Summary
AWESAM protokollen beskrevet her er optimal for dyrking murine astrocyttene isolert fra andre hjerneceller på en rask, enkel og rimelig måte. AWESAM astrocyttene utstilling spontan Ca2 + signalering morfologi og gene uttrykket profiler ligner astrocyttene i vivo.
Abstract
AWESAM (en low-koster easy stellate enstrocyte method) protokollen innebærer en rask, enkel og rimelig måte å generere store mengder av in vivo-som mus og rotten astrocytter monokulturer : Hjerneceller kan isoleres fra forskjellige hjernen regioner, og etter en uke med cellekulturer, ikke-astrocytic celler er ristet av ved å plassere kultur retter på en shaker 6 h i inkubator. De gjenværende astrocyttene er deretter passaged til nye plater med et astrocytter-spesifikke medium (kalt NB + H). NB + H inneholder lave konsentrasjoner av heparin-bindende EGF-lignende vekstfaktor (HBEGF), som brukes i stedet for serum medium. Etter vokser i NB + H, har astrocyttene og AWESAM en stellate morfologi og funksjonen fine prosesser. Videre disse astrocyttene har mer i vivo-liker genuttrykk enn astrocyttene generert av tidligere publiserte metoder. Ca2 + bildebehandling, vesicle dynamics og andre arrangementer nær membranen kan dermed studeres i fine astrocytic prosesser i vitro f.ekslevende celle AC confocal eller TIRF mikroskopi. Spesielt utstillingen AWESAM astrocyttene også spontan Ca2 + signalering ligner astrocyttene i vivo.
Introduction
Astrocyttene påvirke hjernefunksjon gjennom trophic støtte, blodstrøm, synaptic signalering og plastisitet og intercellulære kommunikasjon - alle er mekanismer som senter rundt tynne astrocytic prosesser. AWESAM protokollen beskrevet her kan studere disse prosessene uten innblanding fra neurons og andre glia, som er nyttig eksempelfordi uttrykk for mange proteiner og selv Ca2 + signalering overlappe over forskjellige hjernecelle typer. Videre, denne metoden overvinner begrensninger av tidligere tilgjengelige teknikker. Spesielt våre protokollen gir i vivo-som morfologi (stellate astrocyttene med tynne prosesser) og genuttrykk i en rask, lett og billig måte.
Celle morfologi, genekspresjon, og mange andre regulatoriske prosesser er direkte påvirket av miljøet. I en kultur parabol refererer dette til faktorer utgitt av omkringliggende celler, men også medium der cellene er dyrket. For astrocyttene, HBEGF tidligere rapportert å indusere stellate morfologi1 men ble også funnet for å skille de astrocyttene2. Imidlertid lave konsentrasjoner av HBEGF ble senere brukt for å generere mer i vivo-liker astrocyttene som identifiseres via RNA sekvensering i to forskjellige protokoller3,4. Videre astrocytter morfologi endres med middels sammensetningen, uavhengig av protokoll4: Neurobasal medium med en lav konsentrasjon av HBEGF er optimal for dyrking av stellate astrocyttene, mens andre mellomstore komposisjoner (f.eks, serum inneholder DMEM) produsere mangekantet celler (selv i astrocyttene fersk isolert av immunopanning).
AWESAM protokollen overvinner ulemper av tidligere teknikker for voksende astrocytter monokulturer4. Tidligere teknikker for voksende astrocytter monokulturer har følgende ulemper: mangekantet morfologi, som er uvanlig stellate astrocyttene i vivo (MD metode)5; lengden og kostnaden for protokollen (forberede astrocyttene fra indusert pluripotent stamceller tar tre måneder og krever mange reagenser, inkludert dyre vekstfaktorer)6; de lave mengder materiale (immunopanning metode)3; og de differensiering av astrocyttene og kravet om en 3D matrise (Puschmann et al.) 1 , 2. I motsetning AWESAM protokollen gir: i vivo-liker morfologi (stellate astrocyttene med tynne prosesser); en rask, enkel, og billig metode; store mengder materiale; og mest i vivo-liker genuttrykk sammenlignet med immunopanned og MD astrocyttene. I tillegg 2D kultur gir for studier av Ca2 + signalisering og vesicle resirkulering tynn prosesser og hendelser nær membranen (f.eksTIRF mikroskopi er ikke mulig i 3D kulturer).
Metoden MD har vært mye brukt siden sin utgivelse i 19805tilbyr en enkel og rask teknikk for mangekantet astrocytter monokulturer. I korthet, MD metoden innebærer voksende blandet hjerneceller i fosterets kalv serum (FCS)-som inneholder DMEM, etterfulgt av risting berike for astrocyttene (som alle andre hjerne cellen typer koble fra retten) og videre kultur i samme medium. DMEM med FCS brukes til mange andre celletyper, alt fra fibroblaster og adipocytter til forskjellige kreftcelle linjer, alle dele mangekantet morfologi utstilt av MD astrocyttene i kultur. Til det tidlige 2000-tallet7, liten tanke hadde blitt gitt til media tilpasset astrocyttene, spesielt å favorisere sine typiske stellate morfologi funnet i vivo. En protokoll publisert i 2011 gjør nå slike stellate morfologi: kalt metoden immunopanning, sysselsetter serum-free medium optimalisert for dyrking astrocyttene3. Bruker denne metoden, utsatt fersk isolert hjerneceller for en rekke retter belagt med antistoffer som målet celle type-spesifikk celle overflaten proteiner, å berike for astrocyttene. Til tross for den mer i vivo-som morfologi og uttrykk profil av astrocyttene og immunopanned, fleste i vitro studier fortsatt stole på MD astrocytter metoden. Metoden MD er enkel og rask, mens metoden immunopanning omfatter mer komplisert og tidkrevende trinnene på den første dagen av kultur (som lengre enzym fordøyelsen perioder, forsiktig lagdeling av løsninger av ulik tetthet, immunopanning, og flere sentrifugering trinn - før plating). Men ved mer spesialisert medium metoden AWESAM tilbyr både hastigheten på metoden MD og i vivo-liker morfologi av immunopanning-protokollen.
Samlet AWESAM protokollen er nyttig for å studere mer i vivo-liker astrocyttene i 2D monokulturer isolert fra neurons og andre glia (som tidligere preget4 immunostainings, immunoblots og RNA sekvensering). Det muliggjør studiet av tynne astrocytic prosesser, og gir utmerket tilgjengelighet for å visualisere spontan Ca2 + signalisering og hendelser nær membranen (f.eksfotografert av TIRF mikroskopi).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk beskrevet her ble utført i samsvar med retningslinjene for tyske dyrevelferd.
Merk: Tidslinjen og hovedtrinn protokollen er illustrert i figur 1.
1. forberedelser
-
Klargjør følgende løsninger.
- Forberede DMEM + dyrking mangekantet MD astrocyttene: DMEM med 10% FCS, 100 U penicillin og 100 µg/mL streptomycin.
- Forberede NB + H dyrking stellate astrocyttene: neurobasal middels med 5 ng/mL HBEGF, 1 x B-27 supplement, 1 x glutamin tilskudd, 100 U penicillin og 100 µg/mL streptomycin.
Merk: Dele høyere konsentrasjoner av HBEGF kan være forberedt og lagret på 20 ° C legges til mediet når behøvde. - Forberede disseksjon mediet (10 mM HEPES i HBSS).
- Forberede dele 6-7 mL 0,05% trypsin-EDTA og 6-7 mL 0,25% trypsin-EDTA i 15 mL rør. Disse kan være lagret på 20 ° C og tint i et 37 ° C vannbad.
- Dagen før protokollen, pels 10 cm vev kultur-behandlet retter med 5 mL 0,04% polyethylenimine (PEI) hver.
- Neste dag, fjerne PEI og vask retter med destillert deionisert vann to ganger. Legge til 12 mL DMEM + hver plate og pre equilibrate i kuvøse på 37 ° C og 5% CO2 i minst 30 min før plating celler.
- Forberede området disseksjon: laminær strømning disseksjon hette, plassere to 10 cm Petri retter fylt med disseksjon medium på is. For hver hjernen å være isolert (f.ekscortex, hippocampus), forberede et 15-rør fylt med 14 mL disseksjon medium og holde på is. Spray disseksjon verktøy (fin saks, Dumont #3 og #5 tang) med 70% etanol og sted ved disseksjon mikroskopet i panseret.
2. rotte eller mus hjernen disseksjon
Merk: Begge mus og rotter kan brukes. Dyr eldre enn P8 kan også brukes (vi testet til P12), men fjerner meninges blir stadig vanskeligere. Videre avta på cellen avkastning og helse, siden hjerneceller fra eldre dyr vil har dannet intrikate prosesser og tilkoblinger som kan bryte under vev dissosiasjon, fører til økt celledød. Kortikale forberedelser er beskrevet her, men andre hjernen områder kan også brukes.
- Plass 0,05% trypsin-EDTA i en 37 ° C vannbad.
- Avlive dyrene (gravid rotter E19 pups eller P0-P8 dyr) sakte øke CO2 konsentrasjonen og isolere hjernen. De følgende trinnene krever steril teknikk.
-
Hvis arbeider med embryonale vev, fjerne embryoene fra livmoren og åpne de embryonale sacs, så umiddelbart kuttet hodet med saks. Når alle hoder er avskåret, overføre dem til pre-avkjølt disseksjon medium.
- Når hodet er neddykket i medium, åpne huden og kraniet (begge er veldig myk i unge dyr) med tang og snev av lillehjernen. Nøye lever resten av hjernen opp og ut av skallen.
Merk: To til fire E19 embryo gi nok vev for minst åtte 10 cm retter av kortikale astrocyttene belagt på 500.000 celler per fat ved disseksjon.
- Når hodet er neddykket i medium, åpne huden og kraniet (begge er veldig myk i unge dyr) med tang og snev av lillehjernen. Nøye lever resten av hjernen opp og ut av skallen.
- Nyfødte eller eldre pups, kuttet av hodet med saks og isolere hjernen ved medialt kutte huden i en rett linje fra baksiden av hodet til spissen av nesen. Rykk huden til side og nøye klippe skallen venstre og høyre, deretter heis skallen ben opp. Klipp av lillehjernen, og lever resten av hjernen opp og ut av skallen.
Merk: To til tre P0-P8 pups gi nok vev for minst åtte 10 cm retter av kortikale astrocyttene belagt på 500.000 celler per fat ved disseksjon. - Skille cortex fra den underliggende mellomhjernen strukturen. Plasser tang i langsgående sprekken mellom halvkulene, deretter gå tang mellom cortex og mellomhjernen strukturer av en halvkule (vinkelrett langsgående sprekken) å klemme hver halvkule gratis.
- Bruke pinsett, fjerne alle meninges fra hver halvkule (og dens hippocampus) og del i hippocampi. Hvis hippocampus astrocyttene, flytte hver hippocampus til en 15 mL tube fylt med 14 mL disseksjon medium på is.
- Fjerne videre fra hver halvkule cortex Hvis bestemte regioner er nødvendig (f.eksfrontal cortex). Kuttet alle kortikale vev som skal brukes for å generere astrocyttene i biter ikke større enn 1 mm3. Samle alle kortikale vev i en egen 15-mL tube fylt med disseksjon medium på is.
3. vev fordøyelsen og dissosiasjon
- Når alle vev brikkene er samlet, vente for dem å bosette til bunnen av røret, og Sug opp så mye middels som mulig.
- Legg 2-3 mL 0,05% trypsin-EDTA bruker en serologisk pipette, og ruge rør i et vannbad 37 ° C for 20 min.
Merk: Frigi alle trypsin-EDTA fra pipette raskt å blande vev bitene og tillater å bosette seg igjen. - Nøye Sug opp trypsin-EDTA, forlater vev brikker i som lite væske som mulig, på bunnen av røret.
- Legge til 5 mL av pre-avkjølt disseksjon medium for å vaske av gjenværende trypsin-EDTA. Pipetter ved siden av den øvre delen av røret for å oppnå blanding av vev bitene.
- Sug opp disseksjon medium, og la vev bitene i som lite væske som mulig. Gjenta dette trinnet for vask med pre-avkjølt disseksjon medium to ganger mer.
- Etter siste vask trinn, Legg 1 mL av DMEM + (oppvarmet til romtemperatur) bruker en 1000 µL pipette tips og triturate vev av pipettering opp og ned uten introdusere bobler.
Merk: Det er viktig å unngå produserer bobler, som dette kan endre pH av løsningen, som astrocyttene er ganske følsom. - Plasser en 100 µm celle sil i åpningen av en 50-mL tube og pre våt filteret med 4,5 mL pre-avkjølt DMEM +.
- Pipetter 1 mL av dissosiert vev suspensjon på cellen silen og legge en annen 4,5 mL pre avkjølt DMEM + å vaske cellene gjennom cellen silen.
4. celle Plating for astrocytter anriking av Passaging
- Telle celler, f.eksved å fortynne 10 µL av cellen suspensjon med 10 µL trypan blå og pipettering blandingen på en hemocytometer.
- Plate 500.000 celler i 12 mL DMEM + per 10 cm parabolen.
Merk: DMEM + er nyttig for astrocytic vekst, mer så enn for nerveceller eller microglia. Under risting er de fysiske kreftene som virker på glass coverslips i brønner mye sterkere enn de opptrer på 10 cm rettene (uten coverslips). Hvis celler er rystet på 24-vel plater, de blir usunn eller dø. Bare plate astrocyttene på 24-vel plater etter risting. - Hold cellekulturer i kuvøse på 37 ° C og 5% CO2 i syv dager.
- På dag 6, dagen før risting og passaging celler, forberede PEI-belagt kultur platene som beskrevet i trinn 5.
5. passaging celler
-
Dagen før passaging, pels celle kultur plater med 0,04% PEI.
- Immunocytochemistry, viral signaltransduksjon eller plasmider transfection, bruk 24-godt eller 6-vel plater (hver inneholder en sterilisert 12 mm eller 25 mm glass dekkglassvæske, henholdsvis).
- Sterilisere glass coverslips av inkubasjon i 70% etanol minst 1t, deretter vaske tre ganger i destillert deionisert vann før du legger til coverslips i brønnene.
- Legg til minst 70 µL 0,04% PEI per 12 mm dekkglassvæske i 24-vel plater og 600 µL 0,04% PEI per 25 mm dekkglassvæske i 6-og plater.
- Western blot eller RNA-Seq analyse, 10 cm rettene allerede inneholder cellene etter dissection kan fortsatt brukes. Retter bare skal rokkes, da cellene er vasket med 1 x PBS og behandlet med NB + H (overfører ikke til nye retter).
- På dagen i vitro (DIV) 7 etter dissection, plassere 10 cm retter med celler i DMEM + på en laboratorium shaker i kuvøse og riste rettene på 110 rpm 6 h.
- Vaske PEI fra belagt coverslips med destillert deionisert vann to ganger. Legge til NB + H medium plater (500 µL per brønn for 24-vel plater og 2 mL per brønn for 6-vel plater). Pre equilibrate platene i kuvøse på 37 ° C og 5% CO2 mens 10 cm rettene skjelver eller for minst 30 min.
- 20-30 minutter før slutten av 6 h risting, forvarme 1 x PBS, DMEM +, NB + H og 0,25% trypsin-EDTA 37 ° c i vannbad.
- Etter 6 h risting, ta kultur retter av shaker og umiddelbart bytte ut mediet (som inneholder rystet av neurons, oligodendrocytes og microglia) med 10 mL varme pre 1 x PBS per fat.
Merk: Det er viktig å umiddelbart Sug opp gamle mediet som inneholder frittstående celler for å unngå ikke-astrocytic cellene du. - Fjern PBS og legge 3 mL forvarmes trypsin-EDTA per fat. Inkuber hver rett i 4 min i kuvøse på 37 ° C og 5% CO2.
Merk: Hvis forbereder prøver Western blot eller RNA-Seq, legger ikke til trypsin-EDTA. I stedet, ombytte PBS med 12 mL pre varme NB + H, hvoretter kulturer kan plasseres tilbake i inkubator. - Legge til 5 mL forvarmes DMEM + å 3 mL trypsin-EDTA i hver rett Pipetter cellene av parabolen med en 5 mL serologisk pipette og samle celle suspensjon i en 50 mL tube.
Merk: Pipette direkte fra bunnen av parabolen - gulvet av retten bør bli klarere etter hvert som cellene koble. Bare bruke serum inneholder middels (i stedet for DMEM +), som serum deaktiverer trypsin. - Sentrifuge celle suspensjon 3,220 x g ved 20 ° C i 4 min.
- Fjern nedbryting og resuspend celle pellet i 1 mL pre varmet NB + H.
6. celle Plating for siste astrocytter kulturer
- Telle celler.
- Plate 20.000 celler per brønn i 6-vel plater (i 2 mL NB + H medium per brønn) eller 5000 celler per brønn i 24-vel plater (i 500 µL NB + H medium per brønn).
- Hold cellekulturer i kuvøse på 37 ° C og 5% CO2 før videre behandling eller analyse.
- Utveksle halv medium en gang i uken.
Merk: I lav-nærings miljøer, astrocyttene stoppe voksende men eventuelle gjenværende microglia vil spre seg (selv om i vår erfaring, ingen microglia dukket opp i AWESAM kulturer). Utveksle halv mediet når uken hindrer anriking av noen potensielt gjenværende microglia8, og monokulturer forbli sunt i minst tre uker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Astrocyttene som co kultivert med neurons og vokst i NB + medium vises stellate etter 2 uker kultur (figur 2). I tillegg til NB + medium eksponert co kulturperler astrocyttene ukjent Nevron-avledet faktorer som sannsynligvis bidrar til deres overlevelse og morfologi. I kontrast, vises MD astrocyttene vokst i DMEM + som monokulturer (etter risting av andre celletyper før passering) mangekantet etter 2 uker. AWESAM astrocyttene vokst NB + H etter risting, vises stellate med mange fine prosesser etter 2 uker med kultur.
Vi viste tidligere at RNA uttrykk profilen AWESAM astrocyttene er nærmere til astrocyttene i vivo sammenlignet med MD og immunopanned astrocyttene4. I astrocytter-spesifikke protein uttrykk uttrykke kortikale astrocyttene høye nivåer av ALDH1L1 og lave nivåer av GFAP i vivo12. Dette gjelder også astrocyttene og AWESAM, og immunostaining av ALDH1L1, som en cytoplasmatiske enzym, avslører flere detaljer enn cellen cytoskjelett protein GFAP (figur 2B).
Bortsett fra den RNA og protein uttrykket, astrocyttene i vivo vise spontan Ca2 + signalering (dvs.uten ytre stimulering), men mangekantet MD astrocyttene i vitro krever ofte stimulering å lokke fram Ca2 + signalnettverk, f.ekslegge til ATP eller glutamat. AWESAM astrocyttene utstilling spontan Ca2 + signalering i vivo, både cellen legemer og fine prosesser, som kan visualiseres virally transducing celler med den membran målrettede Lck-GCaMP3 (Figur 3). Spontan bølger av Ca2 + gjennom tilstøtende astrocyttene også oppstå (Figur 3A). Astrocytic Ca2 + signalering (Figur 3B) i fine prosesser og microdomains kan analyseres ved hjelp freeware gjelder astrocyttene13.
Figur 1 : Protokollen tidslinjen. En tidslinje viser de viktigste trinnene av AWESAM-protokollen, inkludert tiden det tar for å utføre disse trinnene på DIV0 (dag av disseksjon), DIV7 (dag av passasje), og hva du kan forvente på senere tidspunkt. Den grønne boksen viser når celler kan høstes som astrocyttene og stellate, der det er lysere versus mørkere nyanser representerer mindre mer komplekse stellate morfologi og forfall, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Medium bestemmer morfologi. (A) skjematisk viser hvordan astrocytter morfologi endres når co kultivert med neurons (som beskrevet tidligere4) vs dyrket som monokulturer, og avhengig av mediet. Astrocytter-spesifikk farging med GFAP skisserer stellate morfologi i co kultivert og AWESAM astrocyttene og mangekantede morfologi i MD astrocyttene. (B) GFAP etiketter MD astrocyttene skisserer sterkere enn ALDH1L1, og ALDH1L1 (men ikke GFAP) fine prosessene av astrocyttene og AWESAM. Verken astrocytter monokultur utstillinger neuronal merket MAP2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Spontan Ca2 + signalering i astrocyttene. (A) GCaMP-transduced AWESAM astrocyttene utstillingen spontan Ca2 + arrangementer gjennom hele astrocytter nettverk, inkludert i tynne prosesser (pilspisser). En Ca2 + bølge reiser gjennom flere astrocyttene fra venstre til høyre i bilder fra forskjellige tidspunkt, hvor lys viser områder av høye Ca2 + konsentrasjoner, og svarte områder representerer ekstracellulære regioner. Bildene ble anskaffet med levende celle AC confocal mikroskopi. (B) Ca2 + konsentrasjoner endres i fargekodede områdene i (A) over tid, vises som GCaMP fluorescens intensitet spor som illustrerer hvordan en Ca2 + signalering bølge sprer seg over flere astrocyttene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fire trinn i protokollen er avgjørende: 1) forbereder HBEGF konsentrasjonen til nøyaktig 5 ng/mL, siden små økninger i konsentrasjon kan føre til umodne kulturer, f.eks10 ng/mL HBEGF vil de skille astrocyttene4; 2) unngå bobler i løsninger som inneholder vev eller celler som kan endre pH og hindre astrocytter helse; 3) pre-equilibrating media å oppnå optimal pH og temperaturen for dyrking av sunn astrocyttene; 4) utveksle bare halve medium en gang i uken fordi noen gjenværende microglia er mindre sannsynlig å spre når tilstrekkelig næringsstoffer finnes og mediet er utvekslet regelmessig8 (selv om ingen microglia ble funnet i AWESAM kulturer så langt). For det siste punktet er det viktig å merke seg at astrocytter-avledet faktorer i kulturen ikke bør være helt fjernet, som de kan støtte astrocytic overlevelse, differensiering og spredning.
Det er viktig å bruke DIV14 eller eldre kulturer som modne astrocytter kilde (men signaltransduksjon eller hva hva, tidligere kulturer kan brukes) fordi astrocyttene yngre enn DIV14 har fortsatt nevrale stamceller potensielle9. For viral transduction, blandet kulturer av neurons og astrocyttene transduced på DIV7 (ved hjelp adeno-assosiert virus) effektivt uttrykke virally transduced GFP10. For plasmider transfection, brukes ofte astrocyttene og DIV10-DIV24 og fluorophore-merket proteiner fotografert 2-5 dager senere11. I vår erfaring fungerer både viral signaltransduksjon og plasmider transfection best hvis astrocyttene er transduced mellom DIV9 og DIV14. Hva og signaltransduksjon effektiviteten avhenger av konstruksjon og metode, men vi finner at hva effektivitet er ~ 20% i astrocytter monokulturer bruker lipofectamine hva, og adeno-assosiert virus (AAV) signaltransduksjon effektivitet er ~ 90% ( se vår tidligere arbeid4 for ytterligere detaljer, f.eks, konstruere brukes). Når transducing astrocyttene AAV partikler og transfecting av lipofectamine, tillates vi minst 5 og 2 dager, henholdsvis for uttrykk for Konstruer. Før signaltransduksjon eller hva, skal astrocyttene også tillates å gjenopprette for minst én dag etter passaging.
Videre når forbereder kulturer sammenligne RNA/protein uttrykk på ulike tidspunkt peker, kulturer kan være belagt på forskjellige tettheter å oppnå lignende mengder materiale, f.eks, astrocytter monokulturer høstes på DIV7 og DIV21 kan være belagt på tettheter på 1 x 106 og 500.000 celler per 10 cm rett, henholdsvis. For eksempel vil hele protein lysate avkastningen være rundt 0,5 mg/mL på DIV14 når høstet etter først plating 500.000 AWESAM astrocyttene på en 10 cm rett.
AWESAM protokollen representerer en rask, enkel og rimelig måte å kultur astrocyttene isolert fra neurons men med in vivo-som kjennetegner RNA og protein uttrykk, morfologi og Ca2 + signalering4, som så langt tilbys av ingen andre protokoller. AWESAM astrocyttene kan brukes for analyser som er typisk for cellen kulturstudier, inkludert immunocytochemistry, immunoblotting, RNA uttrykk analyse, TIRF mikroskopi og Ca2 + tenkelig4. Nylige fremskritt innen genetisk kodet Ca2 + indikatorer tillate spesielt visualisere fine astrocytic prosesser enn klassisk Ca2 + fargestoffer14. Ca2 + signalering vesicula opptak og exocytosis i både tykke og tynne astrocytic prosesser er fysiologisk relevant, som disse prosessene kan påvirke hjernefunksjon for trophic støtte, blodstrøm, synaptic signalering og plastisitet, og intercellulære kommunikasjon. AWESAM protokollen tillater for studier av fine astrocytic prosessene relevante for hjernen fysiologi15 og sykdom16,17, neuronal innblanding og med stor tilgjengelighet som i vitro kultur forsyninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi erkjenner finansiering fra europeiske forskningsråd (FP7/260916), Alexander von Humboldt-Stiftung (Sofja Kovalevskaja) og den tyske Forschungsgemeinschaft (DE1951 og SFB889).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | warm in 37 ºC waterbath before use |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | warm in 37 ºC waterbath before use |
| B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | 50X stock |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 100X stock |
| Penicillin / streptomycin | Gibco | 15070-063 | 50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 µg/ml |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | without L-glutamine |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| HBEGF | Sigma | 4643 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HBSS | Gibco | 14170112 | |
| FCS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | 1X |
| 100 μm nylon cell strainer | BD | 352360 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Hera Cell 240i cell culture incubator | |
| Laboratory shaker | Heidolph | Rotamax 120 | use inside cell culture incubator |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R |
References
- Puschmann, T. B., et al. Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells. Glia. 61 (3), 432-440 (2013).
- Puschmann, T. B., et al. HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins. J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Wolfes, A. C., et al. A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes. J Gen Physiol. 149 (4), (2016).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
- Krencik, R., Zhang, S. -C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).
- Morita, M., et al. Dual regulation of calcium oscillation in astrocytes by growth factors and pro-inflammatory cytokines via the mitogen-activated protein kinase cascade. J Neurosci. 23 (34), 10944-10952 (2003).
- Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).
- Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55 (2), 165-177 (2007).
- Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Res. 1190, 15-22 (2008).
- Malarkey, E. B., Parpura, V. Temporal characteristics of vesicular fusion in astrocytes: examination of synaptobrevin 2-laden vesicles at single vesicle resolution. J Physiol. 589, Pt 17 4271-4300 (2011).
- Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. J Neurosci. 2 (18), 6391-6410 (2012).
- Srinivasan, R., et al. Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).
- Shigetomi, E., et al. Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses. J Gen Physiol. 141 (5), 633-647 (2013).
- Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Otsu, Y., et al. Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling. Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).
- Agarwal, A., et al. Transient Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Induces Microdomain Calcium Transients in Astrocyte Processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).
