Summary
פרוטוקול AWESAM המתוארים כאן הוא אופטימלי culturing האסטרוציטים מאתר בבידוד מתאי המוח אחרים בצורה מהירה, פשוטה וזולה. AWESAM האסטרוציטים התערוכה ספונטנית Ca2 + איתות, מורפולוגיה, ג'ין ביטוי ופרופילי דומה האסטרוציטים ויוו.
Abstract
AWESAM ( הלאוw-עלות easy stellate strocyte מ'ethod) פרוטוקול כרוך דרך מהירה, פשוטה וזולה להפקת כמויות גדולות של in vivo-כמו עכבר, חולדה monocultures אסטרוציט : תאי המוח ניתן לבודד אזורים שונים במוח, אחרי שבוע של תרבית תאים, התאים הלא-astrocytic הם ניערתי מעליי על-ידי הצבת הכלים תרבות על מטרף עבור 6-אייץ ' בחממה. האסטרוציטים הנותרים הם passaged ואז לוחות חדשים בינונית אסטרוציט ספציפיים (הנקרא NB + H). NB + H מכיל ריכוזים נמוכים של הפארין מחייב EGF פקטורי גדילה דמויי (HBEGF), אשר משמש במקום סרום בינוני. לאחר גידול ב- NB + H, AWESAM האסטרוציטים יש תכונה תהליכים בסדר ומורפולוגיה stellate. יתר על כן, האסטרוציטים אלה יש יותר ויוו-כמו ביטוי גנים מאשר האסטרוציטים שנוצר על ידי שיטות שפורסמו בעבר. Ca2 + הדמיה, שלפוחית dynamics ואירועים אחרים בקרבת הקרום שניתן ובכך יהיה לחקור את התהליכים astrocytic בסדר במבחנה, למשל, באמצעות וידאו בשידור חי התא או מיקרוסקופ TIRF. ראוי לציין, AWESAM האסטרוציטים גם התערוכה ספונטנית Ca2 + איתות דומה האסטרוציטים ויוו.
Introduction
האסטרוציטים להשפיע על תפקוד המוח באמצעות תמיכה עם מחלות, זרימת הדם, איתות סינפטית, פלסטיות ותקשורת המערכת - כל אלה הם מנגנונים מרכז סביב התהליכים astrocytic דק. פרוטוקול AWESAM המתוארים כאן מאפשר חקר תהליכים אלו ללא הפרעה בין נוירונים אחרים עכשיו, דונלד, אשר הוא שימושי למשל, כי הביטוי של חלבונים רבים ו- Ca2 + איתות אפילו חופפים מעבר לתא מוח סוגי. עוד יותר, שיטה זו גוברת על המגבלות של טכניקות זמינים בעבר. בפרט, פרוטוקול שלנו מספק ויוו-כמו מורפולוגיה (stellate האסטרוציטים עם תהליכים דק), ביטוי גנים, מהיר, קל, ואופן זול.
מורפולוגיה תאים, ביטוי גנים רבים תהליכים רגולטוריים אחרים מושפעים ישירות הסביבה. בקערה תרבות, זה מתייחס לגורמים שפורסמו על ידי התאים שמסביב, אלא גם המדיום שבו התאים גדלים. עבור האסטרוציטים, HBEGF דווחה בעבר לזירוז stellate מורפולוגיה1 אבל נמצאה גם מבטל את להבדיל האסטרוציטים2. עם זאת, ריכוז נמוך יותר של HBEGF שימשו מאוחר יותר ליצירת עוד ויוו-כמו האסטרוציטים כפי שזוהו באמצעות רצפי RNA שני פרוטוקולים שונים3,4. יתר על כן, מורפולוגיה אסטרוציט משתנה להרכב בינוני, ללא קשר פרוטוקול4: Neurobasal בינוני עם ריכוז נמוך של HBEGF הוא אופטימלי לגידול האסטרוציטים stellate, בעוד אחרים יצירות בינונית (למשל, סרום-המכיל DMEM) מייצר תאים מצולע (אפילו ב האסטרוציטים טרי מבודדת על ידי immunopanning).
פרוטוקול AWESAM גוברת על החסרונות של טכניקות הקודם לגידול אסטרוציט monocultures4. שיטות קודמות לגידול אסטרוציט monocultures יש חסרונות הבאים: מורפולוגיה מצולע, וזה דיי האסטרוציטים stellate ויוו (שיטת MD)5; האורך ואת העלות של פרוטוקול (הכנת האסטרוציטים מ pluripotent המושרה בתאי גזע לוקח שלושה חודשים ודורש נוגדנים רבים, לרבות גורמי גדילה יקר)6; כמויות נמוכות של חומר (שיטת immunopanning)3; את הבידול והתבקשתי של האסטרוציטים, הדרישה של מטריצה תלת-ממד (Puschmann et al.) 1 , 2. לעומת זאת, פרוטוקול AWESAM מספק: ויוו-כמו מורפולוגיה (האסטרוציטים stellate עם תהליכים דק); מהר, לאט, ושיטת זולים; כמויות גדולות של חומר; הכי אין ויוו-כמו ביטוי גנים לעומת immunopanned ו MD האסטרוציטים. בנוסף, תרבות דו-מימדית מאפשרת לצורך המחקר של איתות2 + Ca, מיחזור תהליכים דק, וכן אירועים קרוב הקרום שלפוחית (למשלמיקרוסקופ TIRF בלתי אפשרי בתרבויות תלת-ממד).
השיטה MD שימש בהרחבה מאז פרסומו ב- 19805, מציעה טכניקה פשוטה ומהירה עבור monocultures אסטרוציט מצולע. בקיצור, השיטה MD כרוך תאי המוח מעורבות גוברת בנסיוב עגל עוברית (FCS)-המכיל DMEM, ואחריו רועד צעדים להעשיר עבור האסטרוציטים (כמו כל שאר סוגי לנתק מתוך קערה לתא מוח), תרבות נוספת במדיום אותו. DMEM בתוספת FCS משמש עבור שאר סוגי תאים רבים, החל fibroblasts adipocytes שורות תאים סרטן שונים, צמודות המבנה מצולעים הוצגו על ידי MD האסטרוציטים בתרבות. עד בתחילת שנות האלפיים7, היה קצת מחשבה בהתחשב מדיה המותאמים האסטרוציטים, במיוחד את האמונים שלהם מורפולוגיה stellate טיפוסי נמצאו vivo בתוך. פרוטוקול אחד שפורסם בשנת 2011 להשיג כזה מורפולוגיה stellate: קראו את שיטת immunopanning, היא מעסיקה בינונית ללא סרום אופטימיזציה עבור culturing האסטרוציטים3. באמצעות שיטה זו, תאי מוח טרי מבודד חשופים סדרה של מנות מצופה נוגדנים יעד ייחודיים לסוג התא חלבונים פני שטח התא, להעשיר עבור האסטרוציטים. למרות ה יותר ויוו-כמו פרופיל ביטוי ומורפולוגיה של immunopanned האסטרוציטים, הרוב המכריע של מחקרים במבחנה עדיין מסתמכים על השיטה אסטרוציט MD. השיטה MD היא פשוטה ומהירה, בעוד השיטה immunopanning כוללת יותר מורכב ולגזול צעדים ביום הראשון של תרבות (כגון אנזים עיכול תקופות ארוכות יותר, זהיר שכבות של פתרונות של צפיפות שונה, immunopanning עצמה, ו מספר צנטריפוגה שלבים - הכל לפני ציפוי). עם זאת, באמצעות מדיום יותר מיוחדים, שיטת AWESAM מציע שני את המהירות של השיטה MD ו ה ויוו-כמו מורפולוגיה של הפרוטוקול immunopanning.
בסך הכל, פרוטוקול AWESAM שימושית ללמוד יותר ויוו-כמו האסטרוציטים ב- 2D monocultures מבודדת בין נוירונים אחרים עכשיו, דונלד (כפי שנעשה בעבר4 על ידי immunostainings, immunoblots, רצפי RNA). זה מאפשר לחקר תהליכים astrocytic דק, וכן מספקת נגישות מעולה להמחשת ספונטנית של Ca2 + איתות ואירועים בקרבת הקרום (למשל, עם תמונה על ידי מיקרוסקופ TIRF).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים המתוארים כאן בוצעו בהתאם להנחיות עבור רווחת גרמני.
הערה: ציר הזמן ואת השלבים העיקריים של הפרוטוקול מומחשים באיור1.
1. תכשירים
-
הכינו את הפתרונות הבאים.
- להכין DMEM + culturing האסטרוציטים MD polygonal: DMEM עם 10% FCS, פניצילין U 100 100 סטרפטומיצין µg/mL.
- להתכונן NB + H culturing האסטרוציטים stellate: neurobasal בינוני עם 5 ננוגרם למ"ל HBEGF, 1 x B-27 תוספת, תוספת גלוטמין x 1, 100 פניצילין U ו- 100 סטרפטומיצין µg/mL.
הערה: Aliquots של ריכוז גבוה של HBEGF יכול להיות מוכן ומאוחסנים ב-20 ° C להתווסף המדיום בכל פעם שיש צורך. - להכין את המדיום לנתיחה (10 מ מ HEPES ב HBSS).
- להכין את aliquots של 6-7 מ של 0.05% טריפסין-EDTA, 6-7 מ ל 0.25% טריפסין-EDTA צינורות 15 מ"ל. אלה יכול להיות מאוחסן ב-20 ° C, הקרת באמבט מים 37 º C.
- יום לפני תחילת הפרוטוקול, מעיל 10 ס מ שטופלו תרביות רקמה מנות עם 5 מ של 0.04% polyethylenimine (פיי) כל אחד.
- למחרת, הסר את פיי, לשטוף את הכלים במים מזוקקים, יונים פעמיים. להוסיף 12 מ של DMEM + כל צלחת, מראש equilibrate בחממה ב- 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 במשך לפחות 30 דקות לפני ציפוי תאים.
- הכנת האזור לנתיחה: תא לנתיחה למינארי, צלחות פטרי 10 ס מ למקום השני מלא בינונית לנתיחה על קרח. עבור כל אזור המוח להיות מבודדים (למשל, קליפת המוח, ההיפוקמפוס), להכין 15-צינור מלא עם 14 מ"ל לנתיחה בינוני ולשמור על קרח. תרסיס כלי חיתוך (מספריים בסדר, דומונט #3 #5 מלקחיים) עם 70% אתנול וביו -מקומה לנתיחה מיקרוסקופ בשכונה.
2. חולדה או עכבר ניתוח מוחי
הערה: שני עכברים חולדות ויכול לשמש. חיות יותר P8 עשוי לשמש גם מבוגרת (בדקנו עד P12), אבל הסרת קרומי המוח יהפוך יותר ויותר קשה. עוד יותר, התשואה תא ובריאות יתמעט, מאז תאי מוח מחיות מבוגר יצרו תהליכים מסובכים וחיבורים עלול לשבור במהלך דיסוציאציה רקמות, המוביל אל מות תאים מוגברת. ההכנות קורטיקלית מתוארים כאן, אך ניתן להשתמש גם באזורים אחרים במוח.
- הצב 0.05% טריפסין-EDTA באמבט מים 37 º C.
- המתת חסד חיות (בהריון חולדות E19 הגורים, או חיות P0-P8) מאת לאט להעלות את ריכוז2 CO, לבודד את השכל. הפעולות הבאות דורשות סטרילי טכניקה.
-
אם עובדים עם מתחלקים, הסר תחילה את העוברים מן הרחם, פתח שקי עובריים ולאחר מכן מיד כרת את ראשם עם מספריים. כאשר כל ראשי נחתכים, להעביר אותם לתוך לנתיחה טרום מקורר בינוני.
- לאחר ראשי טובע בתוך המדיום, לפתוח את העור ואת הגולגולת (שתיהן רך מאוד בבעלי חיים צעירים) עם מלקחיים, גונבת את המוח הקטן. בזהירות ידית שאר המוח יוצא את הגולגולת.
הערה: שניים עד ארבעה E19 עוברי תשואה מספיק רקמה עבור מנות 10 ס מ לפחות שמונה האסטרוציטים קורטיקלית מצופה ב תאים 500,000 לכל מאכל ביום של ניתוח.
- לאחר ראשי טובע בתוך המדיום, לפתוח את העור ואת הגולגולת (שתיהן רך מאוד בבעלי חיים צעירים) עם מלקחיים, גונבת את המוח הקטן. בזהירות ידית שאר המוח יוצא את הגולגולת.
- עבור הגורים היילוד ומעלה, כרת את ראשם עם מספריים, לבודד את המוח על ידי medially חיתוך העור בקו ישר מן הצד האחורי של הראש עד הקצה של האף. משוך את העור בצד ובזהירות תחתוך את הגולגולת שמאלה ימינה ואז להרים עצם הגולגולת. לחתוך את המוח הקטן, מנוף שאר המוח יוצא את הגולגולת.
הערה: שלושה P0-P8 הגורים תשואה מספיק רקמה עבור מנות 10 ס מ לפחות שמונה האסטרוציטים קורטיקלית מצופה ב תאים 500,000 לכל מאכל ביום של ניתוח. - להפריד בין קליפת המוח לבין במבנה המוח האמצעי המשמש כבסיס. מקום המלקחיים בתוך פיסורה האורך בין ההמיספרות, ולאחר מכן להעביר המלקחיים בין המבנים ואת קליפת המוח האמצעי של והזיז חצי אחד (בניצב פיסורה האורך) לצבוט את האונה כל חינם.
- עם המלקחיים, להסיר כל קרומי המוח של האונה כל (וגם ההיפוקמפוס שלה), ואז להפריד את hippocampi. אם נדרשים האסטרוציטים בהיפוקמפוס, להעביר כל ההיפוקמפוס לתוך צינור 15 מ"ל מלא עם 14 מ"ל בינוני לנתיחה על קרח.
- הסר עוד אזורים קליפת של האונה כל אם אזורים ספציפיים הדרושים (למשל, החזיתית). חותכים כל רקמות קורטיקלית כדי לשמש ליצירת האסטרוציטים לחתיכות יותר מ- 1 מ מ3. לאסוף את כל החלקים של רקמות קורטיקלית בשפופרת 15-mL נפרדים מלא בינוני לנתיחה על קרח.
3. רקמות לעיכול, דיסוציאציה
- לאחר כל החלקים רקמות נאספים, לחכות להם להתיישב לתחתית הצינור ולאחר מכן תשאף בינוני רב ככל האפשר.
- להוסיף 2-3 מ"ל של טריפסין 0.05%-באמצעות פיפטה סרולוגית של EDTA, דגירה הצינורות בתוך אמבט מים 37 º C למשך 20 דקות.
הערה: שחרור כל טריפסין-EDTA מ פיפטה במהירות כדי לערבב את חתיכות רקמה אפשר להתיישב שוב. - בזהירות וארוקן את טריפסין-EDTA, להשאיר חתיכות רקמה כמו נוזל מעט ככל האפשר, בחלק התחתון של הצינור.
- הוסף 5 מ של דיסקציה טרום מקורר בינוני כדי לשטוף את הנותרים של טריפסין-EDTA. פיפטה לצד של החלק העליון של הצינור כדי להשיג ערבוב של החלקים רקמות.
- תשאף המדיום לנתיחה, ולהשאיר את השברים רקמות כמו נוזל מעט ככל האפשר. חזור על שלב זה כביסה לנתיחה טרום מקורר בינונית עוד פעמיים.
- לאחר השלב הסופי כביסה, להוסיף 1 מ"ל של DMEM + (להתחמם לטמפרטורת החדר) שימוש 1,000 µL פיפטה עצה, triturate הרקמה על ידי pipetting למעלה ולמטה בלי היכרות עם בועות.
הערה: חשוב להימנע לייצור בועות, כמו זה עשוי לשנות את ה-pH של התמיסה, שאליו האסטרוציטים רגישים למדי. - מניחים מסננת תא 100 מיקרומטר בפתיחה של שפופרת 50-mL, טרום רטוב את המסנן עם 4.5 מ של טרום מקורר DMEM +.
- Pipette 1 מ"ל של רקמות הפומבית השעיה על גבי מסננת התא ולהוסיף עוד 4.5 מ ל טרום מקורר DMEM + לשטוף את התאים דרך מסננת התא.
4. תאי ציפוי אסטרוציט העשרה על-ידי Passaging
- לספור את התאים, למשל, על ידי דילול µL 10 של התליה תא עם 10 µL trypan blue pipetting את התערובת על גבי hemocytometer.
- צלחת 500,000 תאים ב- mL 12 DMEM + לכל מנה ס מ-10.
הערה: DMEM + הוא מועיל לצמיחה astrocytic, יותר כך נוירונים או מיקרוגלייה. במהלך רועדת, כוחות פיזיים על coverslips זכוכית דקה בתוך בארות הם הרבה יותר חזקים מאשר אלה על המנות 10-ס מ (ללא coverslips). אם תאים שיש לחיצות על לוחות 24-. ובכן, הם הופכים לא בריא או למות. רק צלחת האסטרוציטים על לוחות 24-ובכן לאחר רועדת. - לשמור תרביות תאים בחממה ב- 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 במשך שבעה ימים.
- יום 6, יום לפני רועדת, passaging תאים, להכין את הלוחות מצופים פיי התרבות כפי שמתואר בשלב 5.
5. passaging תאים
-
יום לפני passaging, מעיל תא צלחות תרבות עם 0.04% פיי.
- עבור immunocytochemistry, התמרה חושית ויראלי או פלסמיד תרביות תאים, השתמש 24-טוב או טוב 6 צלחות (המכילים כל אחד של 12 מ"מ מעוקר או coverslip זכוכית 25 מ מ, בהתאמה).
- לחטא את coverslips זכוכית דקה על ידי דגירה אתנול 70% לפחות שעה ולאחר מכן לשטוף את שלוש פעמים במים מזוקקים, יונים לפני הצבת coverslips את הבארות.
- הוסף לפחות 70 µL 0.04% פיי לכל 12-מ מ coverslip ב- 24-ובכן צלחות, פיי 0.04% µL 600 לכל 25 מ מ coverslip ב 6-ובכן צלחות.
- תספיג חלבון או RNA-Seq ניתוח, כלים 10 ס מ כבר המכילות את התאים לאחר הקרע יכול להמשיך להשתמש בו. מנות רק צריך להיות מזועזע, אז התאים עם 1 x PBS שטופים שטופלו NB + H (להעביר מנות חדשות).
- על יום במבחנה (DIV) 7 לאחר הקרע, למקם את הכלים ס מ-10 עם תאים DMEM + על מטרף מעבדה בחממה וללחוץ על כל המנות של 110 סל ד במשך 6 שעות.
- לשטוף את פיי מ coverslips מצופה עם מים מזוקקים יונים פעמיים. להוסיף NB + H בינוני הלוחות (500 µL לכל טוב עבור לוחות 24-ובכן, 2 מ לכל טוב עבור לוחות 6-טוב). מראש equilibrate הלוחות בחממה 37 ° C ו- 5% CO2 בזמן המנות 10 ס מ רועדות, או למשך 30 דקות לפחות.
- 20-30 דקות לפני תום 6-אייץ ' טלטול, לחמם 1 x PBS, DMEM +, NB + H ו- 0.25% טריפסין-EDTA עד 37 ° C באמבט מים.
- אחרי 6 שעות של טלטולים, תוריד את הכלים תרבות ניעור ולהחליף מיד המדיום (המכיל ניערו את הנוירונים, oligodendrocytes להפוך, מיקרוגלייה) עם 10 מ"ל מראש חימם PBS x 1 לכל תבשיל.
הערה: חשוב לרוקן מיד המדיום הישן המכיל תאים מנותקת כדי למנוע את התאים הלא-astrocytic חיבור מחדש. - להסיר את PBS ולהוסיף מראש ומחוממת 3 מ"ל טריפסין-EDTA לכל תבשיל. דגירה כל מנה במשך 4 דקות בחממה ב CO 37 ° C ו-5%2.
הערה: אם מכינים דגימות תספיג או RNA-Seq, אינם מוסיפים טריפסין-EDTA. במקום זאת, החלף PBS ב 12 mL חימם מראש NB + H, לאחר מכן ניתן למקם תרבויות בחזרה בחממה. - הוסף 5 מ ל DMEM מראש ומחוממת + עד 3 מ"ל טריפסין EDTA בכל צלחת, pipette את התאים את המנה בעזרת פיפטה סרולוגית 5 מ ל, ולאסוף התליה תא בשפופרת 50 מ.
הערה: פיפטה ישירות מהחלק התחתון של המנה - הרצפה של המנה צריך להיות ברור יותר כמו לנתק התאים. רק להשתמש בסרום המכילות בינוני (במקום DMEM +), סרום חלבונית טריפסין. - Centrifuge התליה תא ב g x 3,220 ב 20 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות.
- הסר את תגובת שיקוע וחיממתי resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל מראש NB + H.
6. תאי ציפוי עבור תרבויות אסטרוציט הסופי
- לספור את התאים.
- צלחת 20,000 תאים לכל טוב טוב 6 צלחות (ב מ ל 2 NB + H בינוני לכל טוב) או תאים 5,000 לכל טוב ב- 24-ובכן הצלחות (500 µL NB + H בינוני לכל טוב).
- לשמור על תרביות תאים בחממה ב- 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 עד להמשך הטיפול או הניתוח.
- להחליף חצי המדיום פעם בשבוע.
הערה: בסביבות תזונתי נמוך, האסטרוציטים עוצרים מתרבים אבל כל מיקרוגלייה הנותרים ותתנהל (למרות מניסיוננו, אין מיקרוגלייה הופיע בתרבויות AWESAM). החלפת חצי המדיום פעם בשבוע מונע העשרה של כל מיקרוגלייה פוטנציאל הנותרים8, monocultures להישאר בריא לפחות שלושה שבועות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
האסטרוציטים תרבותי משותף עם נוירונים, גדל ב- NB + בינוני מופיעים stellate לאחר 2 שבועות של תרבות (איור 2). בנוסף NB + בינוני, האסטרוציטים תרבותי משותף נחשפים גם לא ידוע נגזר נוירון גורמים שתורמים סביר שלהם הישרדות, מורפולוגיה. לעומת זאת, MD האסטרוציטים גדלו ב DMEM + כמו monocultures (לאחר וניעור סוגי תאים אחרים לפני המעבר) מופיעים מצולע לאחר שבועיים. האסטרוציטים AWESAM גדל ב- NB + H לאחר טלטולים, מופיעים stellate עם תהליכים רבים בסדר לאחר 2 שבועות של תרבות.
בעבר הראינו כי לפרופיל ביטוי RNA של AWESAM האסטרוציטים זה קרוב לזה של האסטרוציטים ויוו בהשוואה האסטרוציטים MD ו- immunopanned4. מבחינת ביטוי חלבון ספציפי אסטרוציט, האסטרוציטים קורטיקלית לבטא רמות גבוהות של ALDH1L1 ואת רמות נמוכות של GFAP ויוו12. זה חל גם האסטרוציטים AWESAM, immunostaining של ALDH1L1, כמו אנזים cytoplasmic, חושף פרטים עדינה יותר מאשר החלבון cytoskeletal GFAP (איור 2B).
מלבד הביטוי RNA וחלבון, האסטרוציטים ויוו מראה ספונטני Ca2 + איתות (קרי, ללא גירוי חיצוני), אבל מצולע MD האסטרוציטים במבחנה לעיתים קרובות דורשים גירוי שמעודדים Ca2 + מערכת אזעקה, למשלעל ידי הוספת ATP או גלוטמט. AWESAM האסטרוציטים התערוכה ספונטנית Ca2 + איתות ויוו, גופי התא והן תהליכים בסדר, אשר ניתן לאבחן על ידי לשווק transducing תאים עם, ממוקדות ממברנה Lck-GCaMP3 (איור 3). גלים ספונטנית של Ca2 + ברחבי האסטרוציטים הסמוך להתרחש גם (איור 3א). Astrocytic Ca2 + מערכת אזעקה (איור 3ב') תהליכים בסדר, microdomains ניתן לנתח באמצעות freeware ספיציפית האסטרוציטים13.
איור 1 : ציר הזמן פרוטוקול. ציר זמן מציג את השלבים העיקריים של פרוטוקול AWESAM, כולל את הזמן הדרוש כדי לבצע את הפעולות הבאות על DIV0 (יום של דיסקציה), DIV7 (יום המעבר), ומה מצפה בנקודות זמן מאוחר יותר. הקופסא הירוקה מדגים כאשר התאים ניתן לקצור בשם האסטרוציטים stellate, שם קל יותר לעומת גוונים כהים מייצגים פחות לעומת בגרות, ומורפולוגיה stellate מורכבים יותר בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : בינוני קובע מורפולוגיה. (א) מפרטים טכניים מציג כיצד אסטרוציט מורפולוגיה משתנה כאשר תרבותי משותף עם נוירונים (כפי שתואר לעיל4) לעומת מבוגר כמו monocultures, תלוי המדיום. אסטרוציט ספציפיים מכתים עם קווי מתאר GFAP המורפולוגיה stellate ב משותף תרבותי AWESAM האסטרוציטים ואת המבנה מצולעים ב MD האסטרוציטים. (B) GFAP תוויות MD האסטרוציטים בצורה חזקה יותר מאשר ALDH1L1, ו ALDH1L1 (אך לא GFAP) מתאר את התהליכים בסדר של AWESAM האסטרוציטים. גם מונוקולטורה אסטרוציט תערוכות דה מרקר עצביים MAP2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : Ca ספונטנית2 + איתות ב האסטרוציטים. (א) AWESAM GCaMP-transduced האסטרוציטים בנספח ספונטנית Ca2 + אירועים ברחבי אסטרוציט רשתות, כולל בתהליכי דק (חץ). גל2 + Ca נוסע דרך מספר האסטרוציטים משמאל לימין בתמונות של נקודות זמן שונות, שבו צבע האור מתארת תחומי Ca2 + ריכוזים גבוהים, אזורים שחורים מייצגים אזורים חוץ-תאית. תמונות נרכשו באמצעות קונפוקלית תא חי. (B) Ca2 + ריכוזים לשנות באזורים המקודדים ב- (א) לאורך זמן, כמוצג עקבות עוצמת קרינה פלואורסצנטית GCaMP שממחישים איך Ca2 + איתות הגל מתפשט על פני מספר האסטרוציטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ארבעה שלבים בתוך הפרוטוקול הן קריטיות: 1) הכנת ריכוז HBEGF כדי בדיוק 5 ng/mL, מאז עליות קטנות הריכוז יכול להוביל תרבויות לא בוגר, למשל10 ננוגרם למ"ל HBEGF de-להבדיל האסטרוציטים4; 2) בועות הימנעות בפתרונות מכילים רקמה או תאים, אשר ניתן לשנות את ה-pH, לעכב אסטרוציט בריאות; 3) מראש equilibrating מדיה כדי להשיג את ה-pH האופטימלי ואת הטמפרטורה לגידול בריא האסטרוציטים; 4) החלפת רק חצי המדיום פעם בשבוע כי כל מיקרוגלייה הנותרים נוטים פחות להתרבות כאשר מספיק חומרים מזינים נוכחים המדיום המוחלפות בקביעות8 (למרות מיקרוגלייה לא נמצאו בתרבויות AWESAM עד כה). על הנקודה האחרונה, חשוב לציין כי צריך נגזר אסטרוציט גורמים בתוך התרבות לא יוסרו לחלוטין, כפי שהם עשויים לתמוך הישרדות astrocytic ', ' בידול, התפשטות.
חשוב להשתמש DIV14 או בתרבויות עבר כמקור אסטרוציט בוגרת (אך לקבלת צעדים התמרה חושית או תרביות תאים, ניתן להשתמש תרבויות קודמות) כי האסטרוציטים צעיר יותר DIV14 יש עדיין פוטנציאל תאי גזע עצביים9. עבור התמרה חושית ויראלי, לערבב תרבויות של נוירונים, האסטרוציטים transduced על DIV7 (באמצעות וירוסים adeno-הקשורים) ביעילות אקספרס לשווק transduced GFP10. על פלסמיד תרביות תאים, DIV10-DIV24 האסטרוציטים משמשים לעתים קרובות ו מתויג fluorophore חלבונים עם תמונה 2-5 ימים מאוחר יותר11. מניסיוננו, התמרה חושית ויראלי וגם תקנים פלסמיד פועלות בצורה הטובה ביותר אם האסטרוציטים אינם transduced בין DIV9 לבין DIV14. היעילות תרביות תאים, התמרה חושית תלויות הבונה ואת השיטה, אך אנו מוצאים כי יעילות תרביות תאים ~ 20% ב- monocultures אסטרוציט באמצעות תרביות תאים lipofectamine, יעילות התמרה חושית adeno-הקשורים וירוס (AAV) ~ 90% ( ראה שלנו העבודה הקודם4 פרטים נוספים, למשל, לבנות בשימוש). כאשר transducing האסטרוציטים עם חלקיקי AAV, transfecting על ידי lipofectamine, אנחנו מורשים לפחות 5 ו 2 ימים, בהתאמה, ביטוי של הבונה. לפני התמרה חושית או תרביות תאים, האסטרוציטים צריכה גם להיות מותר להתאושש במשך לפחות יום אחד לאחר passaging.
יתר על כן, בעת הכנת תרבויות לצורך השוואת ביטוי RNA/חלבון שונים נקודות, תרבויות יכול להיות מצופה ב צפיפויות שונות כדי להשיג כמויות דומות של החומר, למשל, monocultures אסטרוציט להיות שנקטפו ב DIV7, DIV21 יכול להיות מצופה ב צפיפויות של עונה 1 פרק 106 ותאים 500,000 לכל מנה ס מ-10, בהתאמה. לדוגמה, התשואה lysate חלבון שלם יהיה סביב 0.5 מ"ג/מ"ל ב- DIV14 כאשר שנקטפו לאחר בתחילה יופיצ האסטרוציטים 500,000 AWESAM בצלחת ס מ-10.
פרוטוקול AWESAM מייצג מהירה, פשוטה וזולה דרך תרבות האסטרוציטים בבידוד הנוירונים אלא עם in vivo-כמו מאפייני RNA, ביטוי חלבונים, מורפולוגיה ו Ca2 + איתות4, אשר עד כה מסופק על ידי אין פרוטוקול אחר. האסטרוציטים AWESAM יכול לשמש עבור ניתוחים האופייניים ללימודי התרבות תאים, כולל immunocytochemistry, immunoblotting, ניתוח ביטוי RNA, מיקרוסקופ TIRF ו- Ca2 + הדמיה4. בפרט, התפתחויות אחרונות מקודדים גנטית Ca2 + מחוונים מאפשרים להמחשת התהליכים astrocytic בסדר בפירוט רב יותר מאשר קלאסית Ca2 צבעי14. איתות2 + Ca, ספיגת vesicular ו אקסוציטוזה בתהליכים astrocytic באש ובמים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, כמו תהליכים אלו יכולים להשפיע על תפקוד המוח מבחינת תמיכה עם מחלות, זרימת הדם, סינפטית איתות, פלסטיות, ו תקשורת המערכת. פרוטוקול AWESAM מאפשר חקר התהליכים astrocytic בסדר רלוונטיות עבור המוח פיזיולוגיה15 ו מחלת16,17, ללא הפרעה עצביים ועם נגישות מעולה הזה חוץ גופית בתוך תרבות אספקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו להכיר במימון המועצה האירופית למחקר (האיחוד FP7/260916), את אלכסנדר פון הומבולדט-Stiftung (Sofja Kovalevskaja), פתוח (DE1951 ו- SFB889).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | warm in 37 ºC waterbath before use |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | warm in 37 ºC waterbath before use |
| B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | 50X stock |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 100X stock |
| Penicillin / streptomycin | Gibco | 15070-063 | 50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 µg/ml |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | without L-glutamine |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| HBEGF | Sigma | 4643 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HBSS | Gibco | 14170112 | |
| FCS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | 1X |
| 100 μm nylon cell strainer | BD | 352360 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Hera Cell 240i cell culture incubator | |
| Laboratory shaker | Heidolph | Rotamax 120 | use inside cell culture incubator |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R |
References
- Puschmann, T. B., et al. Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells. Glia. 61 (3), 432-440 (2013).
- Puschmann, T. B., et al. HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins. J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Wolfes, A. C., et al. A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes. J Gen Physiol. 149 (4), (2016).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
- Krencik, R., Zhang, S. -C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).
- Morita, M., et al. Dual regulation of calcium oscillation in astrocytes by growth factors and pro-inflammatory cytokines via the mitogen-activated protein kinase cascade. J Neurosci. 23 (34), 10944-10952 (2003).
- Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).
- Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55 (2), 165-177 (2007).
- Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Res. 1190, 15-22 (2008).
- Malarkey, E. B., Parpura, V. Temporal characteristics of vesicular fusion in astrocytes: examination of synaptobrevin 2-laden vesicles at single vesicle resolution. J Physiol. 589, Pt 17 4271-4300 (2011).
- Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. J Neurosci. 2 (18), 6391-6410 (2012).
- Srinivasan, R., et al. Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).
- Shigetomi, E., et al. Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses. J Gen Physiol. 141 (5), 633-647 (2013).
- Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Otsu, Y., et al. Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling. Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).
- Agarwal, A., et al. Transient Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Induces Microdomain Calcium Transients in Astrocyte Processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).
