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Neuroscience

तेज, सरल, और सस्ती AWESAM प्रोटोकॉल का उपयोग कर Vivo-like Murine Astrocytes मेंसंवर्धन

Published: January 10, 2018 doi: 10.3791/56092
Automatic Translation
1,2,3, 3
1Chemical Biology, Chemistry Research Laboratory, University of Oxford, 2Department of Physiology, Anatomy, and Genetics, University of Oxford, 3Trans-synaptic signaling, European Neuroscience Institute

Summary

AWESAM प्रोटोकॉल यहां वर्णित एक तेज, सरल, और सस्ती तरीके से अंय मस्तिष्क कोशिकाओं से अलगाव में संवर्धन murine astrocytes के लिए इष्टतम है । AWESAM astrocytes प्रदर्शन सहज सीए2 + सिग्नलिंग, आकृति विज्ञान, और जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल vivo मेंastrocytes के समान ।

Abstract

AWESAM (a low-लागत easy stellate astrocyte method) प्रोटोकॉल एक तेज, सरल, और सस्ता तरीका vivo-like माउस और चूहे astrocyte में बड़ी मात्रा मेंउत्पन्न करने के लिए जोर देता है monocultures : मस्तिष्क की कोशिकाओं को अलग मस्तिष्क क्षेत्रों से पृथक किया जा सकता है, और सेल संस्कृति के एक सप्ताह के बाद, गैर astrocytic कोशिकाओं को मशीन में 6 एच के लिए एक शेखर पर संस्कृति व्यंजन रखकर बंद हिल रहे हैं । शेष astrocytes तो एक astrocyte-विशिष्ट माध्यम के साथ नई प्लेटों में पारित कर रहे है (एनबी + एच) । एनबी + एच हेपरिन-बाध्यकारी EGF की तरह वृद्धि कारक (HBEGF) है, जो मध्यम में सीरम के स्थान पर प्रयोग किया जाता है की कम सांद्रता शामिल हैं । एनबी + एच में बढ़ के बाद, AWESAM astrocytes एक stellate आकृति विज्ञान और सुविधा ठीक प्रक्रियाओं है । इसके अलावा, इन astrocytes पहले प्रकाशित तरीकों से उत्पंन astrocytes की तुलना में vivoकी तरह जीन अभिव्यक्ति में अधिक है । सीए2 + इमेजिंग, पुटिका गतिशीलता, और झिल्ली के करीब अन्य घटनाओं इस प्रकार इन विट्रो मेंठीक astrocytic प्रक्रियाओं में अध्ययन किया जा सकता है, उदा, लाइव सेल फोकल या TIRF माइक्रोस्कोप का उपयोग. विशेष रूप से, AWESAM astrocytes भी vivo मेंastrocytes करने के लिए इसी तरह सहज सीए2 + संकेतन प्रदर्शन ।

Introduction

Astrocytes प्रभाव पौष्टिकता समर्थन, रक्त प्रवाह, synaptic संकेतन और प्लास्टिक के माध्यम से मस्तिष्क समारोह, और सेलुलर संचार-जो सभी तंत्र पतली astrocytic प्रक्रियाओं के आसपास है कि केंद्र हैं । AWESAM प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित न्यूरॉन्स और अन्य glia, जो उपयोगी है से हस्तक्षेप के बिना इन प्रक्रियाओं के अध्ययन की अनुमति देता है उदा, क्योंकि कई प्रोटीन की अभिव्यक्ति और यहां तक कि सीए2 + संकेत अलग मस्तिष्क कोशिका भर में ओवरलैप प्रकार. इसके अलावा, इस विधि पहले से उपलब्ध तकनीकों की सीमाओं पर काबू । विशेष रूप से, हमारे प्रोटोकॉल एक त्वरित, आसान, और सस्ते तरीके में vivo-like आकृति विज्ञान (पतली प्रक्रियाओं के साथ stellate astrocytes) और जीन अभिव्यक्ति मेंप्रदान करता है ।

कक्ष आकृति विज्ञान, जीन अभिव्यक्ति, और कई अंय नियामक प्रक्रियाओं सीधे पर्यावरण से प्रभावित हैं । एक संस्कृति डिश में, यह आसपास के कोशिकाओं द्वारा जारी कारकों को संदर्भित करता है, लेकिन यह भी माध्यम है जिसमें कोशिकाओं को उगाया जाता है । astrocytes के लिए, HBEGF पहले एक stellate आकृति विज्ञान1 प्रेरित करने के लिए सूचित किया गया था, लेकिन यह भी de-अंतर astrocytes2करने के लिए पाया गया. हालांकि, HBEGF की कम सांद्रता बाद में दो अलग प्रोटोकॉल3,4में आरएनए अनुक्रमण के माध्यम से की पहचान के रूप में vivo-like astrocytes मेंऔर अधिक उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया गया । इसके अलावा, माध्यम रचना के साथ astrocyte आकृति विज्ञान परिवर्तन, प्रोटोकॉल की परवाह किए बिना4: HBEGF की एक कम एकाग्रता के साथ Neurobasal माध्यम stellate astrocytes बढ़ने के लिए इष्टतम है, जबकि अन्य माध्यम रचनाएं (उदा., सीरम युक्त DMEM) बहुभुज कोशिकाओं का उत्पादन (यहां तक कि astrocytes हौसले से immunopanning द्वारा पृथक) ।

AWESAM प्रोटोकॉल पिछले तकनीक के नुकसान पर काबू astrocyte monocultures4बढ़ती के लिए । बढ़ती astrocyte monocultures के लिए पिछले तकनीक निम्नलिखित नुकसान है: बहुभुज आकृति विज्ञान, जो vivo में stellate astrocytes का विलक्षण है (एमडी विधि)5; प्रोटोकॉल की लंबाई और लागत (प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं से astrocytes तैयार करने में तीन महीने लगते हैं और कई रिएजेंटों की आवश्यकता होती है, जिनमें महंगे विकास कारक शामिल हैं)6; सामग्री की कम मात्रा (immunopanning method)3; और astrocytes के de-भिंनता और एक 3 डी मैट्रिक्स की आवश्यकता (Puschmann एट अल.) 1 , 2. इसके विपरीत, AWESAM प्रोटोकॉल प्रदान करता है: vivo मेंकी तरह आकृति विज्ञान (पतली प्रक्रियाओं के साथ stellate astrocytes); एक त्वरित, आसान, और सस्ते विधि; सामग्री की बड़ी मात्रा; और immunopanned और एमडी astrocytes के साथ तुलना में vivoकी तरह जीन अभिव्यक्ति में सबसे । इसके अतिरिक्त, 2d संस्कृति के अध्ययन के लिए अनुमति देता है Ca के2 + संकेत और पतली प्रक्रियाओं में पुटिका रीसाइक्लिंग, और घटनाओं में झिल्ली के करीब (जैसे, TIRF माइक्रोस्कोपी 3 डी संस्कृतियों में संभव नहीं है).

प्रबंध निदेशक विधि बड़े पैमाने पर किया गया है १९८०5में अपने प्रकाशन के बाद से, बहुभुज astrocyte monocultures के लिए एक सरल और तेजी से तकनीक की पेशकश की । संक्षेप में, एमडी विधि भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) में मिश्रित मस्तिष्क कोशिकाओं बढ़ जरूरत पर जोर देता है-DMEM युक्त, कदम है कि astrocytes के लिए समृद्ध (सभी अंय मस्तिष्क कोशिका प्रकार पकवान से अलग के रूप में) और एक ही माध्यम में आगे संस्कृति मिलाने के बाद । FCS के साथ पूरक DMEM कई अन्य प्रकार के सेल के लिए प्रयोग किया जाता है, fibroblasts और adipocytes से अलग कैंसर सेल लाइनों को लेकर, सभी जिनमें से सभी को संस्कृति में एमडी astrocytes द्वारा प्रदर्शित बहुभुज आकृति विज्ञान का हिस्सा. जल्दी-20007तक, थोड़ा सोचा था कि astrocytes के अनुरूप मीडिया को दिया गया है, विशेष रूप से अपने ठेठ stellate vivo मेंपाया विज्ञान के पक्ष में । एक २०११ में प्रकाशित प्रोटोकॉल ऐसी stellate आकृति विज्ञान प्राप्त करता है: immunopanning विधि कहा जाता है, यह सीरम मुक्त माध्यम संवर्धन astrocytes3के लिए अनुकूलित काम करते हैं । इस विधि का प्रयोग, हौसले से पृथक मस्तिष्क कोशिकाओं को एंटीबॉडी के साथ लेपित व्यंजन की एक श्रृंखला के लिए उजागर कर रहे हैं कि लक्ष्य सेल प्रकार विशिष्ट कोशिका सतह प्रोटीन, astrocytes के लिए समृद्ध करने के लिए. vivo मेंऔर अधिक के बावजूद immunopanned astrocytes की तरह आकृति विज्ञान और अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल, इन विट्रो अध्ययनों में से अधिकांश अभी भी MD astrocyte विधि पर भरोसा करते हैं । एमडी विधि सरल और तेज है, जबकि immunopanning विधि संस्कृति के पहले दिन पर अधिक जटिल और समय लेने वाले कदम शामिल (जैसे अब एंजाइम पाचन समय, अलग घनत्व के समाधान के सावधान layering, immunopanning ही, और कई केंद्रापसारक कदम-सभी चढ़ाना से पहले) । हालांकि, और अधिक विशेष माध्यम का उपयोग करके, AWESAM विधि एमडी विधि की गति और immunopanning प्रोटोकॉल के vivo-like आकृति विज्ञान मेंदोनों प्रदान करता है ।

कुल मिलाकर, AWESAM प्रोटोकॉल vivo मेंअधिक astrocytes की तरह 2d monocultures में अधिक अध्ययन के लिए उपयोगी है ंयूरॉंस और अंय glia से पृथक (के रूप में पहले immunostainings, immunoblots, और आरएनए अनुक्रमण द्वारा4 विशेषता) । यह पतली astrocytic प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, और सहज Ca2 + संकेत और झिल्ली (जैसे, TIRF माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged) के करीब घटनाओं visualizing के लिए महान पहुंच प्रदान करता है ।

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Protocol

यहां वर्णित सभी पशु प्रयोगों में जर्मन पशु कल्याण के लिए दिशानिर्देश के अनुसार प्रदर्शन किए गए ।

नोट: समयरेखा और प्रोटोकॉल के मुख्य चरण चित्र 1में सचित्र हैं ।

1. तैयारी

  1. निंन समाधान तैयार करें ।
    1. तैयार DMEM + संवर्धन बहुभुज एमडी astrocytes के लिए: DMEM 10% FCS, १०० यू पेनिसिलिन और १०० µ g/एमएल streptomycin के साथ ।
    2. संवर्धन stellate astrocytes: neurobasal मीडियम के साथ 5 एनजी/एमएल HBEGF, 1x बी-27 अनुपूरक, 1x glutamine पूरक, १०० यू पेनिसिलिन और १०० µ g/एमएल streptomycin के लिए एनबी + एच तैयार करें ।
      नोट: HBEGF के उच्च सांद्रता के Aliquots को तैयार किया जा सकता है और जब भी जरूरत हो, मध्यम में जोड़ा जा करने के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ।
    3. विच्छेदन मध्यम (HBSS में 10 मिमी HEPES) तैयार करें ।
    4. 15 मिलीलीटर ट्यूबों में ०.०५% trypsin-EDTA और 6-7 मिलीलीटर ०.२५% trypsin-EDTA की 6-7 मिलीलीटर की aliquots तैयार करें । इन पर संग्रहित किया जा सकता है-20 ° c और एक ३७ ° c पानी स्नान में गल ।
  2. प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले दिन, कोट 10 सेमी ऊतक संस्कृति-०.०४% polyethylenimine (पी) प्रत्येक की 5 मिलीलीटर के साथ बर्तन का इलाज किया ।
  3. अगले दिन, बेई को हटाने के लिए और बर्तन धोने के साथ, आसुत जल दो बार । DMEM के 12 मिलीलीटर + प्रत्येक प्लेट और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह पर मशीन में पूर्व equilibrate को जोड़ने के लिए कोशिकाओं को चढ़ाना से पहले ंयूनतम 30 मिनट के लिए2 ।
  4. विच्छेदन क्षेत्र तैयार करें: एक लामिना प्रवाह विच्छेदन हुड में, जगह २ १० सेमी पेट्री बर्तन बर्फ पर विच्छेदन माध्यम से भरा । प्रत्येक मस्तिष्क क्षेत्र के लिए पृथक किया जा करने के लिए (जैसे, प्रांतस्था, हिप्पोकैंपस), 14 मिलीलीटर विच्छेदन माध्यम से भरा एक 15-ट्यूब तैयार करें और बर्फ पर रखें । स्प्रे विच्छेदन उपकरण (ठीक कैंची, Dumont #3 और #5 संदंश) ७०% इथेनॉल के साथ और डाकू में विच्छेदन माइक्रोस्कोप के बगल में जगह है ।

2. चूहा या माउस मस्तिष्क विच्छेदन

नोट: चूहों और चूहों दोनों का इस्तेमाल किया जा सकता है । P8 से अधिक पुराने जानवरों का भी इस्तेमाल किया जा सकता है (हम P12 करने के लिए परीक्षण), लेकिन मेनिन्जेस को हटाने तेजी से मुश्किल हो जाएगा । इसके अलावा, कोशिका उपज और स्वास्थ्य कम हो जाएगा, के बाद से पुराने जानवरों से मस्तिष्क कोशिकाओं जटिल प्रक्रियाओं और कनेक्शन है कि ऊतक पृथक्करण के दौरान टूट सकता है का गठन किया जाएगा, बढ़ कोशिका मौत के लिए अग्रणी । Cortical तैयारियाँ यहाँ बताई गई हैं, लेकिन अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों का भी उपयोग किया जा सकता है.

  1. एक ३७ ° c पानी स्नान में ०.०५% trypsin-EDTA प्लेस ।
  2. Euthanize जानवरों (E19 पिल्ले के लिए गर्भवती चूहों, या P0-P8 जानवरों) धीरे से सह2 एकाग्रता स्थापना, और दिमाग को अलग. निंनलिखित चरणों बाँझ तकनीक की आवश्यकता है ।
  3. यदि भ्रूण के ऊतकों के साथ काम करना, पहले गर्भाशय से भ्रूण को हटाने और भ्रूण sacs खुला है, तो तुरंत कैंची से सिर काट । जब सभी सिर काट रहे हैं, उंहें पूर्व में स्थानांतरण-शांत विच्छेदन मध्यम ।
    1. एक बार सिर मध्यम में डूब रहे हैं, खुले त्वचा और खोपड़ी (दोनों युवा जानवरों में बहुत नरम हैं) संदंश के साथ और सेरिबैलम बंद चुटकी । ध्यान रहे लीवर मस्तिष्क के बाकी हिस्से और खोपड़ी के बाहर ।
      नोट: दो से चार E19 भ्रूण विच्छेदन के दिन पर पकवान प्रति ५००,००० कोशिकाओं पर चढ़ाया cortical astrocytes के कम से ८ १० cm व्यंजन के लिए पर्याप्त ऊतक उपज ।
  4. नवजात या पुराने पिल्ले के लिए, कैंची से सिर काट, और औसत रूप से नाक की नोक करने के लिए सिर के पीछे से एक सीधी रेखा में त्वचा को काटने के द्वारा दिमाग को अलग । त्वचा को एक तरफ खींचो और ध्यान से खोपड़ी को छोड़ दिया और सही काट, तो खोपड़ी की हड्डी उठा । सेरिबैलम काट, और लीवर मस्तिष्क के बाकी के ऊपर और खोपड़ी से बाहर ।
    नोट: दो से तीन P0-P8 पिल्ले के लिए पर्याप्त ऊतक उपज cortical astrocytes के दिन पर प्रति डिश ५००,००० कोशिकाओं पर चढ़ाया के कम से ८ १० मुख्यमंत्री व्यंजन ।
  5. अंतर्निहित midbrain संरचना से प्रांतस्था को पृथक करना । अनुदैर्ध्य विदर के भीतर संदंश को गोलार्द्धों के बीच रखें, फिर संदंश को एक गोलार्द्ध के प्रांतस्था और midbrain संरचनाओं के बीच में ले जाएं (सीधा अनुदैर्ध्य विदर के लिए) प्रत्येक गोलार्द्ध को मुक्त पिंच करने के लिए ।
  6. संदंश का उपयोग करके, प्रत्येक गोलार्द्ध (और उसके हिप्पोकैंपस) से सभी मेनिन्जेस को हटा दें, फिर hippocampi को अलग करें । यदि हिप्पोकैम्पस astrocytes की आवश्यकता हो, तो प्रत्येक हिप्पोकैंपस को 15 मिलीलीटर ट्यूब को 14 मिलीलीटर विच्छेदन मध्यम से बर्फ पर भर ले जाएं ।
  7. प्रत्येक गोलार्द्ध के प्रांतस्था से आगे के क्षेत्रों को निकालें यदि विशिष्ट क्षेत्रों की आवश्यकता हो (उदा., ललाट प्रांतस्था) । किसी भी cortical ऊतक में कटौती नहीं टुकड़े में astrocytes पैदा करने के लिए इस्तेमाल किया जा 1 मिमी3से बड़ा । एक अलग 15 मिलीलीटर बर्फ पर विच्छेदन मध्यम से भरा ट्यूब में cortical ऊतक के सभी टुकड़ों को इकट्ठा ।

3. ऊतक पाचन और पृथक्करण

  1. एक बार सभी ऊतक टुकड़े एकत्र कर रहे हैं, उन्हें ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए इंतजार, तो संभव के रूप में ज्यादा माध्यम के रूप में महाप्राण.
  2. जोड़ें ०.०५% trypsin की 2-3 मिलीलीटर-EDTA एक सीरम पिपेट का उपयोग कर, और 20 मिनट के लिए एक ३७ ° c पानी स्नान में ट्यूबों गर्मी ।
    नोट: ऊतक टुकड़े मिश्रण और फिर से बसने की अनुमति देने के लिए तेजी से पिपेट से सभी trypsin-EDTA रिलीज.
  3. ध्यान से महाप्राण trypsin-EDTA, ऊतक टुकड़े छोड़ने के रूप में संभव के रूप में छोटे तरल के रूप में, ट्यूब के तल पर.
  4. शेष trypsin-EDTA को धोने के लिए प्री-कूल्ड विच्छेदन मध्यम से 5 मिलीलीटर जोड़ें । पिपेट ट्यूब के ऊपरी भाग की ओर ऊतक टुकड़े के मिश्रण को प्राप्त करने के लिए ।
  5. महाप्राण विच्छेदन मध्यम, और ऊतक टुकड़े छोड़ के रूप में संभव के रूप में छोटे तरल में । पूर्व ठंडा विच्छेदन मध्यम दो बार और अधिक के साथ इस धुलाई कदम दोहराएं ।
  6. अंतिम धुलाई कदम के बाद, DMEM के 1 मिलीलीटर + जोड़ें (कमरे के तापमान को गर्म) एक १,००० µ एल पिपेट टिप का उपयोग कर, और triturate ऊपर और नीचे pipetting द्वारा ऊतक बुलबुले शुरू करने के बिना ।
    नोट: यह बुलबुले के उत्पादन से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में इस समाधान के पीएच बदल सकते हैं, जो astrocytes काफी संवेदनशील हैं ।
  7. एक ५०-एमएल ट्यूब के उद्घाटन में एक १०० µm सेल छलनी प्लेस और पूर्व ठंडा DMEM + के ४.५ मिलीलीटर के साथ फिल्टर पूर्व गीला ।
  8. सेल छलनी पर असंबद्ध ऊतक निलंबन के 1 मिलीलीटर पिपेट और सेल छलनी के माध्यम से कोशिकाओं को धोने के लिए एक और ४.५ मिलीलीटर पूर्व ठंडा DMEM + जोड़ें ।

4. Passaging द्वारा Astrocyte संवर्धन के लिए सेल चढ़ाना

  1. कोशिकाओं की गणना, जैसे, 10 µ एल trypan नीले और pipetting एक hemocytometer पर मिश्रण के साथ सेल निलंबन के 10 µ एल कमजोर द्वारा ।
  2. प्लेट ५००,००० कोशिकाओं में 12 एमएल DMEM + प्रति 10-सेमी डिश ।
    नोट: DMEM + astrocytic विकास के लिए उपयोगी है, और अधिक न्यूरॉन्स या microglia के लिए की तुलना में. झटकों के दौरान, शारीरिक कुओं के भीतर कांच coverslips पर अभिनय बलों के 10-मुख्यमंत्री व्यंजन पर अभिनय उन से ज्यादा मजबूत है (coverslips के बिना) । यदि कोशिकाओं को 24-ठीक प्लेटों पर हिल रहे हैं, वे अस्वस्थ हो या मर जाते हैं । केवल प्लेट 24-अच्छी तरह से प्लेटें मिलाने के बाद पर astrocytes ।
  3. मशीन में ३७ ° c और 5% सह में सेल संस्कृतियों रखें2 सात दिनों के लिए ।
  4. 6 दिन, मिलाते हुए और passaging कोशिकाओं से पहले दिन, पी लेपित संस्कृति प्लेटें तैयार के रूप में चरण 5 में वर्णित है ।

5. Passaging कोशिकाओं

  1. passaging से पहले दिन, कोट सेल संस्कृति ०.०४% बेई के साथ प्लेटें ।
    1. immunocytochemistry, वायरल transduction, या प्लाज्मिड अभिकर्मक के लिए, 24-well या 6-well प्लेट्स का उपयोग करें (प्रत्येक जिसमें एक निष्फल 12 मिमी या 25 मिमी ग्लास coverslip, क्रमशः) ।
    2. ७०% इथेनॉल में गर्मी से कम 1 घंटे के लिए गिलास coverslips को निष्फल, तो तीन बार धो, आसुत जल में कुओं में coverslips रखने से पहले पानी ।
    3. 12-मिमी coverslip प्रति 24-अच्छी तरह से प्लेटों में, और ६०० µ एल ०.०४% बेई के अनुसार 25 मिमी coverslip में 6-अच्छी तरह से प्लेटों में कम से ७० µ एल ०.०४% बेई जोड़ें ।
    4. पश्चिमी दाग या आरएनए-Seq विश्लेषण के लिए, 10 सेमी व्यंजन पहले से ही विच्छेदन के बाद कोशिकाओं से युक्त उपयोग किया जा करने के लिए जारी रख सकते हैं । व्यंजन केवल हिल की जरूरत है, तो कोशिकाओं 1x पंजाबियों के साथ धोया और नायब + एच के साथ इलाज कर रहे है (नए बर्तन को हस्तांतरित नहीं) ।
  2. दिन में इन विट्रो (DIV) 7 विच्छेदन के बाद, DMEM में कोशिकाओं के साथ 10-मुख्यमंत्री व्यंजन प्लेस + मशीन में एक प्रयोगशाला के बरतन पर और व्यंजन शेक ११० rpm पर 6 एच के लिए ।
  3. , आसुत जल दो बार के साथ लेपित coverslips से बेई से धो लो । प्लेटों के लिए एनबी + एच मध्यम जोड़ें (अच्छी तरह से 24 के लिए ५०० µ एल-अच्छी तरह से प्लेटें और 6 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए प्रति अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर). पूर्व ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2 पर मशीन में प्लेटें equilibrate जबकि 10 सेमी व्यंजन मिलाते हुए कर रहे हैं, या कम से कम 30 मिनट के लिए ।
  4. 6 एच मिलाते के अंत से पहले 20-30 मिनट, पूर्व गर्म 1x पंजाबियों, DMEM +, एनबी + एच, और ०.२५% trypsin-EDTA के लिए ३७ ° c पानी में स्नान ।
  5. मिलाते हुए के 6 ज के बाद, शेखर से संस्कृति व्यंजन ले और तुरंत माध्यम की जगह (है कि बंद ंयूरॉंस, oligodendrocytes, और microglia) 10 मिलीलीटर पूर्व के साथ डिश प्रति गर्म 1x पंजाबियों ।
    नोट: नॉन-astrocytic कोशिकाओं को री-अटैच करने से बचने के लिए इसके लिए जरूरी है कि पुराने मीडियम वाले रेग्युलेटर कोशिकाओं को तुरंत महाप्राण ।
  6. पंजाबियों को हटा दें और डिश के प्रति 3 मिलीलीटर पूर्व-उष्ण trypsin-EDTA जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर मशीन में 4 मिनट के लिए प्रत्येक डिश मशीन ।
    नोट: यदि पश्चिमी दाग या आरएनए-Seq के लिए नमूनों की तैयारी, trypsin-EDTA जोड़ नहीं है । इसके बजाय, 12 मिलीलीटर पूर्व-गर्म एनबी + एच के साथ पंजाबियों की जगह है, जिसके बाद संस्कृतियों वापस मशीन में रखा जा सकता है ।
  7. प्रत्येक डिश में 3 मिलीलीटर trypsin-EDTA के लिए 5 मिलीलीटर पूर्व गर्म DMEM + जोड़ें, पिपेट एक 5 मिलीलीटर सीरम पिपेट का उपयोग कर पकवान बंद कोशिकाओं, और एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन इकट्ठा ।
    नोट: डिश के तल से सीधे पिपेट-डिश के फर्श के रूप में स्पष्ट हो जाना चाहिए कोशिकाओं को अलग । केवल सीरम युक्त माध्यम का उपयोग करें (DMEM + के स्थान पर), सीरम निष्क्रियता के रूप में trypsin.
  8. 4 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर ३,२२० x g पर सेल सस्पेंशन केंद्रापसारक ।
  9. supernatant निकालें और सेल गोली 1 मिलीलीटर पूर्व गरम एनबी + एच में reसस्पेंड ।

6. अंतिम Astrocyte संस्कृतियों के लिए सेल चढ़ाना

  1. कोशिकाओं गिनती ।
  2. प्लेट २०,००० कोशिकाओं में 6 अच्छी तरह से प्लेटों में (2 एमएल एनबी + एच मध्यम प्रति अच्छी तरह से) या ५,००० कोशिकाओं में प्रति अच्छी तरह से 24 में अच्छी तरह से प्लेटें (में ५०० µ एल एनबी + एच माध्यम प्रति अच्छी तरह से) ।
  3. ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह पर मशीन में सेल संस्कृतियों रखें2 जब तक आगे उपचार या विश्लेषण ।
  4. विनिमय आधा मध्यम सप्ताह में एक बार ।
    नोट: कम पोषक वातावरण में, astrocytes रोक proliferating लेकिन किसी भी शेष microglia पैदा होगा (हालांकि हमारे अनुभव में, microglia संस्कृतियों में कोई AWESAM दिखाई) । एक सप्ताह में एक बार आधा मध्यम आदान प्रदान किसी भी संभावित शेष microglia के संवर्धन से बचाता है8, और monocultures के लिए स्वस्थ रहने के कम से तीन सप्ताह ।

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Representative Results

Astrocytes जो न्यूरॉन्स के साथ सह-कल्चरित होते हैं और एनबी + मीडियम में उगाए जाते हैं, संस्कृति के 2 सप्ताह के बाद stellate दिखाई देते हैं (चित्र 2). एनबी + मध्यम के अलावा, सह-कल्चर्ड astrocytes भी अज्ञात ंयूरॉन व्युत्पंन कारकों है कि संभावना उनके अस्तित्व और आकृति विज्ञान के लिए योगदान करने के लिए उजागर कर रहे हैं । इसके विपरीत, एमडी astrocytes DMEM में बड़े हो + monocultures के रूप में (रवाना होने से पहले अंय प्रकार के कोशिका के झटकों के बाद) 2 सप्ताह के बाद बहुभुज दिखाई देते हैं । AWESAM astrocytes में पले + एच मिलाते के बाद, कई महीन प्रक्रियाओं के साथ stellate प्रकट संस्कृति के 2 सप्ताह के बाद ।

हम पहले से पता चला है कि AWESAM astrocytes की आरएनए अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल vivo में astrocytes के करीब है जब एमडी और immunopanned astrocytes4की तुलना में । astrocyte-विशिष्ट प्रोटीन अभिव्यक्ति के संदर्भ में, cortical astrocytes एक्सप्रेस के उच्च स्तर ALDH1L1 और निंन स्तर के GFAP vivo में12। यह भी AWESAM astrocytes पर लागू होता है, और ALDH1L1 के immunostaining, एक cytoplasmic एंजाइम के रूप में, cytoskeletal प्रोटीन GFAP (चित्रा 2बी) की तुलना में बेहतर विस्तार से पता चलता है.

आरएनए और प्रोटीन अभिव्यक्ति के अलावा, vivo में astrocytes सहज सीए2 + संकेत (यानी, बाहरी उत्तेजना के बिना), लेकिन बहुभुज एमडी astrocytes इन विट्रो में अक्सर उत्तेजना की आवश्यकता को दूर करने के लिए सीए2 + संकेत, उदा, एटीपी या ग्लूटामेट जोड़कर । AWESAM astrocytes प्रदर्शन सहज Ca2 + vivo मेंसिग्नलिंग, दोनों सेल निकायों और ठीक प्रक्रियाओं में, जो झिल्ली के साथ वायरल transducing कोशिकाओं के द्वारा visualized किया जा सकता है लक्षित Lck-GCaMP3 (चित्रा 3) । सीए की सहज लहरें2 + आसपास के astrocytes में भी हो (चित्रा 3ए) । Astrocytic Ca2 + संकेत (चित्रा 3बी) ठीक प्रक्रियाओं और microdomains में astrocytes13के लिए विशिष्ट फ्रीवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्र 1 : प्रोटोकॉल समयरेखा. एक AWESAM प्रोटोकॉल के मुख्य कदम समय यह DIV0 पर इन चरणों का प्रदर्शन (विच्छेदन के दिन), DIV7 (बीतने के दिन), और क्या बाद में समय बिंदुओं पर उंमीद करने के लिए लेता है सहित, दिखा समयरेखा । ग्रीन बॉक्स दिखाता है जब कोशिकाओं stellate astrocytes, जहां हल्का बनाम गहरे रंग के रूप में काटा जा सकता है और अधिक जटिल stellate आकृति विज्ञान और परिपक्वता क्रमशः का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : मध्यम आकृति विज्ञान निर्धारित करता है । (एक) दिखा योजनाबद्ध कैसे astrocyte आकृति विज्ञान परिवर्तन जब सह ंयूरॉंस के साथ संस्कृति (के रूप में पहले वर्णित4) बनाम monocultures के रूप में हो, और मध्यम पर निर्भर करता है । Astrocyte-GFAP के साथ विशिष्ट धुंधला सह-प्रसंस्कृत और AWESAM astrocytes में stellate आकृति विज्ञान, और एमडी astrocytes में बहुभुज आकृति विज्ञान रूपरेखा । (ख) GFAP लेबल एमडी astrocytes अधिक दृढ़ता से ALDH1L1, और ALDH1L1 (लेकिन नहीं GFAP) AWESAM astrocytes की ठीक प्रक्रियाओं रूपरेखा । न तो astrocyte monoculture न्यूरॉन्स मार्कर MAP2 दर्शाती है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : सहज सीए2 + astrocytes में सिग्नलिंग. (क) GCaMP-transduced AWESAM astrocytes प्रदर्शन सहज Ca2 + astrocyte नेटवर्क भर में घटनाओं, पतली प्रक्रियाओं (ऐरोहेड) में शामिल है । एक ca2 + वेव अलग समय अंक, जहां प्रकाश रंग उच्च Ca2 + सांद्रता के क्षेत्रों को दर्शाया गया है, और काले क्षेत्रों extracellular क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व से छवियों में बाएं से दाएं करने के लिए कई astrocytes के माध्यम से यात्रा करता है । छवियां जीना सेल फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर अधिग्रहीत किया गया । (ख) सीए2 + सांद्रता में रंग कोडित क्षेत्रों में परिवर्तन (a) समय के साथ, GCaMP प्रतिदीप्ति तीव्रता निशान के रूप में दिखाया गया है कि कैसे एक सीए2 + संकेतन लहर कई astrocytes में फैलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

प्रोटोकॉल के भीतर चार कदम महत्वपूर्ण हैं: 1) HBEGF एकाग्रता की तैयारी ठीक 5 एनजी करने के लिए/एमएल, एकाग्रता में छोटी वृद्धि के बाद से अपरिपक्व संस्कृतियों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जैसे, 10 एनजी/एमएल HBEGF de-अंतर astrocytes4होगा; 2) समाधान है कि ऊतक या कोशिकाओं, जो पीएच बदल सकते है और astrocyte स्वास्थ्य में बाधा शामिल में बुलबुले से परहेज; 3) पूर्व equilibrating मीडिया इष्टतम पीएच और तापमान स्वस्थ astrocytes बढ़ती के लिए प्राप्त करने के लिए; 4) सप्ताह में एक बार केवल आधे मध्यम का आदान-प्रदान करें क्योंकि किसी भी शेष microglia को पैदा होने की संभावना कम होती है जब पर्याप्त पोषक तत्व विद्यमान होते हैं और मध्यम नियमित रूप से आदान-प्रदान होता है8 (हालांकि AWESAM संस्कृतियों में अब तक कोई microglia नहीं पाया गया). इस अंतिम बिंदु के लिए, यह महत्वपूर्ण है ध्यान दें कि संस्कृति के भीतर astrocyte व्युत्पंन कारकों पूरी तरह से हटा नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि वे astrocytic अस्तित्व का समर्थन कर सकते हैं, भेदभाव, और प्रसार ।

यह परिपक्व astrocyte स्रोत के रूप में DIV14 या पुराने संस्कृतियों का उपयोग महत्वपूर्ण है (लेकिन transduction या अभिकर्मक कदम के लिए, पहले संस्कृतियों इस्तेमाल किया जा सकता है) क्योंकि astrocytes से छोटी DIV14 अभी भी तंत्रिका स्टेम सेल संभावित9है । वायरल transduction के लिए, न्यूरॉन्स की मिश्रित संस्कृतियों और DIV7 पर astrocytes transduced (adeno से जुड़े वायरस का उपयोग) कुशलतापूर्वक एक्सप्रेस वायरल transduced GFP10. प्लाज्मिड अभिकर्मक के लिए, DIV10-DIV24 astrocytes अक्सर उपयोग किया जाता है और fluorophore-टैग प्रोटीन imaged 2-5 दिन बाद11। हमारे अनुभव में, दोनों वायरल transduction और प्लाज्मिड अभिकर्मक काम सबसे अच्छा अगर astrocytes transduced और DIV9 के बीच DIV14 हैं । अभिकर्मक और transduction दक्षता के निर्माण और विधि पर निर्भर है, लेकिन हम पाते है कि अभिकर्मक क्षमता ~ astrocyte monocultures lipofectamine अभिकर्मक का उपयोग कर में 20% है, और adeno-एसोसिएटेड वायरस (AAV) transduction क्षमता है ~ ९०% ( अधिक जानकारी के लिए हमारे पिछले काम4 देखें, उदाहरणके लिए, इस्तेमाल किया निर्माण) । जब lipofectamine द्वारा AAV कणों और transfecting के साथ transducing astrocytes, हम कम से 5 और 2 दिन, क्रमशः की अनुमति के निर्माण की अभिव्यक्ति के लिए । transduction या अभिकर्मक से पहले, astrocytes को भी passaging के बाद कम एक दिन के लिए ठीक करने की अनुमति दी जानी चाहिए ।

इसके अलावा, जब विभिंन समय बिंदुओं पर आरएनए/प्रोटीन अभिव्यक्ति की तुलना के लिए संस्कृतियों की तैयारी, संस्कृतियों अलग घनत्व पर चढ़ाया जा सकता है सामग्री की इसी तरह की मात्रा को प्राप्त करने, जैसे, astrocyte monocultures DIV7 पर काटा जा सकता है और DIV21 क्रमशः 1 x 106 और 10-सेमी डिश प्रति ५००,००० कोशिकाओं के घनत्व पर चढ़ाया । उदाहरण के लिए, पूरे प्रोटीन lysate उपज DIV14 पर लगभग ०.५ मिलीग्राम/एमएल जब एक 10 सेमी डिश पर शुरू में चढ़ाना ५००,००० AWESAM astrocytes के बाद काटा जाएगा ।

AWESAM प्रोटोकॉल एक तेज, सरल और सस्ता तरीका है न्यूरॉन्स से अलगाव में astrocytes संस्कृति का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन साथ में आरएनए और प्रोटीन अभिव्यक्ति, आकृति विज्ञान, और Ca2 + संकेतन की विशेषताओं की तरह vivo मेंके साथ4, जो इस प्रकार अब तक कोई अंय प्रोटोकॉल द्वारा प्रदान की गई है । AWESAM astrocytes immunocytochemistry, immunoblotting, आरएनए अभिव्यक्ति विश्लेषण, TIRF माइक्रोस्कोपी, और सीए2 + इमेजिंग4सहित सेल संस्कृति अध्ययन, के लिए विशिष्ट हैं कि विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । विशेष रूप से, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग ca में हाल ही में अग्रिमों2 + संकेतक शास्त्रीय Ca से अधिक विस्तार में ठीक astrocytic प्रक्रियाओं visualizing के लिए अनुमति दें2 + रंजक14. सीए2 + सिग्नलिंग, vesicular तेज, और exocytosis दोनों मोटी और पतली astrocytic प्रक्रियाओं में शारीरिक रूप से प्रासंगिक है, के रूप में इन प्रक्रियाओं पौष्टिकता समर्थन के मामले में मस्तिष्क समारोह को प्रभावित कर सकते हैं, रक्त प्रवाह, synaptic संकेतन और प्लास्टिक, और सेलुलर संचार । AWESAM प्रोटोकॉल ठीक astrocytic मस्तिष्क फिजियोलॉजी15 और रोग16,17के लिए प्रासंगिक प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, ंयूरॉन हस्तक्षेप के बिना और महान पहुंच के साथ कि इन विट्रो में संस्कृति की आपूर्ति ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम यूरोपीय अनुसंधान परिषद (FP7/260916), अलेक्जेंडर वॉन पीरु-Stiftung (Sofja Kovalevskaja), और ड्यूश Forschungsgemeinschaft (1951 और SFB889) से धन स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% trypsin-EDTA Gibco 25300054 warm in 37 ºC waterbath before use
0.25% trypsin-EDTA Gibco 25200-056 warm in 37 ºC waterbath before use
B-27 supplement Gibco 17504-044 50X stock
Glutamax Gibco 35050-061 100X stock
Penicillin / streptomycin Gibco 15070-063 50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 µg/ml
Neurobasal medium Gibco 21103049 without L-glutamine
DMEM Gibco 41966029
HBEGF Sigma 4643
HEPES Gibco 15630080
HBSS Gibco 14170112
FCS Gibco 10437028
PBS Gibco 10010049 1X
100 μm nylon cell strainer BD 352360
Trypan Blue Sigma T8154 
Cell culture incubator Thermo Fisher Scientific Hera Cell 240i cell culture incubator
Laboratory shaker Heidolph Rotamax 120  use inside cell culture incubator
Centrifuge Eppendorf 5810 R 

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References

  1. Puschmann, T. B., et al. Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells. Glia. 61 (3), 432-440 (2013).
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Tags

तंत्रिका इश्यू १३१ Astrocytes monoculture प्रांतस्था हिप्पोकैंपस माउस चूहा कैल्शियम पुटिका synaptogenesis मीडियम
तेज, सरल, और सस्ती AWESAM प्रोटोकॉल का उपयोग कर Vivo-like Murine Astrocytes <em>में</em>संवर्धन
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Wolfes, A. C., Dean, C. Culturing… More

Wolfes, A. C., Dean, C. Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol. J. Vis. Exp. (131), e56092, doi:10.3791/56092 (2018).

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