bortsett från den RNA och protein uttrycket, astrocyter i vivo Visa spontan Ca2 + signalering (dvs.utan yttre stimulering), men polygonal MD astrocyter in vitro- kräver ofta stimulering framkalla Ca2 + signalering, t.ex., genom att lägga till ATP eller glutamat. AWESAM astrocyter uppvisar spontana Ca2 + signalering i vivo, i både cell kroppar och fina processer, som kan visualiseras av viralt transducing celler med den membran-riktade Lck-GCaMP3 (figur 3). Spontan vågor av Ca2 + hela angränsande astrocyterna också uppstå (figur 3A). Astrocytic Ca2 + signalering (figur 3B) i fina processer och microdomains kan analyseras med hjälp av freeware specifika för astrocyter13.
Figur 1 : Protokoll tidslinje. En tidslinje som visar de viktigaste stegen i AWESAM protokoll, inklusive den tid det tar för att utföra dessa steg på DIV0 (dag av dissektion), DIV7 (dag av passage), och vad som väntar vid senare tidpunkter. Den gröna rutan visar när celler kan skördas som stjärnformade astrocyter, där ljusare kontra mörkare nyanser representerar mindre jämfört med mer komplexa stjärnformade morfologi och mognad, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Medium avgör morfologi. (A) Schematisk visar hur Astrocyten morfologi förändras när Co odlade med nervceller (som tidigare beskrivits4) vs. odlas som monokulturer, och beroende på medium. Astrocyten-specifik färgning med Fredsgenomförande konturer stjärnformade morfologi i Co odlade och AWESAM astrocyter och polygona morfologi i MD astrocyter. (B), Fredsgenomförande etiketter MD astrocyter beskriver starkare än ALDH1L1, och ALDH1L1 (men inte Fredsgenomförande) fina processerna för AWESAM astrocyter. Varken Astrocyten monokultur uppvisar den neuronala markören MAP2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Spontan Ca2 + signalering i astrocyterna. (A) GCaMP-sensorik AWESAM astrocyter uppvisar spontana Ca2 + evenemang under hela Astrocyten nätverk, inklusive i de tunna processerna (pilspetsar). En Ca2 + våg färdas genom flera astrocyter från vänster till höger i bilder från olika tidpunkter, där ljus färg skildrar områden av hög Ca2 + koncentrationer, och svarta områden representerar extracellulära regioner. Bilder förvärvades med levande cell konfokalmikroskopi. (B), Ca2 + koncentrationerna förändras i färgkodade regionerna i (A) över tiden, visas som GCaMP fluorescens intensitet spår som illustrerar hur en Ca2 + signalering våg sprids över flera astrocyter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fyra steg inom protokollet är kritisk: 1) förbereder HBEGF koncentrationen till just 5 ng/mL, eftersom små ökningar av koncentrationen kan leda till omogna kulturer, t.ex., kommer 10 ng/mL HBEGF de skilja astrocyter4; (2) undvika bubblor i lösningar som innehåller vävnad eller celler, som kan ändra pH och hindra Astrocyten hälsa. (3) före balanserande media att uppnå den optimala pH och temperatur för växande friska astrocyter; 4) utbyta bara halva medlet en gång i veckan eftersom alla återstående mikroglia är mindre benägna att föröka när tillräckligt näringsämnen är närvarande och mediet är utväxlas regelbundet8 (även om ingen mikroglia fanns i AWESAM kulturer så långt). För den sista punkten är det viktigt att notera att Astrocyten-derived faktorer inom kulturen inte bör tas helt bort, eftersom de kan stödja astrocytic överlevnad, differentiering och spridning.
Det är viktigt att använda DIV14 eller äldre kulturer som mogen Astrocyten källa (men för transduktion eller transfection steg, tidigare kulturer kan användas) eftersom astrocyter yngre än DIV14 fortfarande har neurala stamceller potentiella9. För viral transduktion, blandade kulturer av nervceller och astrocyter sensorik på DIV7 (med adeno-associated virus) effektivt express viralt sensorik GFP10. För plasmid transfection, DIV10-DIV24 astrocyter används ofta och fluorophore-märkta proteiner avbildas 2-5 dagar senare11. Vår erfarenhet fungerar både viral transduktion och plasmid transfection bäst om astrocyter är sensorik mellan DIV9 och DIV14. Transfection och transduktion effektivitet beror på konstruktionen och metod, men vi hitta transfection effektivitet är ~ 20% i Astrocyten monokulturer med lipofectamine transfection, som adeno-associerade virus (AAV) transduktion effektivitet är ~ 90% ( Se våra tidigare arbete4 för ytterligare detaljer, t.ex., konstruktion används). När transducing astrocyter med AAV partiklar och transfecting av lipofectamine, får vi minst 5 och 2 dagar, respektive för uttryck av konstruktionen. Innan transduktion eller transfection, bör astrocyterna också tillåtas att återvinna för minst en dag efter passaging.
Dessutom när förbereder kulturer för att jämföra RNA och protein uttryck vid olika tid punkter, kulturer kan pläteras på olika densiteter för att uppnå jämförbara mängder av material, t.ex., astrocyt monokulturer som skördas på DIV7 och DIV21 kan vara pläterade på tätheter av 1 x 106 och 500 000 celler per 10-cm skålen, respektive. Exempelvis kommer att hela protein lysate avkastningen vara runt 0,5 mg/mL på DIV14 när skördas efter initialt plätering 500.000 AWESAM astrocyter på en 10-cm maträtt.
Protokollet AWESAM representerar ett snabbt, enkelt och billigt sätt att kultur astrocyter i isolering från nervceller men med in vivo-som kännetecknar RNA och proteinuttryck, morfologi och Ca2 + signalering4, som hittills tillhandahålls av inga andra protokoll. AWESAM astrocyter kan användas för analyser som är typiska för cellkulturstudier, inklusive immuncytokemi, immunoblotting, RNA uttryck analys, Frida mikroskopi och Ca2 + imaging4. Senaste framstegen inom genetiskt kodade Ca2 + indikatorer tillåter i synnerhet, för att visualisera fina astrocytic processer i större detalj än klassiskt Ca2 + färgämnen14. Ca2 + signalering, vesikulär upptag och exocytos i både tjocka och tunna astrocytic processer är fysiologiskt relevant, eftersom dessa processer kan påverka hjärnans funktion när det gäller trofiska stöd, blodflöde, synaptisk signalering och plasticitet, och kommunikationen. AWESAM protokollet tillåter för att studera de fina astrocytic processerna relevanta för hjärnans fysiologi15 och sjukdom16,17, utan neurologiska störningar och med bra tillgänglighet att in vitro kultur leveranser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi erkänner finansiering från Europeiska forskningsrådet (FP7/260916), Alexander von Humboldt-Stiftung (Sofja Kovalevskaja) och den Deutsche Forschungsgemeinschafts (DE1951 och SFB889).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | warm in 37 ºC waterbath before use |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | warm in 37 ºC waterbath before use |
| B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | 50X stock |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 100X stock |
| Penicillin / streptomycin | Gibco | 15070-063 | 50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 µg/ml |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | without L-glutamine |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| HBEGF | Sigma | 4643 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HBSS | Gibco | 14170112 | |
| FCS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | 1X |
| 100 μm nylon cell strainer | BD | 352360 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Hera Cell 240i cell culture incubator | |
| Laboratory shaker | Heidolph | Rotamax 120 | use inside cell culture incubator |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R |
References
- Puschmann, T. B., et al. Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells. Glia. 61 (3), 432-440 (2013).
- Puschmann, T. B., et al. HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins. J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Wolfes, A. C., et al. A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes. J Gen Physiol. 149 (4), (2016).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
- Krencik, R., Zhang, S. -C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).
- Morita, M., et al. Dual regulation of calcium oscillation in astrocytes by growth factors and pro-inflammatory cytokines via the mitogen-activated protein kinase cascade. J Neurosci. 23 (34), 10944-10952 (2003).
- Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).
- Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55 (2), 165-177 (2007).
- Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Res. 1190, 15-22 (2008).
- Malarkey, E. B., Parpura, V. Temporal characteristics of vesicular fusion in astrocytes: examination of synaptobrevin 2-laden vesicles at single vesicle resolution. J Physiol. 589, Pt 17 4271-4300 (2011).
- Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. J Neurosci. 2 (18), 6391-6410 (2012).
- Srinivasan, R., et al. Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).
- Shigetomi, E., et al. Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses. J Gen Physiol. 141 (5), 633-647 (2013).
- Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Otsu, Y., et al. Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling. Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).
- Agarwal, A., et al. Transient Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Induces Microdomain Calcium Transients in Astrocyte Processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).
