Summary
Die hier beschriebene AWESAM-Protokoll ist optimal für die Kultivierung von murinen Astrozyten isoliert von anderen Gehirnzellen in eine schnelle, einfache und kostengünstige Weise. AWESAM Astrozyten weisen spontane Ca2 + -Signalisierung, Morphologie und gen Expressionsprofile Astrozyten in Vivoähnlich.
Abstract
Die AWESAM (ein low- eAsy sTellate einStrocyte methode Kosten) Protokoll beinhaltet einen schnelle, einfachen und kostengünstigen Weg, um große Mengen von in-Vivo-wie Maus und Ratte Astrozyten Monokulturen : Die Gehirnzellen können aus verschiedenen Gehirnregionen isoliert werden, und nach einer Woche der Zellkultur sind nicht astrocytic Zellen indem die Kultur Gerichte auf einem Boston-Shaker für 6 h im Inkubator abgeschüttelt. Die restlichen Astrozyten sind dann in neue Platten mit einem Astrozyten-spezifischen Medium (NB + H bezeichnet) passagiert. NB + H enthält geringe Konzentrationen des Heparin-Binding EGF-Like Growth Factor (HBEGF), die anstelle von Serum in Medium verwendet wird. Nach einem Wachstum in NB + H, haben AWESAM Astrozyten ein Ganglion Morphologie und Funktion feinen Prozesse. Darüber hinaus haben diese Astrozyten mehr in-Vivo-wie gen-Expression als Astrozyten von zuvor veröffentlichten Methoden generiert. Ca2 + Bildgebung, Vesikel Dynamik und andere Veranstaltungen in der Nähe der Membran können somit in der feinen astrocytic Prozesse in Vitro, z. B.mit live Zelle konfokale oder TIRF-Mikroskopie untersucht werden. AWESAM Astrozyten zeigen vor allem auch spontan Ca2 + Signalisierung Astrozyten in Vivoähnlich.
Introduction
Astrozyten beeinflussen die Funktion des Gehirns durch trophischen Unterstützung, Durchblutung, synaptische Signalisierung und Plastizität und interzelluläre Kommunikation - sind die Mechanismen, die drehen sich um die dünnen astrocytic Prozesse. Die hier beschriebene AWESAM-Protokoll ermöglicht das Studium dieser Prozesse ohne Einmischung von Neuronen und anderen Gliazellen, die nützlich z.B.ist, weil der Ausdruck vieler Proteine und sogar Ca2 + Signalisierung über verschiedene Gehirnzelle überlappen Typen. Weiter, diese Methode überwindet Grenzen der bisher verfügbaren Techniken. Unser Protokoll sieht insbesondere in Vivo-wie Morphologie (stellate Astrozyten mit dünnen Prozesse) und Genexpression in eine schnelle, einfache und billige Weise.
Zellmorphologie, Genexpression und viele andere regulatorische Prozesse sind direkt durch die Umgebung beeinflusst. In der Kulturschale bezieht sich auf Faktoren von umgebenden Zellen, sondern auch das Medium, in dem die Zellen gezüchtet werden, veröffentlicht. Astrozyten HBEGF wurde zuvor berichtet, dass ein Ganglion Morphologie1 induzieren sondern wurde auch festgestellt, dass um Astrozyten2de-zu unterscheiden. Niedrigere Konzentrationen von HBEGF dienten jedoch später zur Erzeugung von mehr in-Vivo-wie Astrozyten über RNA Sequenzierung in zwei verschiedene Protokolle3,4identifiziert. Darüber hinaus ändert sich Astrozyten Morphologie mit mittlerer Zusammensetzung, unabhängig von dem Protokoll Nr.4: Neurobasal Medium mit einer niedrigen Konzentration von HBEGF ist optimal für den Anbau von Ganglion Astrozyten, während andere mittlere Kompositionen (z.B. Serum-haltigen DMEM) produzieren polygonale Zellen (auch in Astrozyten frisch durch Immunopanning isoliert).
Das AWESAM-Protokoll überwindet Nachteile der bisherigen Techniken für den Anbau von Astrozyten Monokulturen4. Bisherige Techniken für den Anbau von Monokulturen Astrozyten haben folgende Nachteile: polygonale Morphologie, die untypisch für Ganglion Astrozyten in Vivo (MD-Methode)5; die Länge und die Kosten des Protokolls (Vorbereitung Astrozyten von induzierten pluripotenten Stammzellen dauert drei Monate und erfordert viele Reagenzien, einschließlich teuer Wachstumsfaktoren)6; die geringen Mengen an Material (Immunopanning Methode)3; und die de-Differenzierung der Astrozyten und Anforderung einer 3D Matrix (Puschmann Et Al) 1 , 2. im Gegensatz dazu bietet das AWESAM-Protokoll: in Vivo-wie Morphologie (stellate Astrozyten mit dünnen Prozesse); eine schnelle, einfache und billige Methode; große Mengen an Material; und die in-Vivo-wie Genexpression im Vergleich mit Immunopanned und MD Astrozyten. Darüber hinaus kann 2D Kultur für die Untersuchung von Ca2 + Signal- und recycling in dünnen Prozesse und Ereignisse in der Nähe der Membran Vesikel (z.B.TIRF-Mikroskopie ist nicht möglich in 3D Kulturen).
Die MD-Methode wurde seit seiner Veröffentlichung im Jahr 19805, bietet eine einfache und schnelle Technik für polygonale Astrozyten Monokulturen ausgiebig verwendet. Kurz gesagt, die MD-Methode bringt wachsenden gemischten Gehirnzellen in fetalen Kälberserum (FCS)-mit DMEM, gefolgt von schütteln Schritte, die für Astrozyten (wie alle anderen Arten von der Schale lösen Gehirnzelle) bereichern und weiter im gleichen Medium Kultur. DMEM ergänzt mit FCS dient vielen anderen Zelltypen, Fibroblasten und Adipozyten bis hin zu verschiedenen Krebszelllinien, die teilen die polygonale Morphologie von MD Astrozyten in Kultur ausgestellt. Bis zu den frühen 2000er Jahren7, war wenig Gedanken gewesen Medien zugeschnitten auf Astrozyten gegeben, insbesondere zugunsten ihrer typischen stellate Morphologie in Vivogefunden. Ein Protokoll veröffentlicht im Jahr 2011 wird solche stellate Morphologie erreicht: die Immunopanning-Methode aufgerufen, es beschäftigt serumfreien Medium für die Kultivierung von Astrozyten3optimiert. Mit dieser Methode sind frisch isolierte Gehirnzellen ausgesetzt eine Reihe von Gerichten beschichtet mit Antikörpern, die auf Zelle typspezifische Zelle Oberflächenproteine für Astrozyten zu bereichern. Trotz mehr in-Vivo-wie Morphologie und Ausdruck Profil Immunopanned Astrozyten, die Mehrheit der in-vitro- Studien noch auf die MD Astrozyten Methode verlassen. Die MD-Methode ist einfach und schnell, während die Immunopanning-Methode komplexe und zeitaufwendige Schritte am ersten Tag der Kultur umfasst (z. B. Enzym Verdauung längere, sorgfältige Schichtung der Lösungen von unterschiedlicher Dichte, Immunopanning, und Zentrifugation Schritten - alles vor der Beschichtung). Die AWESAM-Methode bietet jedoch mithilfe von spezielleren Medium sowohl die Geschwindigkeit der MD-Methode und die in-Vivo-wie Morphologie des Immunopanning-Protokolls.
Insgesamt das AWESAM-Protokoll eignet sich für ein Studium mehr in Vivo-wie Astrozyten in 2D Monokulturen von Neuronen und anderen Glia (wie bisher charakterisierten4 von Immunostainings, Immunoblots und RNA Sequenzierung) isoliert. Es ermöglicht die Untersuchung von dünnen astrocytic Prozessen und bietet guten Zugang zur Visualisierung von spontanen Ca2 + Signalisierung und Veranstaltungen in der Nähe der Membran (z.B.durch TIRF-Mikroskopie abgebildet).
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Protocol
Alle hier beschriebenen Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien für den deutschen Tierschutz durchgeführt.
Hinweis: Die Timeline und die Hauptschritte des Protokolls sind in Abbildung 1dargestellt.
1. Vorbereitungen
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Bereiten Sie die folgenden Lösungen.
- Vorbereiten der DMEM + Kultivierung polygonale MD Astrozyten: DMEM mit 10 % FCS, 100 U Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin.
- Vorbereiten der Kultivierung stellate Astrozyten NB + H: Neurobasal Medium mit 5 ng/mL HBEGF, 1 x B-27 Ergänzung, 1 X Glutamin ergänzen, 100 U Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin.
Hinweis: Aliquote höherer Konzentrationen von HBEGF erstellt und gespeichert werden können bei-20 ° C auf das Medium bei Bedarf hinzugefügt werden. - Bereiten Sie die Dissektion Medium (10 mM HEPES in HBSS).
- Bereiten Sie Aliquote von 6-7 mL 0,05 % Trypsin-EDTA und 6-7 mL 0,25 % Trypsin-EDTA in 15 mL-Tuben. Diese können bei-20 ° C gelagert und in einem 37 ° C Wasserbad aufgetaut.
- Am Tag vor Beginn des Protokolls Mantel 10 cm Gewebekultur-behandelten Gerichte mit 5 mL je 0,04 % Polyethylenimine (PEI).
- Am nächsten Tag die PEI zu entfernen und den Abwasch mit destilliertem, entionisiertem Wasser zweimal. Jede Platte 12 mL DMEM + hinzu und Pre-equilibrate im Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 für mindestens 30 min vor der galvanischen Zellen.
- Vorbereiten der Dissektion Bereich: In einer Laminar-Flow Dissektion Kapuze, legen Sie zwei 10 cm Petrischalen mit Dissektion Medium auf Eis gefüllt. Für jeden Bereich des Gehirns werden isoliert (z.B.Kortex, Hippocampus), bereiten Sie eine 15-Röhre mit 14 mL Dissektion Medium gefüllt und halten Sie auf dem Eis. Sprühen Sie Dissektion Werkzeuge (feine Schere, Dumont #3 und #5 Zangen) mit 70 % Ethanol und Platz neben Dissektion Mikroskop in der Kapuze.
(2) Ratte oder Maus Gehirn Dissektion
Hinweis: Beide Mäuse und Ratten eingesetzt werden. Tiere, die älter als P8 kann auch verwendet werden (wir testeten bis P12), aber die Hirnhaut entfernen wird zunehmend schwieriger geworden. Darüber hinaus werden sich die Zellausbeute und Gesundheit abnehmen, da Gehirnzellen von älteren Tieren gebildet haben, komplizierte Prozesse und Verbindungen, die im Gewebe Dissoziation, führt zu erhöhte Zelltod brechen können. Kortikale Vorbereitungen werden hier beschrieben, aber andere Hirnregionen können auch verwendet werden.
- Legen Sie 0,05 % Trypsin-EDTA in einem 37 ° C Wasserbad.
- Einschläfern von Tieren (trächtigen Ratten für E19 Welpen oder P0-P8 Tiere) durch langsames anheben CO2 -Konzentration und die Gehirne zu isolieren. Die folgenden Schritte erfordern sterilen Technik.
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Arbeiten mit embryonalem Gewebe entfernen Sie zunächst die Embryonen aus der Gebärmutter und die embryonalen Säcke zu öffnen, dann sofort die Köpfe mit einer Schere abgeschnitten. Wenn alle Köpfe abgeschnitten sind, in vorgekühlte Dissektion Medium übertragen.
- Sobald die Köpfe in das Medium eingetaucht sind, öffnen Sie die Haut und Schädel (beide sind sehr weich bei Jungtieren) mit Zange und Prise aus dem Kleinhirn. Hebeln Sie vorsichtig den Rest des Gehirns, und aus dem Schädel.
Hinweis: Zwei bis vier E19 Embryonen liefern genügend Gewebe für mindestens acht 10 cm Gerichte der kortikalen Astrozyten, die am Tag der Dissektion auf 500.000 Zellen pro Schale vergoldet.
- Sobald die Köpfe in das Medium eingetaucht sind, öffnen Sie die Haut und Schädel (beide sind sehr weich bei Jungtieren) mit Zange und Prise aus dem Kleinhirn. Hebeln Sie vorsichtig den Rest des Gehirns, und aus dem Schädel.
- Für Neugeborene oder älteren Welpen die Köpfe mit einer Schere abgeschnitten und die Gehirne von medial schneiden Sie die Haut in einer geraden Linie von der Rückseite des Kopfes bis zur Spitze der Nase zu isolieren. Ziehen Sie die Haut beiseite und sorgfältig geschnitten, der Schädel links und rechts und heben der Schädel Knochen. Das Kleinhirn abgeschnitten, und den Rest des Gehirns aus dem Schädel heraus hebeln.
Hinweis: Zwei bis drei P0-P8 Welpen liefern genügend Gewebe für mindestens acht 10 cm Gerichte der kortikalen Astrozyten, die am Tag der Dissektion auf 500.000 Zellen pro Schale vergoldet. - Die zugrunde liegende Struktur des Zwischenhirns trennen Sie Kortex. Legen Sie die Zange innerhalb der längs-Riss zwischen den Hemisphären, fahren Sie die Zange zwischen Kortex und Mittelhirn Strukturen der südlichen Hemisphäre (senkrecht zur längs-Riss) jede Hemisphäre frei zu klemmen.
- Mit der Pinzette, entfernen Sie alle Hirnhaut aus jeder Hemisphäre (und den Hippocampus), dann trennen Sie die Hippocampi. Wenn hippocampale Astrozyten erforderlich sind, verschieben Sie jedes Hippocampus in eine 15 mL-Tube mit 14 mL Dissektion Medium auf Eis gefüllt.
- Entfernen Sie weitere Bereiche von jeder Hemisphäre Kortex, wenn bestimmte Regionen erforderlich (z.B.frontalen Kortex) sind. Schneiden Sie alle kortikalen Gewebe verwendet werden, für die Erzeugung von Astrozyten in Stücke, die nicht größer als 1 mm3. Sammeln Sie alle Stücke von kortikalen Gewebe in einer separaten 15-mL-Tube mit Dissektion Medium auf Eis gefüllt.
(3) Gewebe Verdauung und Dissoziation
- Sobald alle Gewebe Stücke gesammelt sind, warten Sie, bis sie an der Unterseite des Rohres zu Regeln, dann aspirieren Sie soviel Mittel wie möglich.
- Fügen Sie 2-3 mL 0,05 % Trypsin-EDTA mit einer serologischen Pipette, und inkubieren Sie die Rohre im Wasserbad 37 ° C für 20 min.
Hinweis: Lassen Sie alle Trypsin-EDTA aus der Pipette rasch zu mischen die Gewebe-Stücke und lassen Sie sich wieder. - Aspirieren Sie sorgfältig die Trypsin-EDTA, so dass Gewebe Stücke in als wenig Flüssigkeit wie möglich, am unteren Ende der Röhre.
- Fügen Sie 5 mL Medium vorgekühlt Dissektion der verbleibenden Trypsin-EDTA abwaschen. Pipette auf die Seite des oberen Teils des Rohres zu erreichen der Gewebe Stücke mischen.
- Aspirieren der Dissektion Medium, und Gewebe Stücke in als wenig Flüssigkeit wie möglich zu verlassen. Wiederholen Sie diese Waschschritt mit vorgekühlten Dissektion Medium noch zweimal.
- Fügen Sie nach dem letzten Waschschritt 1 mL DMEM + (auf Zimmertemperatur erwärmt) mit 1.000 µL Pipettenspitze und das Gewebe durch Pipettieren genannte oben und unten ohne Luftblasen einzuführen.
Hinweis: Es ist wichtig, zu vermeiden, Herstellung von Bläschen, da dies, den pH-Wert der Lösung ändern kann, auf die Astrozyten sehr empfindlich sind. - Ein 100 µm Zelle Sieb in der Eröffnung einen 50-mL-Tube und Vornässen des Filters mit 4,5 mL vorgekühlte DMEM +.
- Pipette 1 mL der dissoziierten Gewebe Suspension auf die Zelle Sieb und fügen Sie eine weitere 4,5 mL vorgekühlt DMEM + die Zellen durch die Zelle Sieb zu waschen.
(4) Zelle Überzug für Astrozyten Bereicherung durch Passagierung
- Zählen Sie die Zellen, z. B.durch Verdünnen 10 µL Zellsuspension mit 10 µL Trypan blau und Pipettieren der Mischung auf eine Hemocytometer.
- Platte 500.000 Zellen in 12 mL DMEM + pro 10 cm Schale.
Hinweis: DMEM + ist nützlich für astrocytic Wachstum, mehr noch als für Neuronen oder Mikroglia. Beim Schütteln sind die körperlichen Kräfte auf Glasdeckgläser im Brunnen viel stärker als die in der 10-cm-Gerichte (ohne Deckgläsern) handeln. Wenn Zellen auf 24-Well Platten erschüttert sind, sie zu ungesunden oder sterben. Nur Platte Astrozyten auf 24-Well-Platten nach dem schütteln. - Halten Sie Zellkulturen im Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 für sieben Tage.
- Am 6. Tag bereiten Sie am Vortag schütteln und Passagierung Zellen, die Kultur PEI-beschichteten Platten wie in Schritt 5 beschrieben.
5. Passagierung Zellen
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Am Vortag Passagierung, Mantel Zellplatten Kultur mit 0,04 % PEI.
- Verwenden Sie für Immunocytochemistry, virale Transduktion oder Plasmid Transfektion 24 wohlen oder 6-Well-Platten (jeweils eine sterilisierte 12 mm oder 25 mm Glas Deckglas, beziehungsweise).
- Sterilisieren Sie der Glasdeckgläser durch Inkubation in 70 % igem Ethanol für mindestens 1 h, dann waschen Sie dreimal in destilliertem, entionisiertem Wasser vor dem Einlegen der Deckgläsern in den Brunnen zu.
- Fügen Sie mindestens 70 µL 0,04 % PEI pro 12 mm Deckglas in 24-Well-Platten und 600 µL 0,04 % PEI pro 25 mm Deckglas in 6-Well Platten.
- Für Western-Blot oder RNA-Seq-Analyse können die 10 cm Gerichte bereits enthalten die Zellen nach der Dissektion weiterhin verwendet werden. Gerichte müssen nur geschüttelt werden, dann die Zellen sind mit 1 X PBS gewaschen und mit NB + H behandelt (nicht auf neue Gerichte übertragen).
- Am Tag in Vitro (DIV) 7 nach der Präparation die 10-cm-Gerichte mit Zellen in DMEM + auf einem Labor-Shaker im Inkubator und schütteln Sie die Gerichte bei 110 u/min für 6 h.
- Das PEI aus beschichteten Deckgläsern mit destilliertem, entionisiertem Wasser zweimal abwaschen. Die Platten (500 µL pro Bohrloch für 24-Well-Platten und 2 mL pro Bohrloch für 6-Well Platten) NB + H Medium hinzufügen. Pre-equilibrate die Platten im Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 während die 10 cm Teller Zittern oder für mindestens 30 Minuten.
- 20-30 Minuten vor dem Ende des 6 h schütteln, Vorwärmen 1 X PBS, DMEM + NB + H und 0,25 % Trypsin-EDTA auf 37 ° C im Wasserbad.
- Nach 6 h schütteln, den Shaker Kultur Gerichte ausziehen und sofort ersetzen das Medium (das erschüttert aus Nervenzellen und Oligodendrozyten Mikroglia enthält) mit 10 mL vorgewärmt 1 X PBS pro Schale.
Hinweis: Es ist wichtig, sofort das alte Medium freistehende Zellen zur Vermeidung von nicht-astrocytic Zellen wieder anbringen Aspirieren. - Entfernen der PBS und 3 mL vorgewärmten Trypsin-EDTA pro Schale. Inkubieren Sie jedes Gericht für 4 min. im Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2.
Hinweis: Wenn Vorbereitung von Proben für Western-Blot oder RNA-Seq fügen Sie keine Trypsin-EDTA. Stattdessen vorgewärmt ersetzen die PBS mit 12 mL NB + H, nach denen Kulturen wieder in den Inkubator platziert werden können. - Fügen Sie 5 mL vorgewärmten DMEM + bis 3 mL Trypsin-EDTA in jedem Gericht, die Zellen von der Schüssel mit einer serologischen Pipette 5 mL pipette und sammeln die Zellsuspension in ein 50 mL-Tube.
Hinweis: Pipette direkt aus dem Boden der Schale - sollte der Boden der Schale deutlicher als die Zellen lösen. Verwenden Sie nur Serum-haltigen Medium (anstelle von DMEM +), da Serum Trypsin inaktiviert. - Zentrifugieren Sie die Zellsuspension 3.220 x g bei 20 ° C für 4 min.
- Entfernen Sie den Überstand und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL vorgewärmt NB + H.
6. Zelle Überzug für endgültige Astrozyten Kulturen
- Zählen der Zellen.
- Platte, 20.000 Zellen pro Bohrloch in 6-Well-Platten (in 2 mL NB + H Medium pro Well) oder 5.000 pro Bohrloch in 24-Well-Platten (in 500 µL NB + H Medium pro Well).
- Bewahren Sie die Zellkulturen im Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 bis Weiterbehandlung oder Analyse.
- Tauschen Sie halbe Medium einmal pro Woche.
Hinweis: In nährstoffarme Umgebungen, Astrozyten stoppen wuchern aber alle restlichen Mikroglia wird sich vermehren (obwohl nach unserer Erfahrung keine Mikroglia in AWESAM Kulturen erschienen). Austausch von halbe Medium einmal wöchentlich Bereicherung jeder potenziell verbleibenden Mikroglia-8 verhindert, und die Monokulturen für mindestens drei Wochen gesund bleiben.
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Representative Results
Astrozyten, die gemeinsam mit Neuronen kultiviert und angebaut in NB + Medium erscheinen Ganglion nach 2 Wochen der Kultur (Abbildung 2). Neben NB + Medium sind Co kultivierten Astrozyten auch unbekannte Neuron-abgeleitete Faktoren ausgesetzt, die wahrscheinlich um ihr Überleben und Ihre Morphologie beitragen. Im Gegensatz dazu erscheinen MD Astrozyten in DMEM + als Monokulturen angebaut (nach anderen Zelltypen vor Passage abschütteln) polygonalen nach 2 Wochen. AWESAM Astrozyten in NB + H nach dem Schütteln, angebaut werden nach 2 Wochen der Kultur Ganglion mit vielen feinen Prozessen angezeigt.
Bisher zeigten wir, dass die RNA-Expressionsprofil des AWESAM Astrozyten näher an der Astrozyten in Vivo im Vergleich zu MD und Immunopanned Astrozyten4ist. In Bezug auf die Astrozyten-spezifische Protein-Expression express kortikale Astrozyten hohe ALDH1L1 und niedrige Konzentrationen von GFAP in Vivo12. Dies gilt auch für AWESAM Astrozyten und die Immunostaining ALDH1L1, als eine cytoplasmatische Enzym zeigt feinere Details als das Zellskelett Protein zuzuführen (Abbildung 2B).
Abgesehen von der RNA und Protein Ausdruck Astrozyten in Vivo zeigen spontane Ca2 + Signalisierung (d.h.ohne äußere Stimulation), aber polygonalen MD Astrozyten in Vitro erfordern oft Stimulation auf Ca2 + entlocken Signaltechnik, z. B.durch Zugabe von ATP oder Glutamat. AWESAM Astrozyten weisen spontane Ca2 + Signalisierung in Vivo, in Zellkörpern und feine Prozesse, die durch Viral transducing Zellen mit der Membran-gezielte Lck-GCaMP3 (Abbildung 3) sichtbar gemacht werden können. Auch auftreten spontane Wellen von Ca2 + im gesamten angrenzenden Astrozyten(Abbildung 3). Astrocytic Ca2 + Signalisierung (Abbildung 3B) in feinen Prozesse und Microdomains kann mit analysiert werden spezifisch für Astrozyten13Freeware.
Abbildung 1 : Protokoll Timeline. Eine Zeitleiste mit die wichtigsten Schritte des AWESAM-Protokolls, darunter die Zeit, die zum Durchführen dieser Schritte auf DIV0 (Tag der Dissektion), DIV7 (Tag der Passage), und was Sie zu späteren Zeitpunkten zu erwarten. Das grüne Kästchen veranschaulicht, wenn Zellen als Ganglion Astrozyten geerntet werden können, wo leichter im Vergleich zu dunklere Tönen stellen weniger im Vergleich zu komplexeren stellate Morphologie und Reife, bzw.. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Medium bestimmt Morphologie. (A) Schaltplan zeigt, wie Astrozyten Morphologie verändert, wenn Co mit Neuronen (wie zuvor beschrieben4) vs. als Monokulturen angebaut, und je nach dem Medium kultiviert. Astrozyten-spezifische Färbung mit GFAP Umrisse der Ganglion Morphologie in Co kultiviert und AWESAM Astrozyten und die polygonale Morphologie in MD Astrozyten. (B) GFAP Etiketten MD Astrozyten stärker als ALDH1L1, und ALDH1L1 (aber nicht GFAP) beschreibt die feinen Prozesse der AWESAM Astrozyten. Weder Astrozyten Monokultur Exponate den neuronalen Marker MAP2. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Spontane Ca2 + signalisieren in den Astrozyten. (A) AWESAM GCaMP ausgestrahlt Astrozyten Ausstellung spontan Ca2 + Veranstaltungen in Astrozyten vernetzt, unter anderem in den dünnen Prozessen (Pfeilspitzen). Eine Ca2 + Welle durchläuft mehrere Astrozyten von links nach rechts in Bildern von unterschiedlichen Zeitpunkten, wo helle Farbe zeigt Bereiche der hohen Ca2 + Konzentrationen und schwarze Bereiche repräsentieren extrazelluläre Regionen. Bilder wurden aufgenommen mit live Zelle konfokalen Mikroskopie. (B) Ca2 + -Konzentrationen ändern in den farblich gekennzeichneten Regionen (A) im Laufe der Zeit als GCaMP-Fluoreszenz-Intensität-Spuren, die veranschaulichen, wie eine Ca2 + Welle Signalisierung über mehrere Astrozyten verteilt angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Vier Schritte innerhalb des Protokolls sind von entscheidender Bedeutung: 1) Vorbereitung der HBEGF-Konzentration auf genau 5 ng/mL, da kleine Erhöhungen der Konzentration zu unreif Kulturen, z. B.führen können 10 ng/mL HBEGF de differenzieren Astrozyten4; (2) Vermeidung von Luftblasen in den Lösungen, die Gewebe oder Zellen, die den pH-Wert verändern und behindern Astrozyten Gesundheit enthalten; (3) Pre-ausgleichende Medien, der optimale pH-Wert und Temperatur für den Anbau von gesunder Astrozyten zu erreichen; (4) den Austausch von nur die Hälfte der Mittel einmal in der Woche weil alle verbleibenden Mikroglia sind weniger wahrscheinlich zu vermehren, wenn genügend Nährstoffe vorhanden sind und das Medium ist tauschten regelmäßig8 (obwohl keine Mikroglia fanden sich in AWESAM Kulturen so weit). Für diesen letzten Punkt ist es wichtig zu beachten, dass Astrozyten abgeleitete Faktoren innerhalb der Kultur nicht vollständig entfernt werden sollte, da sie astrocytic überleben, Differenzierung und Proliferation unterstützen können.
Es ist wichtig, DIV14 oder älteren Kulturen die Reifen Astrozyten Quelle verwendet (aber für Transduktion oder Transfektion Schritte, frühere Kulturen genutzt werden können) weil Astrozyten jünger als DIV14 immer noch mögliche neurale Stammzellen9. Für virale Transduktion Mischkulturen von Neuronen und Astrozyten ausgestrahlt auf DIV7 (mit Adeno-assoziierten Viren) effizient ausdrücken Viral GFP10ausgestrahlt. Für Plasmid Transfection DIV10-DIV24 Astrozyten werden häufig verwendet, und Fluorophor-markierten Proteine abgebildet 2-5 Tage später11. Nach unserer Erfahrung funktionieren virale Transduktion und Plasmid Transfektion am besten, wenn Astrozyten zwischen DIV9 und DIV14 ausgestrahlt werden. Die Transfektion und Transduktion Effizienz hängen vom Konstrukt und Methode, aber wir finden, dass Transfektion Wirkungsgrad liegt bei ~ 20 % in Astrozyten Monokulturen mit Lipofectamine Transfektion und Adeno-assoziierte Virus (AAV) Transduktion Effizienz ~ 90 % ( Siehe unsere bisherige Arbeit4 für weitere Einzelheiten, z. B., Konstrukt verwendet). Wenn Astrozyten mit AAV-Partikeln und transfecting von Lipofectamine transducing, dürfen wir mindestens 5 und 2 Tage, jeweils für den Ausdruck des Konstrukts. Vor dem Transduktion oder Transfektion darf die Astrozyten auch für mindestens einen Tag nach Passagierung wiederherstellen.
Darüber hinaus zeigt Vergleich RNA/Protein-Expression zu anderen Kulturen vorbereiten, kann Kulturen können in unterschiedlicher Dichte zu erreichen ähnliche Mengen von Material, z.B., Astrozyten Monokulturen bei DIV7 geerntet werden vergoldet und DIV21 bei dichten von 1 x 106 und 500.000 Zellen pro 10 cm Schale, vergoldet bzw.. Zum Beispiel werden die gesamten Protein lysate Ausbeute um 0,5 mg/mL auf DIV14 wenn nach anfänglich Plattieren 500.000 AWESAM Astrozyten auf einer 10-cm-Schüssel geerntet.
Das AWESAM-Protokoll stellt einen schnelle, einfachen und kostengünstigen Weg, um Kultur Astrozyten isoliert von Neuronen, aber mit in Vivo-Eigenschaften von RNS und Protein-Expression, Morphologie und Ca2 + 4, Signalisierung, wie die bisher wird durch kein anderes Protokoll bereitgestellt. AWESAM Astrozyten können für Analysen verwendet werden, die typisch für Zell-Kultur-Studien, einschließlich Immunocytochemistry, Immunoblotting, RNA Expressionsanalyse, TIRF-Mikroskopie und imaging Ca2 + 4sind. Jüngste Fortschritte in der genetisch codierten Ca2 + Indikatoren ermöglichen insbesondere für feine astrocytic Prozesse detaillierter als klassische Ca2 + Farbstoffe14visualisieren. Ca2 + Signalisierung, vesikuläre Aufnahme und Exozytose in dick und dünn astrocytic Prozesse ist physiologisch relevant, da diese Prozesse Funktion des Gehirns in Bezug auf die trophischen Unterstützung, Durchblutung, synaptische Signal- und Plastizität, beeinflussen können und interzelluläre Kommunikation. Das AWESAM-Protokoll ermöglicht für die Studie der feinen astrocytic Prozesse relevant für Gehirn Physiologie15 und Krankheit16,17, neuronale störungsfrei und mit der großen Verfügbarkeit dieser in-vitro- Kultur-Lieferungen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir anerkennen die Finanzierung durch den Europäischen Forschungsrat (RP7/260916), die Alexander von Humboldt-Stiftung (Sofja Kovalevskaja) und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DE1951 und SFB889).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | warm in 37 ºC waterbath before use |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | warm in 37 ºC waterbath before use |
| B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | 50X stock |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 100X stock |
| Penicillin / streptomycin | Gibco | 15070-063 | 50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 µg/ml |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | without L-glutamine |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| HBEGF | Sigma | 4643 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HBSS | Gibco | 14170112 | |
| FCS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | 1X |
| 100 μm nylon cell strainer | BD | 352360 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Hera Cell 240i cell culture incubator | |
| Laboratory shaker | Heidolph | Rotamax 120 | use inside cell culture incubator |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R |
References
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