Summary
여기에 설명 된 AWESAM 프로토콜은 빠르고, 단순 하 고 저렴 한 방식으로 다른 뇌 세포 분리에서 murine 이다 경작에 최적입니다. AWESAM 이다 자발적인 캘리포니아2 + 신호, 형태학, 및 유전자 식 프로필 이다에서 vivo에서유사한 전시.
Abstract
AWESAM (는 low- e유도 stellate는 strocyte method 비용) 프로토콜 수반 vivo에서의 대량을 생성 하는 빠르고, 간단 하 고 저렴 한 방법-마우스와 쥐 사이토 monocultures 같은 : 뇌 세포는 서로 다른 뇌 영역에서 고립 될 수 있다 고 주 후에 세포 배양의, 비 astrocytic 셀 인큐베이터에 6 h에 대 한 통에 문화 요리를 배치 하 여 떨어져 동요는. 나머지 이다 (불리 NB + H) 사이토 관련 매체와 새로운 접시에 다음 passaged 있습니다. NB + H 혈 청 매체에 대신 사용 되는 헤 파 린 바인딩 EGF 같은 성장 인자 (HBEGF)의 낮은 농도 포함 합니다. NB + H, 성장 후 AWESAM 이다 방사상 형태와 기능은 괜 찮 프로세스 있다. 또한,이 이다 더 많은 비보에있다-같은 보다 이전에 게시 방법으로 생성 하는 이다 유전자 발현. 캘리포니아2 + 영상, 기 역학, 고 막 가까이 다른 이벤트 따라서 벌금 astrocytic 프로세스에서 생체 외에서 예를 들어, 라이브 셀 confocal 또는 TIRF 현미경을 사용 하 여 공부 될 수 있다. 특히, AWESAM 이다 또한 전시 자발적인 캘리포니아2 + 신호 이다에서 vivo에서유사한.
Introduction
영양 지원, 혈액 흐름, 시 냅 스 신호 및 소성, 및 세포 통신-는 모두 얇은 astrocytic 프로세스 중심 메커니즘을 통해 뇌 기능에 영향을 이다. 여기에 설명 된 AWESAM 프로토콜을 사용 하는 유용한 예를 들어, 많은 단백질 및 심지어 캘리포니아2 + 신호 표현의 다른 뇌 세포에 걸쳐 다른 명과 뉴런에서 간섭 없이 이러한 프로세스의 연구 유형입니다. 또한,이 방법은 이전에 사용할 수 있는 기술의 한계 극복. 특히, 우리의 프로토콜 vivo에서제공-형태학 (방사상 이다 얇은 프로세스) 및 유전자 발현에 빨리, 쉽게, 그리고 저렴 한 방식으로 같은.
셀 형태, 유전자 발현, 그리고 다른 많은 규제 프로세스는 직접 환경에 의해 영향을 받습니다. 문화 접시에이 주변의 세포 뿐만 아니라 세포 재배 되 고 있는 매체에 의해 발표 하는 요소를 말합니다. 이다, HBEGF 방사상 형태로1 을 유도 하기 위해 이전에 보고 하지만 드 이다2를 차별화 하는 또한 발견 했다. 그러나, HBEGF의 낮은 농도 나중 더 vivo에서생성 하는 데 사용 했다-두 개의 서로 다른 프로토콜3,4RNA 시퀀싱을 통해 발견 이다 처럼. 또한, 사이토 형태학 프로토콜4에 중간 구성 변경: HBEGF의 낮은 농도와 Neurobasal 매체는 방사상 이다 (예를 들어, 다른 중간 작곡 하면서 성장을 위한 최적의 혈 청-포함 된 DMEM) (immunopanning에 의해 고립 된 갓 이다)에 다각형 세포를 생산.
AWESAM 프로토콜 사이토 monocultures4성장에 대 한 이전 방법의 단점을 극복 했다. 성장 하는 사이토 monocultures 이전 기술은 다음과 같은 단점이 있습니다: 방사상 이다에 vivo에서 (MD 방법)5;의 특성은 다각형 형태 길이 비용 (유도 만능 줄기 세포는 이다 3 개월을 준비 하며 고가의 성장 인자를 포함 하 여 많은 시 약) 프로토콜의6; 낮은 양의 재료 (immunopanning 방법)3; 이다의 탈 분화와 3D 매트릭스 (Puschmann 외.)의 요구 사항 1 , 2. AWESAM 프로토콜을 제공 하는 반면,: vivo에서-같은 형태 (얇은 프로세스와 방사상 이다); 빠른, 쉽게, 그리고 저렴 한 방법; 대량의 물자; 그리고 vivo에서가장-같은 비해 immunopanned 및 MD 이다 유전자 발현. 또한, 2D 문화 캘리포니아2 + 신호 및 얇은 프로세스, 고 막 가까이 이벤트 재활용 기의 연구에 대 한 수 있습니다 (예를 들어, TIRF 현미경 불가능 3D 문화에서).
MD 메서드는 19805, 다각형 사이토 monocultures는 간단 하 고 빠른 기술 제공에 그것의 간행물부터 광대 하 게 사용 되었습니다. 간단히, MD 메서드 수반 송아지 태아 혈 청 (FCS)에서 성장 혼합된 뇌 세포-(다른 모든 뇌 세포 유형을 분리 접시에서)로 이다에 대 한 풍부 하 고 더 동일한 매체에 문화 단계를 흔들어 뒤 DMEM, 포함 된. DMEM fcs 보충 fibroblasts 및 adipocytes에서 다른 암 세포 선, 모두의 공유 문화에서 MD 이다에 의해 전시 다각형 형태에 이르기까지 많은 다른 세포 유형, 사용 됩니다. 초기 2000 년대7까지 작은 생각 했던 특히 그들의 전형적인 방사상 형태를 선호 하 미디어 이다에 맞게 주어진 에 비보를 발견. 2011 년에 출판 한 프로토콜 같은 방사상 형태를 달성지 않습니다: 혈 청 자유로운 매체 이다3경작을 위해 최적화 된 사용 immunopanning 메서드를 호출. 이 메서드를 사용 하 여 갓 고립 된 뇌 세포는 대상 셀 형식 관련 세포 표면 단백질, 이다에 대 한 풍부 하 게 하는 항 체로 입힌 요리 시리즈에 노출 됩니다. 더는 비보에도 불구 하 고-immunopanned 이다의 형태와 식 프로필, 같은 생체 외에서 연구의 대다수는 여전히 MD 사이토 방법에 의존. MD 메서드는 간단 하 고 빠른, 문화의 첫 번째 날에 더 복잡 하 고 시간이 많이 걸리는 단계를 구성 하는 immunopanning 메서드 (더 이상 효소 소화 기간 등 다른 밀도, 자체, immunopanning 솔루션의 주의 레이어 링 및 여러 원심 분리 단계-모든 도금 하기 전에). 그러나, 보다 전문적인된 매체를 사용 하 여 AWESAM 메서드를 사용 하면 두 속도의 MD 메서드는 vivo에서제공-immunopanning 프로토콜의 형태 처럼.
전반적으로, AWESAM 프로토콜은 더 vivo에서공부 하는 데 유용-2D monocultures (immunostainings, immunoblots, 및 RNA 시퀀싱에 의해 이전 특징된4 )로 신경 및 다른 명과 격리에서 이다 처럼. 그것은 얇은 astrocytic 프로세스의 연구에 대 한 허용 하 고 자연 스러운 캘리포니아2 + 신호 (예를 들어, TIRF 현미경 검사 법에 의해 몇 군데) 막 가까이 이벤트 시각화를 위한 훌륭한 접근을 제공 합니다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 동물 실험은 독일 동물 복지에 대 한 지침에 따라 수행 했다.
참고: 타임 라인 및 프로토콜의 주요 단계는 그림 1에서 그림.
1입니다. 준비
-
다음과 같은 솔루션을 준비 합니다.
- DMEM + 다각형 MD 이다 경작에 대 한 준비: DMEM 10 %FCS 100 U 페니실린, 100 µ g/mL 스.
- NB + H 방사상 이다 경작에 대 한 준비: 5 ng/mL HBEGF, B-27 보충, 1 x 글루타민 보충, 100 U 페니실린과 100 µ g/mL 스 x 1와 neurobasal 매체.
참고: HBEGF의 높은 농도의 Aliquots 준비 고 필요할 때마다 중간에 추가 될-20 ° C에서 저장 될 수 있습니다. - 절 개 매체 (10 mM HEPES HBSS에)를 준비 합니다.
- 0.05% 트립 신-EDTA와 6-7 mL 15 mL 튜브에 0.25% trypsin EDTA의 6-7 mL의 aliquots을 준비 합니다. 이 37 ° C 물 목욕에 해 동 고-20 ° C에서 저장 될 수 있습니다.
- 프로토콜을 시작 하기 전에 날 코트 0.04 %polyethylenimine (페이) 각의 5 mL와 10 cm 조직 문화 취급 요리.
- 다음 날는 페이 제거 하 고 두 번 이온, 증 류 물으로 설거지. DMEM + 12 mL 각 접시에 추가 하 고 미리 셀을 도금 하기 전에 적어도 30 분 동안 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서 equilibrate.
- 해 부 지역 준비: 층 류 절 개 후드, 장소 2 10 cm 배양 접시 가득 얼음에 해 부 매체. 되도록 각 뇌 영역에 대 한 (예, 피 질, 해 마), 절연 15 튜브 14 mL 절 개 매체와 가득 준비 하 고 얼음에 계속. 70% 에탄올와 후드에 해 부 현미경 옆 해 부 도구 (좋은 위, Dumont #3, #5 집게)를 스프레이.
2. 쥐 또는 마우스 뇌 해 부
참고: 두 쥐 쥐를 사용할 수 있습니다. P8도 사용할 수 있습니다 보다 더 오래 된 동물 (우리는 P12까지 테스트), 하지만 meninges 제거 점점 더 어렵게 될 것입니다. 또한, 셀 생산량 및 건강 것입니다 축소, 이후 복잡 한 프로세스와 연결 조직 분리, 증가 된 세포 죽음으로 이어지는 동안 휴식 수 있습니다 오래 된 동물에서 뇌 세포 형성 됩니다. 대뇌 피 질의 준비 설명, 하지만 다른 뇌 영역을 사용할 수 있습니다.
- 37 ° C 물 욕조에 0.05% 트립 신-EDTA를 놓습니다.
- CO2 농도 천천히 올려서 (임신 쥐 E19 새끼 또는 P0-P8 동물) 동물을 euthanize 하 고 두뇌를 분리. 다음 단계는 메 마른 기술 필요.
-
배아 조직으로 작업 하는 경우 먼저 자 궁에서 태아를 제거 하 고 배아 낭 열고 즉시가 위로 머리를 잘라. 모든 머리는 잘라, 미리 냉각된 해 부 중간에 그들을 전송 합니다.
- 일단 머리는 중간에 잠긴, 집게와 소 뇌에서 핀치 피부와 두개골 (둘 다는 매우 부드러운 젊은 동물에서)을 엽니다. 신중 하 게 레버 두개골에서 뇌의 나머지.
참고: 2 ~ 4 E19 배아 항복 해 부의 날에 접시 당 500000 셀에 도금 하는 대뇌 피 질의 이다의 적어도 8 10 cm 요리에 대 한 충분 한 조직.
- 일단 머리는 중간에 잠긴, 집게와 소 뇌에서 핀치 피부와 두개골 (둘 다는 매우 부드러운 젊은 동물에서)을 엽니다. 신중 하 게 레버 두개골에서 뇌의 나머지.
- 신생아 이상 강아지에 대 한가 위, 머리를 잘라 하 고 두뇌 medially 코 끝에 머리 뒤쪽에서 직선에 피부를 절단 하 여 분리 합니다. 옆으로 그리고 신중 하 게 잘라 두개골 왼쪽 및 오른쪽, 다음 리프트를 두개골 뼈 피부를 당겨. 소 뇌, 떨어져 고 레버는 두개골에서 뇌의 나머지.
참고: 2 ~ 3 P0-P8 새끼 양보 해 부의 날에 접시 당 500000 셀에 도금 하는 대뇌 피 질의 이다의 적어도 8 10 cm 요리에 대 한 충분 한 조직. - 기본 midbrain 구조에서 피 질을 구분 합니다. 다음 장소는 반구 사이 fissure 내 집게 꼬집어 각 반구 무료 (경도 균열에 수직) 한 반구의 피 질 및 midbrain 구조 사이 집게를 이동 합니다.
- 집게를 사용 하 여 모든 meninges 각 반구 (와 그것의 해 마), 다음은 된 분리. Hippocampal 이다 필요한 경우 14 mL 해 부 중간에 얼음으로 가득 15 mL 튜브에 각 마를 이동 합니다.
- 제거 더 지역 각 반구의 피 질에서 특정 영역은 필요 (예를 들어, 담당). 잘라 1 m m3보다 더 큰 조각으로 이다 생성 하는 데 사용할 모든 대뇌 피 질의 조직. 해 부 중간에 얼음 가득 별도 15 mL 튜브에 대뇌 피 질의 조직의 모든 조각을 수집 합니다.
3. 조직 소화 및 분리
- 모든 조직 조각 수집 되 면 튜브의 하단에 정착 하도록 기다리는 다음 가능한 많은 매체를 발음.
- 0.05% 트립 신-EDTA 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 2-3 mL를 추가 하 고 20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 튜브를 품 어.
참고: 조직 조각을 혼합 하 고 다시 정착 수 있도록 신속 하 게 피 펫에서 모든 트립 신-EDTA를 해제 합니다. - 조심 스럽게 발음 트립 신-EDTA, 가능한 튜브의 하단에 작은 액체도에서 조직 조각을 떠나.
- 나머지 트립 신-EDTA 씻어 미리 냉각된 해 부 중간의 5 mL를 추가 합니다. 조직 조각의 혼합 달성 하기 위해 튜브의 상부 쪽으로 플라스틱.
- 해 부 중간 발음 하 고 가능한 작은 액체로 조직 조각에 둡니다. 두 번 더 미리 냉각된 해 부 매체와이 세척 단계를 반복 합니다.
- 마지막 세척 단계 후 DMEM + (실내 온도를 따뜻하게) 사용 하 여 1000 µ L 피 펫 팁, 및 triturate pipetting으로 조직 고 거품 소개 없이 아래쪽의 1 mL를 추가 합니다.
참고: 그것은 중요 하다을 생산 하는 거품을 피하기 위해이 솔루션을 이다 아주 민감한 하의 pH를 변경 될 수 있습니다. - 50 mL 튜브의 개통에서 100 µ m 셀 스 트레이너를 놓고 미리 미리 냉각 DMEM + 4.5 mL와 함께 필터를 젖은.
- 셀 스 트레이너에 천연된 직물 서 스 펜 션의 1 mL를 플라스틱 및 다른 4.5 mL을 추가 사전 냉각 DMEM + 셀 스 트레이너를 통해 세포를 씻어.
4. 셀 도금 뿌리고 여 사이토 농축에 대 한
- 10 µ L 10 µ L trypan 블루와 세포 현 탁 액의 희석 한 hemocytometer에 믹스를 pipetting을 예를 들어, 셀을 계산.
- 10 cm 접시 당 12 ml DMEM + 500000 셀 플레이트.
주: DMEM +는 astrocytic 성장을 위한 도움이 그래서 신경 또는 microglia 보다 더. 떨고, 하는 동안 유리 coverslips 우물 내에 물리적 힘 (coverslips) 없이 10 cm 요리에 그 보다 훨씬 강해 있습니다. 만약 셀 24-잘 접시에 동요는, 그들은 건강에 해로운 될 또는 죽어. 만 떨고 후 24-잘 접시에 이다 격판덮개. - 7 일 동안 37 ° C, 5% CO2 인큐베이터에서 셀 문화 유지.
- 6 일에 동요 하 고 셀을 뿌리고 전날 페이 코팅 배양 배지 단계 5에서에서 설명한 대로 준비 합니다.
5. 뿌리고 셀
-
뿌리고, 전날 코트 0.04% 페이와 세포 배양 배지.
- Immunocytochemistry, 바이러스 성 변환, 또는 플라스 미드 transfection, 24-잘 또는 6 잘 플레이트 (각 포함 하는 멸 균된 12 m m 또는 25 m m 유리 coverslip, 각각)를 사용 합니다.
- 적어도 1 시간에 70% 에탄올에 외피에 의해 유리 coverslips 소독 다음 우물에 있는 coverslips를 배치 하기 전에 세 번 이온 증류수에 세척.
- 적어도 70 µ L 24-잘 접시에 12 m m coverslip 당 0.04% 페이 6 잘 플레이트에 25mm coverslip 당 600 µ L 0.04% 페이 추가 합니다.
- 서쪽 오 점 또는 RNA-Seq 분석, 10 cm 요리 이미 해 부 후 셀을 포함 하는 사용할 수 계속할 수 있습니다. 요리만 흔들릴 수 필요가 다음 셀 1 x PBS로 세척 및 NB + H로 치료 (새로운 요리를 전송 하지 않습니다).
- 하루에 생체 외에서 (DIV) 7 해 부 후에 셀 10 cm 요리 DMEM + 인큐베이터에서 실험실 셰이 커에 놓고 흔들어 6 h 110 rpm에서 요리 합니다.
- 이온, 증 류 물으로 코팅된 coverslips에서 페이 두 번 씻어. 번호판 (잘 24-잘 접시와 6 잘 플레이트 잘 당 2 mL 당 500 µ L) NB + H 매체를 추가 합니다. 전 37 ° C, 5% CO2 10 cm 요리 떨고 있다, 동안에 또는 적어도 30 분 동안 인큐베이터에 접시 equilibrate.
- 6 h 떨고의 끝 전에 20-30 분 전 1 x PBS, DMEM +, NB + H, 및 0.25 %trypsin-EDTA 물 목욕에서 37 ° C에 따뜻한.
- 떨고, 6 h 문화 요리 흔드는 고 즉시 10 mL (흥분 상태에서 뉴런, oligodendrocytes, 및 microglia를 포함) 하는 매체 대체 후 미리 접시 당 1 x PBS를 따뜻하게 합니다.
참고: 그것은 즉시 다시 연결 비 astrocytic 셀을 피하기 위해 분리 된 셀을 포함 오래 된 매체를 발음 하는 것이 중요입니다. - PBS를 제거 하 고 접시 당 3 mL 미리 따뜻하게 트립 신-EDTA를 추가. 37 ° C, 5% CO2배양 기에서 4 분에 대 한 각 접시를 품 어.
참고: 서쪽 오 점 또는 RNA-Seq에 대 한 샘플을 준비 하는 경우에 트립 신-EDTA 추가 하지 마십시오. 대신, 12 mL PBS 바꿀 미리 NB + H, 이후 문화 인큐베이터에 다시 배치할 수 따뜻하게 합니다. - 미리 따뜻하게 DMEM + 각 3 mL 트립 신-EDTA를 접시, 플라스틱 접시 5 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여에서 셀 고 수집 50 mL 튜브에 세포 현 탁 액 5 mL를 추가 합니다.
참고: 피 펫-접시의 아래쪽에서 직접 접시의 바닥 해야 될 셀 분리로 명확 하 게. (대신 DMEM +), 매체를 포함 하는 혈 청 혈 청은 트립 신으로 사용 합니다. - 4 분 동안 20 ° C에서 3,220 x g에 세포 현 탁 액 원심
- 상쾌한을 제거 하 고 resuspend 셀 펠 릿 1 mL에는 NB + H에 미리 예 열.
6. 셀 도금 최종 사이토 문화에 대 한
- 셀을 계산 합니다.
- (잘 당 2 mL NB + H 매체)에 6-잘 접시에 잘 당 20000 셀 이나 잘 (잘 당 500 µ L NB + H 매체)에 24-잘 접시 당 5000 셀 접시.
- 추가 처리 또는 분석까지 37 ° C, 5% CO2 인큐베이터에서 셀 문화 유지.
- 일주일에 한 번 반 매체를 교환 합니다.
참고: 낮은 영양소 환경에서 이다 확산 중지 하지만 (비록 우리의 경험에 아무 microglia AWESAM 문화에 나타난) 모든 나머지 microglia 확산 것입니다. 일단 주 어떤 잠재적으로 나머지 microglia8의 농축을 방지 하 고는 monocultures 적어도 3 주 동안 건강 유지 절반 매체를 교환.
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Representative Results
신경을 가진 공동 경작 하 고 NB + 매체에 성장 이다 문화 (그림 2)의 2 주 후 방사상 나타납니다. NB + 매체, 이외에 공동 경작된 이다 또한 아마 그들의 생존 및 형태학에 기여 하는 알 수 없는 신경 파생 된 요소에 노출 됩니다. 반면, 메릴랜드 이다 (후에 통과 하기 전에 다른 세포 유형 푸는) monocultures로 DMEM + 성장 다각형 2 주 후에 나타납니다. NB + H에서 떨고, 후 성장 하는 AWESAM 이다 문화의 2 주 후 많은 정밀한 프로세스와 방사상 나타납니다.
우리는 이전 AWESAM 이다 RNA 식 프로 파일은 이다에서 vivo에서 MD와 immunopanned 이다4에 비해의 가까이 보였다. 사이토 특정 단백질 표정에서 대뇌 피 질의 이다 ALDH1L1의 높은 수준과 GFAP vivo에서12의 저급 표현 한다. 이것 또한 AWESAM 이다에 적용 하 고 세포질 효소로 ALDH1L1의 immunostaining cytoskeletal 단백질 GFAP (그림 2B) 보다 더 정밀한 세부 사항 밝혀.
RNA와 단백질 표정 이외 이다에서 vivo에서 보여 자연 스러운 캘리포니아2 + (즉, 외부 자극 없이) 신호, 하지만 다각형 MD 이다에서 생체 외에서 자극 유도 캘리포니아2 + 을 요구합니다 신호, 예를 들면, ATP 또는 조미료를 추가 하 여. AWESAM 이다 자발적인 캘리포니아2 + vivo에서, 셀 시체에 virally는 막 대상 Lck-GCaMP3 (그림 3)와 세포를 시험 하 여 구상 될 수 있다 정밀한 프로세스 신호 전시. 캘리포니아2 + 인접 이다 전역의 자연 파도 (그림 3A) 발생합니다. Astrocytic Ca2 + 좋은 프로세스와 microdomains (그림 3B) 신호 수 분석 이다13관련 프리웨어를 사용 하 여.
그림 1 : 프로토콜 일정. DIV0에 이러한 단계를 수행 하는 데 걸리는 시간을 포함 하 여 AWESAM 프로토콜의 주요 단계를 보여주는 타임 라인 (해 부의 일), DIV7 (통행의 일), 그리고 나중 시간 포인트에서 기대 해야할지. 녹색 상자 보여줍니다 어디 대 라이터 방사상 이다로 셀을 수확 수 있습니다 때 어두운 그늘 더 복잡 한 방사상 형태학과 성숙, 대 적은 각각 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 중간 형태를 결정 합니다. (A) 회로도 사이토 형태 때 변경 하는 방법을 보여주는 monocultures로 그리고 매체에 따라 대 (앞에서 설명한4)으로 신경 세포와 공동 경작. 사이토 특정 GFAP 윤곽선으로 얼룩에 방사상 형태로 공동 경작 AWESAM 이다, 그리고 메릴랜드 이다에서 다각형 형태. (B) GFAP 레이블 MD 이다 ALDH1L1, 그리고 ALDH1L1 (하지만 하지 GFAP) 보다는 더 강하게 AWESAM 이다의 정밀한 프로세스를 설명 합니다. 어느 사이토 monoculture 신경 마커 MAP2 전시 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 자발적인 캘리포니아2 + 신호 이다에서. (A) AWESAM GCaMP 불리고 이다 전시 자발적인 캘리포니아2 + (화살촉) 얇은 과정에 포함 하는 사이토 네트워크에 걸쳐 이벤트. 캘리포니아2 + 웨이브 오른쪽 왼쪽에서 여러 이다 통해 여행 개별 시간 포인트, 어디 밝은 색상 높은 캘리포니아2 + 농도의 영역을 묘사 하 고 검정 영역 대표 extracellular 영역에서에서 이미지에서. 이미지 라이브 셀 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 인수 했다. (B) 캘리포니아2 + 농도 (A)에서 색으로 구분 된 영역에서 시간이 지남에 변경, 어떻게 Ca2 + 웨이브 신호를 퍼 뜨린 여러 이다 설명 하는 GCaMP 형광 강도 추적으로 표시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
프로토콜 내에서 4 단계는 중요: 1)를 준비 하 고 정확 하 게 5 ng/ml, HBEGF 농도 때문에 농도 있는 작은 증가 미 숙 문화, 예를 들어, 발생할 수 있습니다 10 ng/mL HBEGF 드 차별화 이다4; 조직 또는 pH를 변경 하 고 사이토 건강;을 방해 수 있는 셀을 포함 하는 솔루션 2) 피 거품 3) 전 평형 미디어 최적 pH 및 온도 성장 하는 건강 한 이다; (비록 아무 microglia AWESAM 문화에서 지금까지 발견 된) 4) 교환만 절반 매체 일주일에 한 번 모든 나머지 microglia 충분 한 양분이 존재 하 고 매체에 가능성이 있기 때문에8 정기적으로 교환. 이 마지막 포인트, astrocytic, 차별화, 생존과 확산을 지원할 수 있습니다 그들은 그 문화 내에서 사이토 파생 요소 하지 완전히 제거 해야 참고 중요 하다.
성숙한 사이토 소스로 DIV14 또는 오래 된 문화를 사용 하는 것이 중요 하다 (하지만 변환 또는 transfection 단계 이전 문화를 사용할 수 있습니다) 때문에 이다 DIV14 보다 여전히 신경 줄기 세포의 잠재적인9. 바이러스 성 변환에 대 한 뉴런의 이다 DIV7에 불리고 문화 혼합 GFP10불리고 (사용 adeno 관련 바이러스) 효율적으로 익스프레스 virally. 플라스 미드 transfection, DIV10-DIV24 이다는 사용 되 고 fluorophore 태그 단백질 몇 군데 2-5 일 후11. 우리의 경험에서는, 바이러스 성 변환 및 플라스 미드 transfection 만약 최고의 작품 이다 DIV9와 DIV14 사이 불리고 있다. Transfection 및 변환 효율 구성 및 방법에 따라 달라 집니다 하지만 우리가 찾을 transfection 효율 사이토 monocultures lipofectamine transfection를 사용 하 여에서 ~ 20% 이며 adeno 관련 바이러스 (AAV) 변환 효율은 ~ 90% ( 자세한 내용은, 예를 들어, 구문 사용에 대 한 우리의 이전 작업4 참조). AAV 입자와 lipofectamine에 의해 transfecting 이다 시험, 우리 허용 적어도 5이 고 2 일 각각, 생성의 표현에 대 한. 변환 또는 transfection, 전에 이다 또한 뿌리고 후 적어도 하루에 대 한 복구를 허용 한다.
또한, 문화를 준비 하 고 다른 시간에 RNA/단백질 발현을 비교 하기 위한 점, 문화 자료, 예를 들어, DIV7에서 수확을 사이토 monocultures의 비슷한 금액을 달성 하기 위해 서로 다른 밀도에서 도금 될 수 있다와 때 DIV21 있을 수합니다 있습니다. 각각 1 x 106 및 10 cm 접시 당 500000 셀의 밀도에서 도금. 예를 들어 전체 단백질 lysate 수익률 0.5 mg/mL DIV14 처음 10 cm 접시에 500000 AWESAM 이다 도금 후 수확 할 때에 주위에 있을 것입니다.
AWESAM 프로토콜은 빠르고, 간단 하 고 저렴 한 방법을 나타냅니다 문화 이다 격리에서 하 뉴런에서 하지만 vivo에서-처럼 RNA와 단백질 표정, 형태학, 및 캘리포니아2 + 4, 신호 특성을 지금까지 다른 프로토콜에 의해 제공 됩니다. AWESAM 이다 immunocytochemistry, immunoblotting, RNA 식 분석, TIRF 현미경 검사 법, 그리고 캘리포니아2 + 이미징4셀 문화 연구에 대 한 일반적인 분석에 사용할 수 있습니다. 특히, 유전으로 인코딩된 캘리포니아2 + 지표의 최근 발전 클래식 캘리포니아2 + 염료14보다 더 자세히 잘 astrocytic 프로세스를 시각화 수 있습니다. 캘리포니아2 + 신호, 기공을 이해 및 exocytosis 두껍고 얇은 astrocytic 프로세스에는 순수 관련으로 이러한 프로세스 영양 지원, 혈액 흐름, 시 냅 스 신호 및 소성, 뇌 기능에 영향을 미칠 수 및 세포 커뮤니케이션입니다. AWESAM 프로토콜 수 벌금 astrocytic 프로세스의 연구에 대 한 뇌 생리학15 및 질병16,17, 신경 방해 없이 그리고 훌륭한 접근성 관련 그 체 외 문화 용품입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 유럽 연구 위원회 (FP7/260916), 알렉산더 폰 훔볼트-재단 (Sofja Kovalevskaja), 그리고 도이치 가운데 (DE1951 및 SFB889)에서 자금을 인정 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | warm in 37 ºC waterbath before use |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | warm in 37 ºC waterbath before use |
| B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | 50X stock |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 100X stock |
| Penicillin / streptomycin | Gibco | 15070-063 | 50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 µg/ml |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | without L-glutamine |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| HBEGF | Sigma | 4643 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HBSS | Gibco | 14170112 | |
| FCS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | 1X |
| 100 μm nylon cell strainer | BD | 352360 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Hera Cell 240i cell culture incubator | |
| Laboratory shaker | Heidolph | Rotamax 120 | use inside cell culture incubator |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R |
References
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