Summary
Burada açıklanan AWESAM iletişim kuralı diğer beyin hücreleri izolasyonu fare astrocytes bir hızlı, basit ve ucuz şekilde kültür için en iyi yöntemdir. AWESAM astrocytes spontan Ca2 + sinyal, morfoloji ve gen ifade profilleri için astrocytes vivo içindebenzer sergi.
Abstract
AWESAM (bir low- easy stellate birstrocyte malınan mal) protokolü üzerine kuruludur vivo içindebüyük miktarlarda üretmek için hızlı, basit ve ucuz bir yol-fare ve sıçan astrocyte monocultures hangi tarihlerde : Beyin hücreleri farklı beyin bölgelerden izole olabilir ve hücre kültürü bir hafta sonra astrositik olmayan hücreleri bir shaker kuluçka 6 h için Tarih kültür yemekleri yerleştirerek sarsılmış. Kalan astrocytes sonra yeni kalıplara (NB + H olarak adlandırılan) bir astrocyte özgü orta ile pasajlı. NB + H heparin bağlama EGF benzeri büyüme faktörü (HBEGF), serum orta yerine kullanılan düşük konsantrasyonlarda içerir. NB + H içinde büyüyen sonra AWESAM astrocytes Yildiz Seklinde bir morfoloji ve özellik iyi işlemler var. Dahası, bu astrocytes daha fazla vivo içindevar-tarihlerde gen ekspresyonu daha önceden yayınlanmış yöntemlerle üretilen astrocytes. CA2 + görüntüleme, vezikül dinamikleri ve diğer olaylar membran yakın böylece iyi astrositik süreçleri vitroiçinde canlı hücre confocal veya TIRF mikroskobu kullanarak örneğin, okudu olabilir. Özellikle, AWESAM astrocytes da astrocytes içinde vivoiçin benzer sinyal spontan Ca2 + sergi.
Introduction
Astrocytes trofik desteği, kan akımı, sinaptik sinyal ve plastisite ve hücreler arası iletişim - tüm bunların etrafında ince astrositik süreçleri Merkezi mekanizmalar aracılığıyla beyin fonksiyonlarını etkiler. Burada açıklanan AWESAM Protokolü nöronlar ve yararlı örneğin, birçok protein ve hatta Ca2 + sinyal ifadesi farklı beyin hücre boyunca örtüşme olan diğer glia müdahale olmadan bu süreçlerin çalışma sağlar türleri. Ayrıca, bu yöntem daha önce kullanılan tekniklerin sınırlamalar üstesinden gelir. Özellikle, vivo içindebizim iletişim kuralı sağlar-Morfoloji (Yildiz Seklinde astrocytes ince süreçleri ile) ve bir hızlı, kolay, gen ekspresyonu ve ucuz şekilde gibi.
Doğrudan hücre morfolojisi, gen ekspresyonu ve birçok diğer düzenleyici işlemler çevre tarafından etkilenmiştir. Bir kültür tabak içinde bu faktörler tarafından çevreleyen hücreleri, aynı zamanda hangi hücreleri yetiştirilmektedir orta serbest ifade eder. Astrocytes, HBEGF bir Yildiz Seklinde Morfoloji1 ikna etmek için daha önce bildirildi ancak aynı zamanda astrocytes2de-ayırt etmek için bulunamadı. Ancak, düşük konsantrasyonlarda HBEGF, daha sonra daha fazla vivo içindeoluşturmak için kullanılmıştır-RNA sıralama iki farklı protokol3,4ile tanımlandığı gibi hangi tarihlerde astrocytes. Ayrıca, bağımsız olarak protokolü4orta bileşimi ile astrocyte Morfoloji değiştirir: Neurobasal orta HBEGF bir düşük konsantrasyon ile diğer Orta besteleri (örneğin, süre Yildiz Seklinde astrocytes yetiştirmek için en uygun Serum DMEM içeren) poligonal hücrelerde (hatta astrocytes taze immunopanning tarafından izole) üretmek.
AWESAM Protokolü dezavantajları astrocyte monocultures4büyüyen için önceki teknikleri üstesinden gelir. Astrocyte monocultures büyüyen için önceki teknikleri var aşağıdaki dezavantajları: Yildiz Seklinde astrocytes vivo içinde (MD yöntemi)5/; alışılmadık poligonal Morfoloji uzunluk ve maliyet (astrocytes İndüklenmiş pluripotent kök hücreler alır üzerinden üç ay hazırlık ve pahalı büyüme faktörleri de dahil olmak üzere birçok reaktifler gerektirir) Protokolü'nün6; malzeme (immunopanning yöntemi)3düşük miktarda; ve astrocytes de-farklılaşma ve gereksinimi 3D matris (Puschmann ve ark.) 1 , 2. buna ek olarak, AWESAM Protokolü sağlar: vivo-tarihlerde Morfoloji (ince süreçleri ile Yildiz Seklinde astrocytes); hızlı, kolay ve ucuz yöntemi; malzeme büyük miktarlarda; ve en vivo içinde-gen ekspresyonu immunopanned ve MD astrocytes ile karşılaştırıldığında hangi tarihlerde. Ayrıca, Ca2 + sinyal ve vezikül ince işlemler ve olaylar membran yakın geri dönüşüm çalışması için 2D kültür sağlar (örneğin, TIRF mikroskobu 3D kültürlerde mümkün değildir).
MD yöntemi yayımı 19805poligonal astrocyte monocultures teknik bir basit ve hızlı sunan, beri yaygın olarak kullanılmış. Kısacası, MD yöntemi (FCS) fetal buzağı Serumda büyüyen karışık beyin hücreleri üzerine kuruludur-DMEM, içeren takip (olarak diğer tüm beyin hücresi türleri çanak ayırmak) için astrocytes zenginleştirmek ve daha fazla kültür aynı ortamda basamaklarının sallayarak. FCS ile desteklenmiş DMEM farklı kanser hücre satırlarına tüm bunların MD astrocytes kültür tarafından sergilenen poligonal Morfoloji paylaşmak, fibroblastlar ve adiposit arasında değişen birçok hücre tipleri için kullanılır. Kadar erken 2000'lerde7, küçük düşünce olmuştu astrocytes için uygun bir ortama verilen, özellikle onların tipik Yildiz Seklinde Morfoloji lehine içinde vivobuldu. 2011 yılında yayınlanan bir protokol ulaşmak böyle Yildiz Seklinde Morfoloji: immunopanning yöntemi olarak adlandırılan, serum-Alerjik orta astrocytes3kültür için en iyi duruma getirilmiş kullanır. Bu yöntemi kullanarak, taze izole beyin hücreleri bir dizi hücre türüne özgü hücre yüzey proteinleri astrocytes için zenginleştirmek için hedef antikorlar ile kaplı yemekleri sunulur. Daha fazla vivo içinderağmen-immunopanned astrocytes morfoloji ve ifade profil gibi vitro çalışmalar çoğunluğu hala MD astrocyte yönteme güvenmek. İmmunopanning yöntemi daha karmaşık ve zaman alıcı adımlar kültür ilk gününde kapsar MD yöntemi basit ve hızlı, iken (uzun enzim sindirim süre gibi çözümleri farklı yoğunluk, immunopanning kendisi, dikkatli katmanlama ve çeşitli aralıklarla adımlar - kaplama tüm önce). Ancak, daha özel orta kullanarak, AWESAM yöntemi her iki hızını MD yöntemi ve in vivosunar-tarihlerde immunopanning Protokolü morfolojisi.
Genel olarak, AWESAM Protokolü daha fazla vivo içindeçalışmak için yararlıdır-tarihlerde astrocytes 2D monocultures neurons ve diğer glia (immunostainings, immunoblots ve RNA sıralama tarafından daha önce karakterize4 ) olarak izole içinde. Bu ince astrositik işlemler çalışma için izin verir ve spontan Ca2 + sinyal ve olaylar (tarafından TIRF mikroskobu görüntüsüörneğin,) membran yakın görüntülenmesi için büyük erişilebilirlik sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm hayvan deneyleri Alman hayvan refahı için kurallar uyarınca gerçekleştirilmiştir.
Not: Zaman çizelgesi ve protokol ana adımları şekil 1' de gösterilmiştir.
1. hazırlıkları
-
Aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
- DMEM + poligonal MD astrocytes kültür için hazırlamak: % 10 FCS, 100 U penisilin ve 100 µg/mL streptomisin ile DMEM.
- NB + H Yildiz Seklinde astrocytes kültür için hazırlamak: 5 ng/mL HBEGF, 1 x B-27 ek, 1 x glutamin takviyesi, 100 U penisilin ve 100 µg/mL streptomisin ile neurobasal orta.
Not: HBEGF daha yüksek konsantrasyonlarda Aliquots hazırlanan ve gerektiğinde Orta olarak eklenecek-20 ° C'de depolanan. - Diseksiyon orta (10 mM HBSS HEPES) hazırlayın.
- Aliquots 6-7 ml % 0.05 tripsin-EDTA ve 6-7 mL % 0.25 tripsin-EDTA 15 mL tüpler hazır olun. Bunlar-20 ° C'de depolanan ve bir 37 ° C su Banyosunda çözdürülen.
- İletişim kuralı, başlamadan önce gün 10 cm doku kültürü tedavi bulaşıkta %0,04 polyethylenimine (PEI) her 5 mL kat.
- Ertesi gün, PEI kaldırmak ve iki kez deiyonize, distile su ile bulaşık. DMEM + 12 mL her plakasına ekleyin ve hücreleri kaplama daha önce 37 ° C ve % 5 CO2 kuluçka için en az 30 dk önceden equilibrate.
- Diseksiyon alan hazırlamak: bir laminar akış diseksiyon başlık, yer iki 10 cm Petri yemekler diseksiyon orta buz dolu. Her beyin alanını için izole (örneğin, korteks, Hipokampus), 15-tüp 14 mL diseksiyon orta ile dolu hazırlamak ve buz üzerinde tutun. Diseksiyon araçları (iyi makas, Dumont #3 ve #5 forseps) % 70 etanol ve yere karar diseksiyon mikroskop kapüşonlu ile sprey.
2. fare veya fare beyin diseksiyon
Not: Her iki fareler ve sıçanlar-ebilmek var olmak kullanılmış. P8-da var olmak kullanılmış daha yaşlı hayvanlar (biz P12 kadar test), ama meninkslerde kaldırma giderek daha zor olacak. Beyin hücreleri büyük hayvanlardan karmaşık işlemler ve doku ayrılma, artan hücre ölümüne giden sırasında kırılabilir bağlantıları kurdu beri Ayrıca, hücre verim ve sağlık, azalacak. Kortikal hazırlıkları burada açıklanan, ancak diğer beyin bölgeleri de kullanılabilir.
- % 0.05 tripsin-EDTA bir 37 ° C su banyosunda yerleştirin.
- Hayvanlar (gebe rats E19 pups veya P0-P8 hayvanlar için) yavaş yavaş CO2 konsantrasyonu yükselterek ötenazi ve beyin yalıtır. Aşağıdaki adımları steril tekniği gerektirir.
-
Eğer embriyonik dokuyla çalışma, önce embriyoların rahim kaldırın ve embriyonik keseleri açın sonra hemen kafalarını makasla kesme. Tüm başkanları kesilir, onları önceden soğutulmuş diseksiyon orta aktarın.
- Bir kez belgili tanımlık mezartaşı ortamda batık, forseps ve beyincik kapalı çimdik cilt ve kafatası (her ikisi de çok genç hayvanlarda yumuşak) açın. Dikkatle kolu yukarı ve dışarı kafatası beyin geri kalanı.
Not: 2-4 E19 embriyo kortikal astrocytes çanak başına 500.000 hücre, diseksiyon gününde kaplama, en az sekiz 10 cm yemekler için yeterince doku verim.
- Bir kez belgili tanımlık mezartaşı ortamda batık, forseps ve beyincik kapalı çimdik cilt ve kafatası (her ikisi de çok genç hayvanlarda yumuşak) açın. Dikkatle kolu yukarı ve dışarı kafatası beyin geri kalanı.
- Eski veya yeni doğan yavruları için kafalarını makasla kesmek ve hemen cilt kafasının arkasından düz bir çizgi burnun ucu için kesim tarafından beyin yalıtır. Kafatasının sol ve sağ, sonra kafatası kemik Asansör bir kenara ve dikkatle kesilmiş deri çek. Beyincik kesme ve yukarı ve dışarı kafatası beyin diğer kol.
Not: 2-3 P0-P8 pups kortikal astrocytes çanak başına 500.000 hücre, diseksiyon gününde kaplama, en az sekiz 10 cm yemekler için yeterince doku verim. - Korteks temel orta yapısından ayrı. Forseps hemisferlerin arasında boyuna çatlak içinde yer sonra hareket forseps bir Yarımküre (boyuna çatlak dikey) korteks ve orta yapıları arasında her hemisphere ücretsiz çimdik için.
- Forseps kullanarak her hemisphere (ve onun Hipokampus) tüm meninkslerde çıkarın, sonra hippocampi ayrı. Hipokampal astrocytes gerekiyorsa, her Hipokampus 14 mL diseksiyon orta buz dolu bir 15 mL tüp içine taşıyın.
- Özel bölgeler gerekli (örneğin, frontal korteks) daha fazla alanlarda her hemisphere'nın korteks kaldırın. 1 mm3daha büyük parçalara astrocytes oluşturmak için kullanılacak kortikal herhangi bir doku kes. Diseksiyon orta buz dolu ayrı bir 15 mL tüp kortikal doku tüm parçaları toplamak.
3. doku sindirim ve ayrılma
- Bir kez tüm doku parçaları toplanır, tüp altına yerleşmek bekleyip sonra mümkün olduğu kadar orta Aspire edin.
- 2-3 mL % 0.05 tripsin-EDTA serolojik pipet kullanarak ekleyin ve 20 dakika 37 ° C su banyosu tüplerde kuluçkaya.
Not: tüm tripsin-EDTA hızla doku parçaları karıştırın ve tekrar yerleşmek için izin vermek için pipet üzerinden yayın. - Dikkatle tripsin-EDTA, tüpün dibinde mümkün olduğunca küçük sıvı olarak doku parçalar halinde bırakarak Aspire edin.
- Kalan tripsin EDTA yıkamak için önceden soğutulmuş diseksiyon orta 5 mL ekleyin. Üst kısmındaki doku parçaları karıştırma ulaşmak için tüp tarafına pipet.
- Diseksiyon orta Aspire edin ve doku parçalar halinde mümkün olduğunca küçük sıvı olarak bırakın. Önceden soğutulmuş diseksiyon orta iki kez daha fazla ile bu çamaşır tekrarlayın.
- Son yıkama adımdan sonra istimal DMEM + (oda sıcaklığına kadar ısındı) 1.000 µL pipet ucu ve triturate pipetting tarafından doku ve kabarcıklar tanıtımı olmadan aşağı 1 mL ekleyin.
Not: bu-ebilmek değişmek belgili tanımlık eriyik, hangi astrocytes oldukça duyarlı olan pH gibi bu kabarcıklar, üreten önlemek önemlidir. - 50 mL tüp açılış 100 µm hücre süzgeç koyun ve önceden soğutulmuş DMEM + 4.5 mL filtresiyle önceden ıslak.
- Disosiye doku süspansiyon hücre süzgeç üzerine 1 mL pipette ve başka bir 4.5 mL ekleyin önceden soğutmalı hücreleri hücre süzgeç aracılığıyla yıkamak için + DMEM.
4. hücre kaplama Passaging tarafından Astrocyte zenginleştirme için
- Örneğin, hücreleri hücre süspansiyon 10 µL trypan mavi ile 10 µL sulandrarak ve karışımı bir hemasitometre üzerine pipetting saymak.
- 12 mL DMEM + 10 cm çanak başına 500.000 hücrelerde plaka.
Not: DMEM + astrositik büyüme için yararlıdır nöronlar veya microglia için daha çok. Sallayarak sırasında cam coverslips kuyu içinde hareket eden fiziksel güçleri çok bu 10 cm yemekleri (coverslips) olmadan oyunculuk daha güçlü. Hücreleri 24-şey Tabaklarda sarsıldı, onlar sağlıksız hale veya ölmek. Sadece plaka astrocytes sallayarak sonra 24-şey plakaları. - Hücre kültürleri da kuluçka makinesine 37 ° C ve % 5 CO2 ' de yedi gün boyunca tutun.
- Gün 6, adım 5'te açıklandığı gibi kültür PEI kaplı plakalar gün sallayarak ve hücreleri, passaging önce hazırlayın.
5. passaging hücreleri
-
Bir gün önce passaging, hücre kültürü plakaları %0,04 PEI ile kat.
- İmmunocytochemistry, viral iletim veya plazmid transfection (her bir steril 12 mm veya 25 mm cam coverslip, sırasıyla içeren) 24-şey veya 6-şey tabak kullanın.
- Cam coverslips % 70 etanol en az 1 h için kuluçka tarafından sterilize etmek, sonra üç kere coverslips wells yerleştirmeden önce deiyonize, distile suda yıkayın.
- En az 70 µL %0,04 PEI başına 24-şey tabak 12 mm coverslip ve 600 µL %0,04 PEI 25 mm coverslip 6-şey tabak içinde başına ekleyin.
- Western blot ya da RNA-Seq analiz için zaten sonra diseksiyon hücreleri içeren 10 cm yemekleri kullanmaya devam edebilirsiniz. Yemekleri sadece sarsılmış gerekir, sonra hücreleri 1 x PBS ile yıkanmış ve NB + H ile tedavi (yeni yemekleri aktarmak).
- Gün vitro (DIV) 7 sonra diseksiyon, 10 cm yemekleri hücreleri ile DMEM + bir laboratuvar shaker kuluçka üzerine yerleştirin ve yemekleri 6 h için 110 rpm'de sallamak.
- PEI deiyonize, distile su ile kaplı coverslips üzerinden kapalı iki kez yıkayın. NB + H orta plakaları (24-şey plakaları için ve iyi 6-şey plakaları için başına 2 mL başına 500 µL) ekleyin. Plakayı kuluçka 37 ° C ve 10 cm yemekleri titriyor iken % 5 CO2 veya en az 30 dk önceden equilibrate.
- 20-30 dk 6 h sallayarak sona ermeden önceden 1 x PBS, DMEM +, NB + H ve % 0.25 tripsin-EDTA 37 ° c su banyosunda ısıtın.
- 6 h sallayarak, kültür yemekleri shaker almak ve (içeren nöronlar sarsılmış kapalı, oligodendrocytes ve microglia) orta ile 10 mL yerini alması sonra çanak başına 1 x PBS önceden ısıttı.
Not: Hemen yeniden bağlama astrositik olmayan hücreleri önlemek için ayrılmış hücreleri içeren eski orta Aspire edin önemlidir. - PBS kaldırın ve 3 mL Önceden ısıtılmış tripsin-EDTA çanak başına ekleyin. Her yemeğin 4 dk. 37 ° C ve % 5 CO2kuluçka için kuluçkaya.
Not: Western blot veya RNA-Seq için numune hazırlama, tripsin-EDTA ekleyerek değil. Bunun yerine, eski yerine koymak PBS 12 mL ile NB + H, sonra da kuluçka makinesine kültürler yerleştirilebilir önceden ısındı. - 5 Önceden ısıtılmış DMEM + 3 mL tripsin-EDTA her için çanak, hücreleri 5 mL serolojik pipet kullanarak çanak dışına pipette ve hücre süspansiyon 50 mL tüp içinde toplamak mL ekleyin.
Not: Pipet çanak - altından doğrudan kat yemeğin hücreleri ayırmak gibi daha net hale gelmelidir. Serum tripsin inaktive gibi sadece serum içeren orta (yerine DMEM +), kullanın. - Hücre süspansiyon 3,220 x g 4 dk 20 ° C'de, santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant kaldırmak ve resuspend hücre Pelet 1 ml NB + H önceden ısıttı.
6. hücre kaplama son Astrocyte kültürler için
- Hücreleri saymak.
- 6-iyi tabak (ortamda 2 mL NB + H iyi başına) bir kuyu başına 20.000 hücre veya 24-şey tabak (ortamda 500 µL NB + H iyi başına) bir kuyu başına 5000 hücre plaka.
- Hücre kültürleri da kuluçka makinesine 37 ° C ve % 5 CO2 de daha ileri tedavi veya analiz kadar tutun.
- Yarım orta haftada bir değişimi.
Not: Düşük besin ortamlarda Proliferasyona astrocytes durmak ama her ne kadar (deneyim, yok microglia AWESAM kültürde ortaya çıktı) kalan herhangi bir microglia çoğalırlar. Yarım orta bir kez bir hafta herhangi bir potansiyel olarak kalan microglia8zenginleştirme engeller ve monocultures en az üç hafta boyunca sağlıklı kalmak alışverişi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nöronlar ile birlikte kültürlü ve NB + ortamda yetiştirilen astrocytes 2 hafta sonra kültür (Şekil 2) Yildiz Seklinde görünür. NB + orta ek olarak, ortak kültür astrocytes de büyük olasılıkla onların hayatta kalma ve Morfoloji katkıda bilinmeyen nöron kaynaklı faktörler maruz kalır. Buna ek olarak, MD astrocytes DMEM + (diğer hücre tipleri geçiş önce kapalı sallayarak sonra) monocultures yetiştirilen 2 hafta sonra poligonal görünür. AWESAM astrocytes sallayarak sonra NB + H içinde yetiştirilen kültür 2 hafta sonra çok iyi işlemlerle Yildiz Seklinde görünür.
Biz daha önce RNA ifade profil AWESAM astrocytes, MD ve immunopanned astrocytes4' e göre astrocytes vivo içinde'e daha yakın olduğunu gösterdi. Astrocyte özel protein ifade açısından, kortikal astrocytes ALDH1L1 düzeyi yüksek ve düşük seviyelerde GFAP'nin vivo içinde12ifade eder. Bu da AWESAM astrocytes için geçerlidir ve sitoplazmik bir enzim olarak ALDH1L1 immunostaining hücre iskeleti protein GFAP'nin (Resim 2B) daha ince detay ortaya koymaktadır.
RNA ve protein ifade kenara astrocytes vivo gösterir (örneğin, dış stimülasyon olmadan) sinyal spontan Ca2 + ama poligonal MD astrocytes vitro kez Ca2 + temin için stimülasyon gerektiren sinyal verme, örneğin, ATP veya Glutamat ekleyerek. AWESAM astrocytes in vivo, hücre organları ve virally hücre membran hedefli Lck-GCaMP3 (şekil 3) ile transducing tarafından görüntülenmiştir iyi süreçler, sinyal spontan Ca2 + sergi. Ca2 + bitişik astrocytes boyunca kendiliğinden dalgaları da (şekil 3A) oluşur. İyi süreçler ve microdomains (şekil 3B) sinyal astrositik Ca2 + ücretsiz astrocytes13için belirli kullanılarak analiz edilebilir.
Resim 1 : İletişim kuralı zaman çizelgesi. DIV0 üzerinde aşağıdaki adımları gerçekleştirmek için gereken zaman da dahil olmak üzere AWESAM protokolünün ana adımları gösteren bir zaman çizelgesi (kandan gün), DIV7 (gün geçiş) ve ne daha sonra zaman noktalarda sunuyoruz. Nerede hafif karşı hücreleri Yildiz Seklinde astrocytes hasat edilebilir yeşil kutunun gösterilmiştir koyu tonları sırasıyla karşı daha karmaşık Yildiz Seklinde morfoloji ve vade ise, daha az temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Orta belirler Morfoloji. (A)şematik nasıl astrocyte Morfoloji değişir gösterilen vs monocultures olarak yetiştirilen ve orta bağlı (yukarıda açıklanan4) olarak nöronlar ile birlikte kültürlü. Astrocyte özel GFAP'nin ana hatları ile Yildiz Seklinde Morfoloji boyama co kültürlü ve AWESAM astrocytes ve poligonal Morfoloji MD astrocytes içinde. (B) GFAP'nin etiketleri MD astrocytes daha güçlü ALDH1L1 ve ALDH1L1 (ama değil GFAP'nin) AWESAM astrocytes iyi süreçleri özetliyor. Ben de astrocyte Monokültür nöronal işaretçiyi MAP2 sergiler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Astrocytes içinde sinyal spontan Ca2 + . (A) GCaMP transduced AWESAM astrocytes sergi spontan Ca2 + olaylar boyunca ince süreçlerinde (ok uçları) dahil olmak üzere astrocyte ağlar. Bir Ca2 + dalga birkaç astrocytes soldan sağa doğru seyahat görüntüler farklı zaman noktalarından, nerede açık renk gösteriyor yüksek Ca2 + konsantrasyonları alanlarında ve siyah alanları temsil eden hücre dışı bölgeler. Görüntüleri canlı hücre confocal mikroskobu kullanılarak elde. (B) Ca2 + konsantrasyonları (a) renk kodlu bölgelerde nasıl yayılır dalga sinyali bir Ca2 + arasında birkaç astrocytes göstermek GCaMP floresan yoğunluğu izleri olarak gösterilen saat içinde değiştirin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokol içinde dört adım kritik: 1) konsantrasyonu küçük artışlar olgunlaşmamış kültürler için örneğin, neden olabilir beri tam 5 ng/ml, HBEGF konsantrasyon hazırlanıyor 10 ng/mL HBEGF astrocytes4; de-ayırt 2) doku veya pH değiştirebilir ve astrocyte sağlık engel hücreleri içeren çözümler kaçınmak kabarcıkları; 3) en uygun pH ve sıcaklık sağlıklı astrocytes büyüyen için elde etmek için ortam sıcaklığına önceden; 4) (hiçbir microglia bulundu, ancak AWESAM kültürlerde defa) sadece yarısı orta haftada bir kez kalan herhangi bir microglia olduğu için daha az yeterli besin varsa ve orta, çoğalırlar olasılığı alışverişi8 düzenli olarak değiştirdim. Bu son nokta için astrocyte kaynaklı faktörler kültür içinde tamamen kaldırılması gerektiğini değil, astrositik hayatta kalma, farklılaşma ve yaygın desteklemiyor olabilir gibi unutmamak önemlidir.
DIV14 veya eski kültürler olgun astrocyte kaynağı olarak kullanılması önemlidir (ancak iletim veya transfection adımlar için önceki kültürler kullanılabilir) astrocytes DIV14 küçük, hala sinir kök hücre potansiyel9var çünkü. Viral iletim için kültürler nöronlar ve DIV7 üzerinde transduced astrocytes karışık GFP10transduced (adeno ilişkili virüs virally verimli bir şekilde ifade kullanarak). Plazmid transfection için DIV10-DIV24 astrocytes sık sık kullanılan ve proteinler fluorophore öğesini görüntüsü 2-5 gün sonra11. Astrocytes DIV9 ve DIV14 arasında transduced Eğer deneyim, viral iletim ve plazmid transfection en iyi çalışır. Transfection ve iletim verimliliği yapı ve yöntemi üzerinde bağlıdır, ama biz transfection verimliliği % ~ 20 içinde lipofectamine transfection kullanarak astrocyte monocultures ve adeno ilişkili virüs (AAV) iletim verimliliği olduğunu ~ %90 () bulmak daha fazla bilgi, örneğin, kullanılır yapısı için önceki bizim iş4 bkz.). AAV parçacıklar ve lipofectamine tarafından transfecting ile astrocytes transducing, biz en az 5 ve 2 gün, sırasıyla, inşa ifade için izin. İletim veya transfection önce astrocytes da passaging sonra en az bir gün için kurtarmak için izin verilmelidir.
Ayrıca, kültür farklı zamanda RNA/protein ifadesi karşılaştırmak için hazırlanıyor geldiğinde, malzeme, örneğin, DIV7 hasat için astrocyte monocultures benzer miktarda elde etmek için farklı yoğunlukları, kültürleri kaplama ve DIV21 olabilir 1 x 106 ve 10 cm çanak, başına 500.000 hücre yoğunlukları, sırasıyla kaplama. Örneğin, tüm protein lysate verim 0,5 mg/mL üzerinde ne zaman başlangıçta bir 10 cm çanak üzerinde 500.000 AWESAM astrocytes kaplama sonra hasat DIV14 civarında olacak.
AWESAM Protokolü temsil eden bir hızlı, basit ve ucuz yol kültür astrocytes izolasyon nöronlar ama içinde vivo-RNA ve protein ifade, morfoloji ve4, sinyal verme Ca2 + özellikleri hangi tarihlerde hangi şimdiye kadar hiçbir diğer iletişim kuralı tarafından sağlanır. AWESAM astrocytes immunocytochemistry, immunoblotting, RNA ifade analizi, TIRF mikroskobu ve Ca2 + görüntüleme4de dahil olmak üzere hücre kültür çalışmalar için tipiktir analizleri için kullanılabilir. Özellikle, genetik olarak kodlanmış Ca2 + göstergeleri son gelişmeler daha ayrıntılı klasik Ca2 + boya14daha iyi astrositik işlemlerin görüntülenmesi için izin verir. CA2 + sinyal, veziküler alımı ve kalın ve ince astrositik süreçlerde ekzositozu fizyolojik ilgili, bu işlemler açısından trofik destek, kan akımı, sinaptik sinyal ve plastisite, beyin fonksiyonları etkileyebilecek gibi ve hücreler arası iletişim. AWESAM Protokolü iyi astrositik işlemler çalışma için beyin fizyolojisi15 ve hastalık16,17, nöronal müdahale olmadan ve büyük erişilebilirlik ile ilgili o içinde vitro sağlar Kültür malzemeleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Avrupa Araştırma Konseyi (FP7/260916), Alexander von Humboldt-Stiftung (Sofja Kovalevskaja) ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE1951 ve SFB889) fon kabul.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | warm in 37 ºC waterbath before use |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | warm in 37 ºC waterbath before use |
| B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | 50X stock |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 100X stock |
| Penicillin / streptomycin | Gibco | 15070-063 | 50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 µg/ml |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | without L-glutamine |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| HBEGF | Sigma | 4643 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HBSS | Gibco | 14170112 | |
| FCS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | 1X |
| 100 μm nylon cell strainer | BD | 352360 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Hera Cell 240i cell culture incubator | |
| Laboratory shaker | Heidolph | Rotamax 120 | use inside cell culture incubator |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R |
References
- Puschmann, T. B., et al. Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells. Glia. 61 (3), 432-440 (2013).
- Puschmann, T. B., et al. HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins. J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Wolfes, A. C., et al. A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes. J Gen Physiol. 149 (4), (2016).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
- Krencik, R., Zhang, S. -C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).
- Morita, M., et al. Dual regulation of calcium oscillation in astrocytes by growth factors and pro-inflammatory cytokines via the mitogen-activated protein kinase cascade. J Neurosci. 23 (34), 10944-10952 (2003).
- Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).
- Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55 (2), 165-177 (2007).
- Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Res. 1190, 15-22 (2008).
- Malarkey, E. B., Parpura, V. Temporal characteristics of vesicular fusion in astrocytes: examination of synaptobrevin 2-laden vesicles at single vesicle resolution. J Physiol. 589, Pt 17 4271-4300 (2011).
- Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. J Neurosci. 2 (18), 6391-6410 (2012).
- Srinivasan, R., et al. Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).
- Shigetomi, E., et al. Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses. J Gen Physiol. 141 (5), 633-647 (2013).
- Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Otsu, Y., et al. Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling. Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).
- Agarwal, A., et al. Transient Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Induces Microdomain Calcium Transients in Astrocyte Processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).
