Summary
Het AWESAM protocol beschreven hier is optimaal voor het kweken van lymfkliertest astrocyten los van andere hersencellen in een snelle, eenvoudige en goedkope manier. AWESAM astrocyten vertonen spontane Ca2 + signalering, morfologie en gene expressieprofielen vergelijkbaar met de astrocyten in vivo.
Abstract
De AWESAM (een low-kosten eRoe stellate eenstrocyte method) protocol leidt tot een snelle, eenvoudige en goedkope manier voor het genereren van grote hoeveelheden van in-vivo-muis en rat Astrocyt monoculturen zoals : De hersencellen kunnen worden geïsoleerd uit verschillende hersengebieden, en na een week van celkweek, niet-astrocytic cellen zijn afgeschud door het plaatsen van de gerechten van de cultuur in een roteerapparaat gedurende 6 uur in de incubator. De resterende astrocyten zijn vervolgens gepasseerd in nieuwe platen met een Astrocyt-specifieke medium (zogenaamde NB + H). NB + H bevat lage concentraties van heparine-bindende EGF-achtige groeifactor (HBEGF), die wordt gebruikt in plaats van serum in medium. Na een groei in NB + H, hebben AWESAM astrocyten een Notti morfologie en functie prima processen. Bovendien, deze astrocyten hebben meer in-vivo-graag genexpressie dan astrocyten gegenereerd door eerder gepubliceerde methoden. CA2 + imaging, blaasje dynamiek en andere gebeurtenissen dichtbij het membraan kunnen dus worden bestudeerd in de fijne astrocytic processen in vitro, bijvoorbeeldmet behulp van levende cellen confocal of TIRF microscopie. Met name vertonen AWESAM astrocyten ook spontane Ca2 + signalering vergelijkbaar met de astrocyten in vivo.
Introduction
Astrocyten beïnvloeden hersenfunctie door trofische ondersteuning, doorbloeding, synaptic signaling en plasticiteit en intercellulaire communicatie - die allemaal mechanismen die centrum rond de dunne astrocytic processen. Het protocol van de AWESAM die hier worden beschreven kunt de studie van deze processen zonder inmenging van neuronen en andere glia, die nuttige bv, omdat de expressie van veel eiwitten en zelfs Ca2 + signalering overlappen in verschillende hersenen cel typen. Verder is deze methode overwint beperkingen van de voorheen beschikbare technieken. In het bijzonder onze protocol voorziet in vivo-zoals morfologie (Notti astrocyten met dunne processen) en genexpressie in een snelle, gemakkelijk, en goedkope wijze.
Cel morfologie, genuitdrukking en vele andere regelgevende processen worden rechtstreeks beïnvloed door het milieu. In een cultuur schotel verwijst dit naar de factoren die zijn vrijgegeven door de omringende cellen, maar ook het medium waarin de cellen worden gekweekt. Voor astrocyten, HBEGF voorheen werd gerapporteerd voor het opwekken van een Notti morfologie1 maar ook om te-onderscheiden astrocyten2werd gevonden. Echter lagere concentraties van HBEGF werden later gebruikt voor het genereren van meer in-vivo-evenals de astrocyten geïdentificeerd met behulp van RNA sequencing in twee verschillende protocollen3,4. Bovendien Astrocyt morfologie verandert met de middellange samenstelling, ongeacht het protocol4: Neurobasal medium met een lage concentratie van HBEGF is optimaal voor het kweken van Notti astrocyten, terwijl andere middellange composities (b.v. serum-bevattende DMEM) produceren veelhoekige cellen (zelfs in astrocyten vers geïsoleerd door immunopanning).
Het AWESAM-protocol overwint nadelen van vorige technieken voor het kweken van Astrocyt monoculturen4. Vorige technieken voor het kweken van Astrocyt monoculturen hebben de volgende nadelen: veelhoekige morfologie, die ongebruikelijk van Notti astrocyten in vivo (methode MD)5; de lengte en kosten van protocol (voorbereiding van astrocyten van geïnduceerde pluripotente stamcellen duurt drie maanden en vereist veel reagentia, met inbegrip van dure groeifactoren)6; de lage hoeveelheid materiaal (methode immunopanning)3; de ambtshalve differentiatie van astrocyten en eis van een 3D matrix (Puschmann et al.) 1 , 2. daarentegen het AWESAM-protocol biedt: in vivo-graag morfologie (Notti astrocyten met dunne processen); een snel, eenvoudig, en goedkope methode; grote hoeveelheden materiaal; en het meest in vivo-graag genexpressie vergeleken met immunopanned en MD astrocyten. Bovendien, 2D cultuur zorgt voor de studie van Ca2 + signalering en vesikel recycling in dunne processen, en in gebeurtenissen dichtbij het membraan (b.v.TIRF microscopie is niet mogelijk in 3D culturen).
De MD-methode werd uitvoerig gebruikt sinds haarbekendmaking in 19805, biedt een eenvoudige en snelle techniek voor veelhoekige Astrocyt monoculturen. Kortom, de MD-methode met zich meebrengt groeiende gemengde hersencellen in foetaal kalfsserum (FCS)-bevattende DMEM, gevolgd door schudden van de stappen die verrijken voor astrocyten (als alle andere hersenen cel typen van de schotel loskoppelen) en verder cultuur in hetzelfde medium. DMEM aangevuld met FCS wordt gebruikt voor veel andere celtypen, variërend van fibroblasten en adipocytes tot verschillende kanker cellijnen, die allemaal de veelhoekige morfologie tentoongesteld door MD astrocyten bij cultuur delen. Tot de vroege 2000s7, weinig gedachte hadden gegeven aan media op maat van astrocyten, specifiek om de gunst van hun typische Notti morfologie gevonden in vivo. Één protocol gepubliceerd in 2011 het bereiken van dergelijke Notti morfologie: de immunopanning-methode aangeroepen, er werken serumvrij medium geoptimaliseerd voor het kweken van astrocyten3. Met behulp van deze methode, worden vers geïsoleerde hersencellen blootgesteld aan een aantal gerechten bekleed met antilichamen die gericht zijn op cel type-specifieke cel-oppervlakte eiwitten, te verrijken voor de astrocyten. Ondanks de meer in-vivo-net als morfologie en expressie profiel van immunopanned astrocyten, de meerderheid van in vitro studies nog steeds beroepen op de MD Astrocyt methode. De MD-methode is eenvoudig en snel, terwijl de immunopanning methode meer complexe en tijdrovende stappen op de eerste dag van cultuur omvat (zoals spijsvertering voor langere enzym, zorgvuldige gelaagdheid van oplossingen van verschillende dichtheid, immunopanning zelf, en verschillende centrifugeren stappen - allemaal voordat plating). Met behulp van meer gespecialiseerde medium, de AWESAM-methode biedt echter zowel de snelheid van de MD-methode en de in-vivo-graag morfologie van het immunopanning-protocol.
Globaal, het AWESAM-protocol is handig voor studeren meer in-vivo-graag astrocyten in 2D monoculturen geïsoleerd van neuronen en andere glia (als eerder gekarakteriseerd4 door immunostainings en immunoblots RNA sequencing). Het voorziet in de studie van dunne astrocytic processen, en biedt grote toegankelijkheid voor het visualiseren van spontane Ca2 + signalering en evenementen dichtbij het membraan (bvbeeld door TIRF microscopie).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven die hier beschreven werden uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren voor de Duitse dierenwelzijn.
Opmerking: De tijdlijn en de belangrijkste stappen van het protocol worden geïllustreerd in Figuur 1.
1. voorbereiding
-
De volgende oplossingen voor te bereiden.
- Voorbereiden DMEM + veelhoekige MD astrocyten kweken: DMEM met 10% FCS, 100 U penicilline en 100 µg/mL streptomycine.
- Bereiden NB + H voor het kweken van Notti astrocyten: neurobasal medium met 5 ng/mL HBEGF, 1 x B-27 supplement, 1 x glutamine supplement, 100 U penicilline en 100 µg/mL streptomycine.
Opmerking: Aliquots van hogere concentraties van HBEGF kunnen worden voorbereid en opgeslagen bij-20 ° C worden toegevoegd aan het medium wanneer nodig. - Het bereiden van het medium van de dissectie (10 mM HEPES in HBSS).
- Bereid hoeveelheden van 6-7 mL trypsine-EDTA 0,05% en 6-7 mL 0,25% trypsine-EDTA in 15 mL tubes. Deze kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C en in een waterbad 37 ° C ontdooid.
- De dag voordat het protocol, jas 10 cm Weefselkweek behandeld gerechten met 5 mL 0,04% polyethylenimine (PEI) elke.
- De volgende dag, verwijder de PEI en de afwas met gedeïoniseerd, gedestilleerd water tweemaal. 12 mL DMEM + toevoegen aan elke plaat en equilibreer vooraf in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 voor minstens 30 min voordat plating cellen.
- Voorbereiden van de dissectie-gebied: In een laminaire flow dissectie kap, plaats twee 10 cm petrischalen gevuld met dissectie medium op ijs. Voor elk gebied van de hersenen worden geïsoleerd (b.v., schors, hippocampus) bereiden een 15-buis gevuld met 14 mL dissectie medium en houden op ijs. Spray dissectie tools (fijne schaar, Dumont #3 en #5 verlostang) met 70% ethanol en plaats naast dissectie Microscoop in de kap.
2. rat of muis hersendissectie
Opmerking: Beide muizen en ratten kunnen worden gebruikt. Dieren ouder dan P8 ook gebruikt worden kan (we getest tot P12), maar het verwijderen van de hersenvliezen steeds moeilijker zal worden. Verder is zal de opbrengst van de cel en de gezondheid afnemen, aangezien hersencellen van oudere dieren zal hebben gevormd ingewikkelde processen en verbindingen die tijdens weefsel dissociatie breken kunnen, wat leidt tot toegenomen celdood. Corticale preparaten worden hier beschreven, maar andere hersengebieden kunnen ook worden gebruikt.
- Trypsine-EDTA 0,05% in een waterbad 37 ° C te plaatsen.
- Euthanaseren van dieren (zwangere ratten voor E19 pups of P0-P8 dieren) door het langzaam verhogen van CO2 -concentratie en isoleren van de hersenen. De volgende stappen moet steriele techniek.
-
Als werken met embryonaal weefsel, eerst de embryo's uit de baarmoeder te verwijderen en de embryonale zakjes open, dan onmiddellijk afgesneden het hoofd met een schaar. Wanneer alle hoofden zijn afgesneden, ze vervolgens overbrengen naar vooraf gekoelde dissectie medium.
- Zodra de hoofden zijn ondergedompeld in het medium, open de huid en de schedel (beide zijn erg zacht bij jonge dieren) met pincet en snuifje uit het cerebellum. Zorgvuldig hendel de rest van de hersenen en buiten de schedel.
Opmerking: Twee tot vier E19 embryo's opleveren genoeg weefsel voor ten minste acht 10 cm schotels van corticale astrocyten uitplaten aan 500.000 cellen per schotel op de dag van de dissectie.
- Zodra de hoofden zijn ondergedompeld in het medium, open de huid en de schedel (beide zijn erg zacht bij jonge dieren) met pincet en snuifje uit het cerebellum. Zorgvuldig hendel de rest van de hersenen en buiten de schedel.
- Voor pasgeboren of oudere pups, afgesneden van de hoofden met schaar en isoleren van de hersenen door het mediaal snijden van de huid in een rechte lijn vanaf de achterkant van het hoofd tot het puntje van de neus. Trek de huid opzij en zorgvuldig gesneden de schedel links en rechts, dan lift de schedel been omhoog. Afgesneden van het cerebellum en de rest van de hersenen en buiten de schedel hefboom.
Opmerking: Twee tot drie P0-P8 pups opbrengst genoeg weefsel voor ten minste acht 10 cm schotels van corticale astrocyten uitplaten aan 500.000 cellen per schotel op de dag van de dissectie. - De cortex te scheiden van de onderliggende structuur van de veroorzaakt. Plaatsen van de verlostang binnen de longitudinale horizontalis tussen de hemisferen, verplaats de verlostang tussen de schors en veroorzaakt structuren van een halfrond (loodrecht op de longitudinale horizontalis) naar elk halfrond gratis knijpen.
- Met behulp van de verlostang, verwijder alle hersenvliezen van elk halfrond (en de hippocampus), dan scheiden van de hippocampi. Als hippocampal astrocyten vereist zijn, verplaatst u elk hippocampus in een tube van 15 mL gevuld met 14 mL dissectie medium op ijs.
- Verwijder de verder gebieden van elk halfrond de cortex als specifieke regio's zijn vereist (bijvoorbeeldfrontale cortex). Snijd elke corticale weefsel moet worden gebruikt voor het genereren van astrocyten in stukken niet groter zijn dan 1 mm,3. Verzamel alle stukken van corticale weefsel in een aparte 15 mL-buis gevuld met dissectie medium op ijs.
3. de weefsels spijsvertering en dissociatie
- Zodra alle weefsel stukken worden verzameld, wachten voor ze om af te wikkelen naar de onderkant van de buis, dan zoveel medium mogelijk gecombineerd.
- Voeg 2-3 mL 0,05% trypsine-EDTA met behulp van een precisiepipet serologische en Incubeer de buizen in een waterbad 37 ° C gedurende 20 minuten.
Opmerking: Laat alle trypsine-EDTA uit de pipet snel naar Meng de stukjes weefsel en laat opnieuw regelen. - Zorgvuldig gecombineerd de trypsine-EDTA, weefsel stukken in verlaten als weinig vloeistof mogelijk te maken, aan de onderkant van de buis.
- Voeg 5 mL van vooraf gekoelde dissectie middellange tot het afwassen van de resterende trypsine-EDTA. Pipetteer aan de zijkant van het bovenste gedeelte van de buis om de vermenging van de stukjes weefsel.
- Het medium van de dissectie gecombineerd, en laat de stukjes weefsel in als weinig vloeistof mogelijk. Herhaal deze stap wassen met vooraf gekoelde dissectie medium tweemaal meer.
- Na de definitieve wassen stap, voeg 1 mL DMEM + (opgewarmd tot kamertemperatuur) met behulp van een 1.000 µL pipette uiteinde, en triturate het weefsel door pipetteren op en neer zonder bubbels.
Opmerking: Het is belangrijk om te voorkomen dat de productie van bubbels, als dit de pH van de oplossing veranderen kan, waarbij de astrocyten erg gevoelig zijn. - Plaats een 100 µm cel zeef in de opening van een tube van 50 mL en vooraf natte het filter met 4.5 mL pre gekoelde DMEM +.
- Pipetteer de 1 mL van gedissocieerde weefsel schorsing op de cel zeef en voeg een ander 4.5 mL pre gekoeld DMEM + te wassen van de cellen door de zeef van de cel.
4. cel Plating voor Astrocyt verrijking door Passaging
- Tellen de cellen, bijvoorbeeld, door te verdunnen 10 µL van de celsuspensie met 10 µL trypan blauw en pipetteren de mix op een hemocytometer.
- Plaat 500.000 cellen in 12 mL DMEM + per 10-cm schotel.
Opmerking: DMEM + is nuttig voor astrocytic groei, meer nog dan voor neuronen of microglia. Tijdens het schudden zijn de fysieke krachten die op glas coverslips in putten veel sterker dan die op de gerechten van de 10-cm (zonder coverslips). Als cellen worden geschud op 24-Wells-platen, ze worden ongezond of sterven. Alleen plaat astrocyten op 24-Wells-platen na schudden. - Houden celculturen in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 voor zeven dagen.
- Op dag 6, eergisteren schudden en passaging cellen, bereiden de cultuur PEI-gecoate platen zoals beschreven in stap 5.
5. passaging cellen
-
Eergisteren passaging, jas cel cultuur platen met 0,04% PEI.
- Gebruik voor immunocytochemie, virale transductie of plasmide transfectie, 24-well of 6-well platen (elk met een gesteriliseerde 12 mm of 25 mm glas dekglaasje aan, respectievelijk).
- Steriliseren van de glazen coverslips in incubatie in 70% ethanol voor ten minste 1 uur, dan drie keer in gedeïoniseerd, gedestilleerd water wassen alvorens de coverslips in de putjes.
- Voeg ten minste 70 µL 0,04% PEI per 12-mm dekglaasje aan in 24-Wells-platen, en 600 µL 0,04% PEI per 25 mm dekglaasje aan in 6-Wells-platen.
- Voor westelijke vlek of RNA-Seq analyse blijven de gerechten van de 10 cm al met de cellen na de dissectie kunnen worden gebruikt. Gerechten hoeft alleen te worden geschud, dan de cellen zijn met 1 x PBS gewassen en behandeld met NB + H (niet overdragen aan nieuwe gerechten).
- Op de dag in vitro (DIV) 7 na de dissectie, plaats van de 10-cm schotels met cellen in DMEM + op een laboratorium shaker in de incubator en schud de gerechten bij 110 t/min gedurende 6 uur.
- Afwassen tweemaal de PEI van gecoate coverslips met gedeïoniseerd, gedestilleerd water. NB + H medium toevoegen aan de platen (500 µL per putje voor 24-Wells-platen en 2 mL per putje voor 6-Wells-platen). Vooraf equilibreer de platen in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 terwijl de 10 cm schotels zijn schudden, of voor ten minste 30 min.
- 20-30 min voor het einde van de 6 h schudden, warme vooraf 1 x PBS, DMEM +, NB + H en 0,25% trypsine-EDTA tot 37 ° C in het waterbad.
- Na 6 uur schudden, de cultuur gerechten opstijgen de shaker en onmiddellijk vervangen het medium (dat bevat geschud-off neuronen en oligodendrocyten, microglia) met 10 mL pre opgewarmd 1 x PBS per schotel.
Opmerking: Het is belangrijk dat het onmiddellijk gecombineerd het oude medium met vrijstaande cellen om te voorkomen dat de niet-astrocytic cellen opnieuw koppelen. - Verwijder van de PBS en voeg 3 mL voorverwarmde trypsine-EDTA per schotel. Elke schotel voor 4 min in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2uit te broeden.
Opmerking: Als voorbereiding van monsters voor westelijke vlek of RNA-Seq, Voeg geen trypsine-EDTA. In plaats daarvan, vervang de PBS met 12 mL pre opgewarmd NB + H, waarna kunnen culturen terug in de incubator worden geplaatst. - Voeg 5 mL voorverwarmde DMEM + aan de 3 mL trypsine-EDTA in elke schotel, Pipetteer de cellen uit de schotel met behulp van een serologische 5 mL-pipet en verzamelen van de celsuspensie in een tube van 50 mL.
Opmerking: Pipet direct vanaf de onderkant van de schotel - de verdieping van de schotel moet duidelijker worden als de cellen los. Gebruik alleen serum-bevattende medium (in plaats van DMEM +), zoals serum trypsine inactiveert. - Centrifugeer de celsuspensie bij 3220 x g bij 20 ° C gedurende 4 minuten.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 mL van de cel vooraf opgewarmd NB + H.
6. cel Plating voor definitieve Astrocyt culturen
- Cellen tellen.
- Plaat 20.000 cellen per putje in 6-Wells-platen (in 2 mL NB + H gemiddeld per putje) of 5.000 cellen per putje in 24-Wells-platen (in NB + H-medium van de 500 µL per putje).
- Houd de celculturen in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 tot verdere behandeling of analyse.
- Wisselen van helft het medium eenmaal per week.
Opmerking: In lage-nutriënt omgevingen, astrocyten prolifererende maar alle resterende microglia zal vermenigvuldigen (hoewel in onze ervaring, geen microglia in AWESAM culturen verscheen). Uitwisseling van de helft van het medium eenmaal per week verrijking van ieder potentieel overige microglia8 voorkomt, en de monoculturen gezond gedurende ten minste drie weken blijven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Astrocyten die mede gekweekt met neuronen en geteeld in NB + medium weergegeven Notti na 2 weken van cultuur (Figuur 2). Naast NB + medium, de mede gekweekte astrocyten ook blootgesteld aan onbekende neuron-afgeleide factoren die waarschijnlijk aan hun voortbestaan en morfologie bijdragen. In tegenstelling, verschijnen MD astrocyten gegroeid in DMEM + als monoculturen (na het afschudden van andere celtypes voor passage) veelhoekige na 2 weken. AWESAM astrocyten gegroeid in NB + H na schudden, verschijnen Notti met veel fijne processen na 2 weken van cultuur.
Wij eerder toonde aan dat het profiel van de expressie RNA van AWESAM astrocyten dichter bij die van astrocyten in vivo in vergelijking met MD en immunopanned astrocyten4. In termen van Astrocyt-specifieke eiwit expressie express corticale astrocyten hoge niveaus van ALDH1L1 en lage niveaus van GFAP in vivo12. Dit geldt ook voor AWESAM astrocyten, en de immunokleuring van ALDH1L1, als een cytoplasmatische enzym, onthult fijner detail dan de cytoskeletal proteïne GFAP (Figuur 2B).
Afgezien van de RNA en eiwit expressie, astrocyten in vivo Toon spontane Ca2 + signalering (dat wil zeggen, zonder externe stimulatie), maar veelhoekige MD astrocyten in vitro vereisen vaak stimulatie te ontlokken Ca2 + signalering, bijvoorbeelddoor het toevoegen van ATP of glutamaat. AWESAM astrocyten vertonen spontane Ca2 + signalering in vivo, in zowel cel organen en fijne processen, die kunnen worden gevisualiseerd door viraal transducing cellen met de membraan-gerichte Lck-GCaMP3 (Figuur 3). Spontane golven van Ca2 + in aangrenzende astrocyten ook optreden (Figuur 3A). Astrocytic Ca2 + signalering (Figuur 3B) in fijne processen en microdomains kunnen worden geanalyseerd met behulp van freeware specifiek voor astrocyten13.
Figuur 1 : Protocol tijdlijn. Een tijdlijn tonen de belangrijkste stappen van het AWESAM-protocol, met inbegrip van de tijd die nodig is voor het uitvoeren van deze stappen op DIV0 (dag van de dissectie), DIV7 (dag van passage), en wat te verwachten op latere tijdstippen. Het groene vak illustreert wanneer cellen kunnen worden geoogst als Notti astrocyten, waar lichter versus donkerder tinten vertegenwoordigen minder ten opzichte van de meer complexe Notti morfologie en rijpheid, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Medium bepaalt morfologie. (A) schematisch weergegeven hoe Astrocyt morfologie verandert als mede gekweekt met neuronen (zoals eerder beschreven4) vs. als monoculturen geteeld, en afhankelijk van het medium. Astrocyt-specifieke kleuring met GFAP schetst de Notti morfologie in co gekweekt en AWESAM astrocyten, en de veelhoekige morfologie in MD astrocyten. (B) GFAP etiketten MD astrocyten sterker dan ALDH1L1, en ALDH1L1 (maar niet GFAP) schetst de fijne processen van de astrocyten AWESAM. Noch Astrocyt monocultuur vertoont de neuronale markering MAP2. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Spontane Ca2 + signalering in astrocyten. (A) GCaMP-getransduceerde AWESAM astrocyten tentoonstelling spontane Ca2 + gebeurtenissen in de gehele Astrocyt netwerken, inclusief in de dunne processen (pijlpunten). Een Ca2 + Golf reist door verschillende astrocyten van links naar rechts in beelden van verschillende tijdstippen, waar lichte kleur schildert gebieden van hoge Ca2 + concentraties, en zwarte gebieden extracellulaire regio's vertegenwoordigen. Beelden werden verkregen met behulp van levende cellen confocale microscopie. (B) Ca2 + concentraties wijzigen in de gekleurde gebieden in (A) na verloop van tijd, weergegeven als GCaMP fluorescentie intensiteit sporen die hoe een Ca2 illustreren + signalering Golf verspreidt over verschillende astrocyten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vier stappen in het protocol zijn van cruciaal belang: 1) voorbereiding van de concentratie van de HBEGF tot precies 5 ng/mL, aangezien kleine stijging van de concentratie tot onvolwassen culturen, bijvoorbeeld leiden kunnen10 ng/mL HBEGF-zal onderscheiden astrocyten4; 2) vermijden bubbels in de oplossingen die bevatten van weefsels of cellen, die kunnen veranderen van de pH en belemmeren Astrocyt gezondheid; 3) vooraf zo media om de optimale pH en temperatuur voor de teelt van gezonde astrocyten; 4) uitwisseling van slechts de helft van het medium eenmaal per week omdat elke resterende microglia zijn minder waarschijnlijk te verspreiden wanneer voldoende voedingsstoffen aanwezig zijn en het medium is uitgewisseld regelmatig8 (hoewel geen microglia waren tot nu toe gevonden in AWESAM culturen). Voor dit laatste punt is het belangrijk op te merken dat Astrocyt-afgeleide factoren binnen de cultuur moeten niet worden geheel verwijderd, aangezien ze astrocytic overleven, differentiatie en proliferatie steunen kunnen.
Het is belangrijk DIV14 of oudere culturen als de volwassen Astrocyt-bron wilt gebruiken (maar voor transductie of transfectie stappen, eerdere culturen kunnen worden gebruikt) omdat astrocyten jonger dan DIV14 nog neurale stamcellen potentiële9. Voor virale signaaltransductie, gemengde culturen van neuronen en astrocyten getransduceerde op DIV7 getransduceerde (met behulp van adeno-geassocieerde virussen) efficiënt uitdrukkelijke viraal GFP10. Voor plasmide transfectie, DIV10-DIV24 astrocyten worden vaak gebruikt en fluorophore-gelabelde proteïnen beeld 2-5 dagen later11. In onze ervaring werken zowel virale transductie en plasmide transfectie het beste als astrocyten zijn getransduceerde tussen DIV9 en DIV14. De transfectie en transductie efficiëntie is afhankelijk van de constructie en de methode, maar we vinden dat transfectie efficiëntie is ~ 20% in Astrocyt monoculturen met behulp van lipofectamine transfectie en adeno-associated virus (AAV) transductie efficiëntie (~ 90% Zie onze eerdere werk4 voor verdere details, bijvoorbeeld, construct gebruikt). Wanneer astrocyten met AAV deeltjes en transfecting door lipofectamine transducing, mogen we ten minste 5 en 2 dagen, respectievelijk voor de expressie van de constructie. Voordat transductie of transfectie, moeten de astrocyten ook kunnen herstellen voor ten minste één dag na de passaging.
Bovendien, wanneer culturen voor het vergelijken van RNA/eiwit expressie op ander moment voorbereiden aanwijst, culturen kunnen worden uitplaten aan verschillende dichtheden te bereiken van vergelijkbare bedragen van materiaal, bijvoorbeeld, Astrocyt monoculturen om te worden geoogst op DIV7 en DIV21 kunnen uitplaten aan dichtheid van 1 x 106 en 500.000 cellen per 10-cm schotel, respectievelijk. Bijvoorbeeld, zullen de hele eiwit lysate opbrengst rond 0,5 mg/mL op DIV14 wanneer geoogst na aanvankelijk plating 500.000 AWESAM astrocyten op een 10-cm schotel.
Het AWESAM-protocol is een snelle, eenvoudige en goedkope manier om cultuur astrocyten bij isolatie van neuronen maar met in-vivo-kenmerken van RNA en eiwit expressie, morfologie en Ca2 + 4, signalering zoals die tot nu toe wordt verzorgd door geen andere protocol. AWESAM astrocyten kunnen worden gebruikt voor analyses die typerend zijn voor cel Cultuurwetenschappen, met inbegrip van immunocytochemie, immunoblotting, RNA expressie analyse, TIRF microscopie en Ca2 + imaging4. Recente vooruitgang in genetisch gecodeerde Ca2 + indicatoren kunnen in het bijzonder voor het visualiseren van fijne astrocytic processen in meer detail dan de klassieke Ca2 + kleurstoffen14. CA2 + signalering, vesiculaire opname en exocytose in zowel de dikke en de dunne astrocytic processen is fysiologisch relevant, aangezien deze processen kunnen beïnvloeden hersenfunctie in termen van trofische ondersteuning, doorbloeding, synaptic signaling en plasticiteit, en intercellulaire communicatie. Het AWESAM-protocol voorziet in de studie van de fijne astrocytic processen relevant is voor de hersenen fysiologie15 en ziekte16,17, zonder inmenging van de neuronale en met de grote toegankelijkheid die in vitro cultuur leveringen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij erkennen dat financiële steun van de European Research Council (KP7/260916), de Alexander von Humboldt-Stiftung (Sofja Kovalevskaja) en de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE1951 en SFB889).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | warm in 37 ºC waterbath before use |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | warm in 37 ºC waterbath before use |
| B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | 50X stock |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 100X stock |
| Penicillin / streptomycin | Gibco | 15070-063 | 50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 µg/ml |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | without L-glutamine |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| HBEGF | Sigma | 4643 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HBSS | Gibco | 14170112 | |
| FCS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | 1X |
| 100 μm nylon cell strainer | BD | 352360 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Hera Cell 240i cell culture incubator | |
| Laboratory shaker | Heidolph | Rotamax 120 | use inside cell culture incubator |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R |
References
- Puschmann, T. B., et al. Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells. Glia. 61 (3), 432-440 (2013).
- Puschmann, T. B., et al. HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins. J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Wolfes, A. C., et al. A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes. J Gen Physiol. 149 (4), (2016).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
- Krencik, R., Zhang, S. -C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).
- Morita, M., et al. Dual regulation of calcium oscillation in astrocytes by growth factors and pro-inflammatory cytokines via the mitogen-activated protein kinase cascade. J Neurosci. 23 (34), 10944-10952 (2003).
- Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).
- Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55 (2), 165-177 (2007).
- Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Res. 1190, 15-22 (2008).
- Malarkey, E. B., Parpura, V. Temporal characteristics of vesicular fusion in astrocytes: examination of synaptobrevin 2-laden vesicles at single vesicle resolution. J Physiol. 589, Pt 17 4271-4300 (2011).
- Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. J Neurosci. 2 (18), 6391-6410 (2012).
- Srinivasan, R., et al. Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).
- Shigetomi, E., et al. Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses. J Gen Physiol. 141 (5), 633-647 (2013).
- Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Otsu, Y., et al. Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling. Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).
- Agarwal, A., et al. Transient Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Induces Microdomain Calcium Transients in Astrocyte Processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).
