Summary
Ce protocole décrit l’isolement, la culture et la calcification des cellules interstitielles vanne dérivé de rat, un modèle hautement physiologique in vitro d’une valvulopathie aortique calcifiée (CAVD). L’exploitation de ce modèle de rat facilite la recherche CAVD dans l’exploration de la cellule et les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ce complex processus pathologique.
Abstract
Valvulopathie aortique calcifiée (CAVD) est caractérisée par l’épaississement progressif des feuillets valvulaire aortique. C’est une affection fréquente chez les patients de l’insuffisance rénale (terminale IRT) personnes âgées et de terminale, qui souffrent souvent d’hyperphosphatémie et une hypercalcémie. À l’heure actuelle, il n’y a aucune thérapie de médicament qui peut arrêter sa progression. Les mécanismes qui sous-tendent ce processus pathologique restent floues. Le dépliant de la valve aortique est composé d’une fine couche de cellules endothéliales vanne (CEV) sur la surface extérieure des points de rebroussement aortique, avec cellules interstitielles vanne (VICs) pris en sandwich entre les CVÉ. L’utilisation d’un modèle de rat permet l’étude in vitro des calcifications ectopiques basée sur le in vivo physiopathologiques concentrations sériques de phosphate (Pi) et le taux de calcium (Ca) des patients qui souffrent d’hyperphosphatémie et de l’hypercalcémie. Le protocole décrit en détail l’isolement d’un rat pur population VIC comme indiqué par l’expression des marqueurs de VIC : muscle lisse alpha actine (α-SMA) vimentine et tissus facteur de croissance bêta (TGFβ) 1 et 2 et l’absence de cluster de différenciation (CD) 31, une CVÉ marqueur. En développant ces VICs, études biochimiques, génétiques et d’imagerie peuvent être effectuées afin d’étudier et de démêler les médiateurs clés qui sous-tendent la CAVD.
Introduction
La valve aortique en bonne santé est composée de trois folioles, à laquelle la distribution des contraintes mécaniques pendant l’ouverture et la fermeture de la vanne est également répartie. Le dépliant de la vanne a une structure définie de trois couches distinctes : la fibrosa, spongiosa et ventricularis, abritant des soupapes des cellules interstitielles (VICs) comme le type cellulaire prédominant. Ces trois couches sont pris en sandwich entre deux lits de valve des cellules endothéliales (CEV)1.
VICs jouent un rôle crucial dans la progression de calcifiée aortique Valve Calcification (CAVD), la valvulopathie plus courante dans le monde occidental. CAVD est décrite comme une affection progressive qui est activement régulée par le tissu valvulaire et son microenvironnement environnant. Changements cellulaires initialement provoquent épaississement fibreux et finalement une vaste calcification des valve aortique folioles. Cela conduit alors à une sténose valvulaire aortique significative et laissé en bout de ligne, sortie ventriculaire obstruction2, laissant un remplacement valvulaire chirurgical comme la seule solution viable traitement.
La physiopathologie de la CAVD est complexe, mais partage des mécanismes semblables à de la minéralisation osseuse physiologique3. Alors qu’un certain nombre d’études ont démontré l’aptitude des Cie trans-différenciation ostéogénique et calcification4,5, les mécanismes qui sous-tendent ce processus n’ont pas encore complètement élucidée, mettant en évidence la condition essentielle pour un modèle réalisable et pertinente le in vitro de CAVD.
Les travaux antérieurs de plusieurs laboratoires a avec succès isolé VICs de modèles porcins et bovins et mis en culture ces cellules sous conditions6,7,8de calcification. En raison de la grande taille de la valve aortique dans ces modèles, isolement des cellules par digestion enzymatique a été très efficace pour générer des populations pures de cellules. Cependant, ces modèles peuvent être restrictives en raison de la rareté des outils moléculaires pour les grandes espèces animales. En revanche, les modèles de rongeurs restent avantageux en raison des coûts relativement bas, le potentiel pour les manipulations génétiques et la vaste gamme d’outils moléculaires qui sont déjà disponibles. Toutefois, l’isolement de la Cie des petits modèles animaux n’est pas largement employée, qui est une conséquence probable des difficultés rencontrées lorsque vous travaillez avec des échantillons de tissus petit.
Ce protocole détaillé indique une méthode complète pour l’isolement direct du rat VICs. Par une dissection minutieuse de la vanne, suivie d’une série de digestions enzymatiques, VICs peuvent être isolées et employés dans une grande variété de techniques expérimentales, notamment cell culture, calcification et l’expression génique. Ce modèle hautement pertinents dans vitro de CAVD fera sans aucun doute une contribution essentielle à l’accroissement de notre connaissance de ce processus pathologique.
Protocol
Toutes les expériences animales ont été approuvées par le Comité des usagers de l’Institut Roslin de l’Animal, et les animaux ont été maintenues conformément aux directives du ministère de l’intérieur (Royaume-Uni) pour le soin et l’utilisation des animaux. Pour le protocole décrit ci-dessous, 5 - semaine vieux, hommes rats Sprague Dawley ont été utilisés.
1. recettes de réactif
- Préparer le milieu de culture à l’aide de Dulbecco Eagle modifié (DMEM) et mélange nutritif F-12 (DMEM/F12). Ajouter 10 % stérilisés inactivés par la chaleur foetale de sérum bovin (FBS) et 1 % de gentamicine.
- Préparer le milieu de la calcification à l’aide de milieu de culture et 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi.
- Préparer le chlorure de calcium 1 M (CaCl2) pesant sur 555 mg de CaCl2 et en dissolvant dans 5 mL d’eau distillée pour faire 5 mL 1 M CaCl2. Filtrer la solution avec une seringue-filtre de 0,22 µm pour stériliser la solution.
- Préparer le phosphate de sodium 1 M par pesage 710 mg phosphate de sodium dibasique anhydre (Na2HPO4) et 600 mg de phosphate de sodium monobasique anhydre (NaH2PO4), dissoudre chacun séparément dans 5 mL eau distillée eau. Mélanger 3 870 µL de Na2HPO4 et 1 130 µL de NaH2PO4et le filtre par un filtre de seringue 0,22 µm pour stériliser la solution.
- Préparer le tampon de lavage contenant de Hank Balanced Salt Solution (HBSS) et 1 % de gentamicine.
2. préparation de la hotte de Dissection
- Effectuer toutes les dissections sous une hotte ventilée, préalablement désinfecté à l’éthanol à 70 % pour assurer la stérilité d’échantillons et de réactifs.
- Stériliser les outils de dissection à l’autoclave que leur suivis en immergeant les pointes des outils dans un bécher contenant avant l’éthanol 70 % utilisation.
- Préparer les béchers contenant du tampon de lavage et tremper les outils de dissection dans le tampon de lavage avant d’entrer en contact avec l’animal ou les tissus. Garder le tampon de lavage sur la glace à tout moment.
3. extraction de primaires de Rat VICs
Remarque : Le protocole décrit ci-dessous, 5 - semaine vieux, hommes rats Sprague Dawley ont été utilisés.
- Abattre les rats (~ 100 g) par dislocation cervicale conformément aux lignes directrices UK Home Office.
- Pour disséquer le cœur de chaque rat, placez l’animal en position couchée sur une planche de dissection de verre et désinfecter la peau en pulvérisant avec l’éthanol à 70 %.
- Faire une incision de 4 cm dans la ligne médiane du rat à l’aide de ciseaux de dissection, pour exposer la cavité abdominale et retirez soigneusement la cage thoracique et les poumons, pour exposer le cœur.
- Enlever le coeur avec une paire de sharp, ciseaux courbes de printemps et stocker le cœur disséqué dans le tampon de lavage à froid de glace jusqu'à ce que toutes les dissections brutes des rats sont terminées.
- Pour micro-disséquer chaque cœur, transférer ces dernier dans une boîte de Pétri couverts dans le tampon de lavage. Coupez le muscle cardiaque avec une paire de ciseaux droites de printemps (lame de 6 mm) pour se retrouver avec une petite zone autour de l’aorte ascendante et la racine aortique.
- En utilisant le même printemps ciseaux droite (lame de 6 mm), soigneusement découpé l’aorte vers le ventricule gauche et exposer les feuillets de la valve aortique.
- Transférer l’aorte ouverte dans une boite de Petri fraîches, stérile, rempli de HBSS. Disséquer les tracts de valve aortique, marqués par leur unique forme de « U » à la base de l’aorte, avec une paire de Vannas-type capsulotomie micro-ciseaux (lame de 3 mm).
- Rangez tous les dépliants dans 1 mL de tampon de lavage froid de glace, dans un tube de microtubes de 1,5 mL jusqu'à ce que toutes les dissections sont terminées.
- Une fois que tous les dépliants ont été récoltés, les centrifuger à 100 x g pendant 1 min à 4 ° C à retirer le tampon de lavage.
- Effectuez les étapes suivantes dans une hotte de culture cellulaire afin d’assurer la stérilisation. Pour supprimer les CVÉ, digérer les folioles dans 100 collagénase de U/mL 425 II µL pendant 5 min à 37 ° C. Perturber la digestion en pipettant également doucement et descendre à l’aide d’une pointe de pipette de 200 µL.
- Centrifuger à 100 x g pendant 30 s à folioles de granule et éliminer le liquide surnageant avec soin. Laver deux fois avec 500 µL de tampon de lavage et re-pellet les cellules par centrifugation à 100 x g pendant 30 s.
- Pour récolter les VICs de folioles, digérer avec 100 µL de 425 collagénase de U/mL II pendant 2 h et puis relâchez les VICs de pipetage doucement et descendre à l’aide d’une pointe de pipette de 200 µL.
- Diluer la collagénase II dans 19 mL de milieu de culture et centrifuger à 670 x g pendant 5 min granuler la CIV et les débris restants de leaflet vanne. Jeter le surnageant et transférer des folioles et Cie à plaques/flacons de culture en conséquence (tableau 1).
- Culture les VICs pendant 5 à 7 jours dans le milieu de culture, jusqu'à confluence à 37 ° C, en présence de 5 % (dioxyde de carbone) CO2, changer le support après 72 h. Pour une utilisation ultérieure dans des expériences in vitro , passage jusqu'à 5 fois une fois confluency atteint 100 %.
4. induction d’une Calcification du Rat VICs
Remarque : Pour toutes les expériences, compter les cellules avec un hémocytomètre.
- Effectuer toutes les cellules primaires l’amorçage et le passage dans des hottes stérilisés pour éviter la contamination. Pour préparer VICs primaires de rat in vitro les expériences de la calcification, les semences des cellules à une densité de 150 000 cellules/puits dans les plaques 6 puits. Maintenir dans un milieu de culture jusqu'à la confluence ≥ 90 % (généralement de 72 h).
- Traiter la CIV avec calcification versus milieu témoin et incuber à 37 ° C, en présence de 5 % CO2, pendant 72 h supplémentaires.
- Pour étudier le rat primaire calcifié VICs pour les analyses suivantes en aval, enlever le fluide/calcification et laver les monocouches avec tampon de lavage pour enlever les ions Ca et Pi non liées.
5. rat VIC caractérisation
- Pour immunostaining à surveiller pour les marqueurs phénotypiques, comme par exemple la vimentine et α-SMA, le rat VICs à une densité de 150 000 cellules/puits dans 6-plats de graines contenant des lamelles (cellules seront développe sur la surface des feuillets de la couverture) et laisser grandir jusqu'à la confluence de 50 %.
- Aspirer le milieu de culture et fixer les monocouches de cellules avec 4 % de paraformaldéhyde (PFA) pendant 10 min avant de les laver 3 fois avec du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS), pendant 5 minutes chaque fois.
ATTENTION : PFA est toxique et doit être manipulé avec soin. - Incuber la monocouche de cellules avec un tampon bloquant et perméabilisation (PBS de 1 x, 5 % de sérum normal de la même espèce que l’anticorps secondaire, 0,3 % Triton X-100) pendant 1 h à température ambiante.
- Incuber les monocouches de cellules avec les anticorps d’anti-α-SMA anti-vimentine et lapin de souris dilués dans du tampon de dilution des anticorps (albumine de sérum 1 % + 0,3 % Triton X-100 dans du PBS) durant la nuit à 4 ° C, secouant doucement sur une bascule.
NOTE : Contrôles négatifs se comprenaient de souris non Conjugué IgG et lapin IgG, en utilisant les mêmes dilutions que les échantillons de test. - Le lendemain, laver les anticorps primaires 3 fois avec du PBS, pendant 5 minutes chaque fois.
- Incuber les monocouches de cellules avec des anticorps secondaires conjugué à un fluorophore pendant 1 h à température ambiante en agitant doucement sur une bascule.
- Laver 3 fois avec du PBS et tweeze doucement sur les lamelles couvre-objet (qui contiennent rat VICs) avec une paire de pinces et déposer sur un lamelle couvre-objet contenant 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Laissez les diapositives pour soigner pendant au moins 24 h à 4 ° C avant de visualiser avec un microscope à fluorescence.
- Pour l’analyse par Western blot, amorcer le rat VICs à une densité de 150 000 cellules/puitsent dans 6-plaques à puits et laissent à grandir dans un milieu de culture jusqu'à 100 % confluentes.
- 8 µg de protéines permet d’exécuter un Western blot permettant de mesurer l’expression de CD31 et exclure toute contamination de VEC.
Remarque : Un protocole standard de Western blot a été suivi comme décrit plus haut9. - Pour les études de génétique, extraire l’acide ribonucléique (ARN) à l’aide d’une trousse commerciale suivant les directives du fabricant.
- Obtenir le cDNA utilisant transcriptase inverse pour mesurer l’expression des gènes cibles en utilisant la réaction en chaîne par polymérase (PCR) et la PCR en temps réel (RT-PCR ; également connu sous le nom qPCR) avec détection de fluorophore vert, à l’aide de Gapdh comme le gène de référence, comme précédemment décrit les10.
- Utiliser le programme suivant pour analyse PCR : 1 cycle de 94 ° C pendant 3 min, 30 cycles de 94 ° C pendant 30 s, 63 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 35 s et enfin 1 cycle de 72 ° C pendant 5 min.
- Utiliser le programme suivant pour l’analyse de qPCR : 1 cycle de 95 ° C pendant 10 min, 40 cycles de 95 ° C pendant 15 s, 60 ° C pendant 1 min et d’un cycle supplémentaire de 95 ° C pendant 1 min, 55 ° C pour 30 s et 95 ° C pendant 30 s.
- Exécutez une électrophorèse pour analyser les produits PCR à l’aide d’un gel d’agarose de 2 % dans un tampon Tris/Borate/EDTA (TBE).
6. rat VIC Calcification études
- Rouge d’alizarine S et études biochimiques de la calcification, veuillez suivre l’ensemencement et la calcification des directives visées à l’article 4.
- Tacher les monocouches de cellules avec une solution de 5 % solution d’alizarine S, poussant doucement sur un agitateur, pendant 20 min. Par la suite laver 3 fois avec de l’eau distillée, pendant 5 minutes chaque fois. Acquisition d’images de chaque puits.
- Afin de quantifier les dépôts de Ca, utiliser un kit de dosage biochimique Ca. Leach ions Ca2 + à l’aide de 0,6 M d’acide chlorhydrique (HCl) pendant 24 h à 4 ° C, avec agitation douce.
- Récolter le surnageant et mesure la concentration de Ca à un dosage de Ca kit (voir Table des matières) suivant les directives du fabricant.
- Calculer la concentration de calcium sous forme de fraction du total des protéines cellulaires. Dénaturer les protéines cellulaires des monocouches de cellules avec 0,1 M d’hydroxyde de sodium (NaOH) + 0,1 % dodécylsulfate de sodium (SDS). Déterminer la concentration de protéine totale à un dosage protéique compatible détergent de (DC) suivant les directives du fabricant.
Representative Results
Ce protocole visait à décrire l’isolement des primaires de rat VICs et leur culture pour des expériences in vitro la calcification. En utilisant la méthode décrite ci-dessus, rat VICs peut être isolée avec succès et élargi pour l’étude des mécanismes responsables de la CAVD.
VICs primaires de rat localiser conjointement avec des marqueurs de VIC établis :
Le phénotype de VIC de cellules isolées a été confirmé par immunofluorescence par la détection des marqueurs VIC : vimentine et α-SMA (rouge et vert, respectivement, la Figure 1 a) et est en accord avec les précédents rapports11,12. Les témoins négatifs représentatifs à l’aide de la souris non conjuguées et lapin IgG sont indiquées dans la Figure 1 b. En outre, l’expression du régulateur de VIC-croissance TGFβ-1 et TGFβ-2 a été confirmée à l’aide d’une analyse par PCR (Figure 1). Afin de confirmer que le rat isolé VICs primaires étaient exempts de contamination endothéliale, analyse par Western blot a été effectuée pour vérifier ce rat VICs étaient négatifs pour le marqueur de cellules endothéliales, CD31, utilisant des CVÉ mitrale canin comme témoin positif ( Figure 1).
Ca et Pi induisent une Calcification de VIC de Rat :
Concentrations élevées de Ca et/ou Pi systémiques généralement le lecteur la calcification de VICs in vitro. Pour apprécier le potentiel de la calcification du rat isolé VICs, les cellules ont été exposées à des concentrations élevées de Ca et de Pi, qui simulent des conditions pathologiques d’une hypercalcémie et hyperphosphatémie en IRT. Traitement des CIV avec 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi induite par calcification, tel que déterminé par coloration au rouge d’alizarine S pour dépôt de Ca (Figure 2 a) et le dosage colorimétrique de niveaux de Ca suite HCl lessivage (81 bergerie ; p < 0,05 à l’aide de Student t-Test ; Figure 2 b).
Gene Expression changements liés à la Calcification de VIC :
La calcification des cellules vasculaires in vitro est associée à un profil moléculaire distinct. Dans la présente étude, le traitement de la CIV avec 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi induit une augmentation significative de l’expression de l’ARNm des marqueurs ostéogéniques : Msh homeobox 2, Msx2 (pli 2.04 changement ; p < 0,01 ; Figure 3 a), phosphatase alcaline, Alpl (1.49 pli changement ; p < 0,001 ; Figure 3 b) et la phosphoéthanolamine/phosphocholine phosphatase, Phospho1 (4,7 fois changement ; p < 0,01 à l’aide d’ANOVA à ; La figure 3). Toutefois, l’expression du marqueur ostéogénique, Runx2et calcification inhibiteur ectonucleotide pyrophasphatase, Enpp1, est resté inchangé (Figure 3D–E).
Figure 1. Expression des marqueurs de CIV. (A) par Immunofluorescence montrant la double coloration et co-localisation d’actine muscle lisse-alpha (α-SMA ; vert) et la vimentine dans les cellules interstitielles de vanne (VICs). (B) l’image représentative de la valeur du contrôle négatif à l’aide de la souris et le lapin IgG. Les noyaux sont colorés en bleu à l’aide de 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Echelle = 50 µm. (C) la présence de croissance facteur transformant bêta 1 (TGFβ-1) et TGFβ-2 à VICs (voies 1 - 3) Comme le montre l’analyse PCR. 4 Lane est le contrôle de l’eau. Gène de référence utilisé était Gapdh. (D) analyse par Western blot montrant l’expression abondante de CD31 dans les cellules endothéliales canine de la valve mitrale (CEV) comparativement à aucune expression en CIV. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 2. In vitro la calcification du rat CIV. Dépôt de ca dans VICs traités avec 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi tel que déterminé par : (A) photographie présentant une coloration rouge d’alizarine S de monocouches de cellules entières dans le puits et (B) détermination colorimétrique de niveaux de Ca HCl par lessivage. De Student t-test a été effectué afin d’analyser l’importance entre les groupes de données à deux. Les résultats sont présentés comme moyenne ± S.E.M. *p < 0,5 comparée aux témoins ; (n = 4).
Figure 3. Modifications de l’expression génique associées à la calcification VIC. Changer de pli dans l’expression de l’ARNm de marqueurs ostéogéniques (A) Msx2, (B) Alpl, (C) Phospho1(D) Runx2et (E) Enpp1 dans VICs traitées avec 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi pour expression de l’ARNm 48 h. apparaît comme un changement de pli par rapport au gène endogène référence Gadph. ANOVA à l’aide d’un modèle linéaire général incorporant les comparaisons par paires a été réalisée afin d’analyser l’importance entre plusieurs groupes. Les résultats sont présentés comme moyenne ± S.E.M. **p < 0,01 ; p < 0,001 par rapport au témoin ; (n = 6). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Nombre de feuillets de la valve | Plaque/flacon de culture |
| 9 à 15 | 1 bien en plaque de 12 puits |
| 15 à 30 | 1 bien en plaque 6 puits |
| 30 + | T25 |
Table 1. Directives générales pour le nombre de dépliants nécessaires à l’amorçage initial.
Discussion
Ce protocole détaillé décrit une méthode pratique pour l’acquisition de primaires de rat VICs, permettant l’isolement de ces cellules de valvules cardiaques de rat par digestion enzymatique. Notre méthode de plus prend en charge et s’étend à l’utilisation d’un rat a déjà été indiqué en vitro modèle pour l’étude de la calcification de la valve aortique13. L’isolement de la Cie de la valve aortique introduit la possibilité de contamination du CEV voisine. Cependant, nos données immunofluorescence confirment que l’étape de digestion initiale est suffisante pour enlever les CVÉ, rendant les cellules isolées négatif pour le marqueur de cellules endothéliales, CD31. Par ailleurs, α-SMA coloration confirme le phénotype activé de la CIV, qui est requis pour la calcification12.
Isolement de VIC ont été rapportées en gros animal modèles6,7,8. Cependant, ces espèces sont limitées par les outils de génétiques moléculaires et limitées disponibles pour étude en aval, ainsi que leur accessibilité restreinte dans les laboratoires du monde entier. En revanche, ces outils sont bien établis dans les rongeurs facilement disponibles et par conséquent, la capacité d’isoler permet de VICs dérivé de rat une plus grande capacité de conception expérimentale. L’utilisation de la Cie des jeunes rats signifie également que les cellules sont relativement plus proliférantes de vieux rats, nécessitant donc moins animaux pour produire plus de cellules. Bien que les souris sont facilement accessibles, mais à cause de la souris ayant notamment petits cœurs, l’isolement de souris primaire VICs serait plus longues et beaucoup plus d’animaux seraient nécessaires pour isoler le même rendement de cellules comme le modèle de rat.
Un avantage important de cette approche décrite est que VICs peuvent être isolés dans le temps du type sauvage et rats transgéniques, ainsi que modèles de rat de cardiovasculaires lésions de maladie et vanne. En utilisant le modèle de rat exigerait un plus grand nombre d’animaux pour des expériences à grande échelle, donc de réduire l’utilisation des animaux, primaires de rat VICs peuvent être transformé pour produire une lignée de cellules une fois qu’il a été bien caractérisé.
Tandis que les graves implications cliniques de CAVD sont largement reconnues, les mécanismes étiologiques sous-jacents doivent encore être déterminés. En outre, médicament efficace n’existent pas de traitements qui peuvent prévenir et guérir potentiellement la calcification de la valve aortique à présenter. La culture de VICs sous conditions de calcification fournit donc un modèle hautement pertinents dans vitro de CAVD. Nous montrent que des concentrations élevées de Ca et Pi induisent la calcification in vitro de rat isolé VICs avec une augmentation concomitante de l’expression des marqueurs de gènes ostéogénique Msx2, Alplet Phospho1. Il est largement établi que ces marqueurs sont associés au processus pathologique de la calcification vasculaire14,15,16. Par conséquent, nos résultats montrent que la culture du rat VICs au moyen de calcification est un modèle approprié permettant d’étudier de calcification de la valve aortique in vitro. En effet, des études récentes dans notre laboratoire ont utilisé ce modèle pour démontrer que Ca favorise la calcification de la valve aortique par enrichissement annexine VI de matrice dérivée de VIC vésicules17.
Malgré les avantages de l’utilisation de rat VICs et leur caractérisation efficace, certaines limitations existent toujours. Tout d’abord, la taille de population de VIC de vannes de rat est très petite, et c’est pourquoi beaucoup d’animaux est nécessaires afin de générer le nombre de cellules suffisant pour études approfondie en vitro . Toutefois, il est possible de surmonter cette limitation par la réalisation d’études préliminaires en lignées de cellules interstitielles de soupape immortalisées, comme récemment rapporté par nous18et par la suite employant des cultures primaires de vérifier et étendent ces résultats.
En résumé, la méthode décrite explique la réussite de l’isolement, la culture et la calcification des primaires de rat VICs, qui pourront être imposées par la suite en utilisant une variété d’analyses, y compris des épreuves biochimiques, mais aussi des protéines et RNA. Ce modèle offre un système fiable et pratique dans lequel mène une enquête CAVD in vitroet fournit un outil précieux pour étudier les mécanismes moléculaires responsables de cette maladie destructrice.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
CD31 anticorps utilisé était un don généreux de Dr Karen Tan, Université d’Edimbourg. Cette étude a été financée par le Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) sous la forme d’une subvention du Programme stratégique Institut (BB/J004316/1 ; BBS/E/D/20221657) (VEM et FC), un Institut carrière chemin bourse BB/F023928/1 (VEM) et le financement de bourse via un BB/K011618/1 BBSRC cas du stagiaire (LC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave before use. |
| Spring straight (8 mm blade) | World Precision Instruments | 15905 | Autoclave before use. |
| SuperFine Vannas scissors (5 mm blade, 8 cm) | World Precision Instruments | 14003 | Autoclave before use. |
| Dumont #5 tweezers (11 cm) | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave before use. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
| Foetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Filter before adding to culture medium. |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710049 | |
| Absolute ethanol | Thermo Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in distilled water. |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher Scientific | H1150PB17 | Dilute to 0.6M with distilled water. |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | UN1823 | Dilute to 0.1M with distilled water. |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | 1/250 dilution in antibody dilution buffer. |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | 1/250 dilution in antibody dilution buffer. |
| Superscript II kit | Thermo Fisher Scientific | 18064014 | |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | 18427013 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | P/N58875 | |
| Taq Polymerase kit | Thermo Fisher Scientific | 18038026 | |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) | Thermo Fisher Scientific | AM9863 | Dilute to 1x with distlled water, before use. |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500 | 2% in 1x Tris/Borate/EDTA(TBE). |
| Lysis buffer (RIPA) | Thermo Fisher Scientific | 89900 | |
| T75 flask | Thermo Fisher Scientific | 156472 | |
| T175 flask | Thermo Fisher Scientific | 159920 | |
| qPCR plates | Thermo Fisher Scientific | AB0990 | |
| Rat Msx2 primer | Qiagen | QT01084090 | |
| Rat Alpl primer | Qiagen | QT00190680 | |
| Rat Enpp1 primer | Qiagen | QT00181426 | |
| RNeasy minikit | Qiagen | 74104 | |
| 6-well plates | Sigma | CLS3516 | |
| T25 flask | Sigma | CLS430639 | |
| Monobasic phosphate | Sigma | S5011 | |
| Dibasic phosphate | Sigma | S5136 | |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma | 5030 | Dilute to 0.1% with 0.1M NaOH. |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS. |
| Triton X100 | Sigma | X100 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3059 | |
| Alizarin red S | Sigma | A5533 | Make up to 2% with distilled water, and adjust to pH 4.2. |
| TGFβ-1 primer pair: f: GCTACCATGCCAACTTCTGT r: TGTGTTGGTTGTAGAGGGCA | Sigma | Concentration used: 10 μM | |
| TGFβ-2 primer pair: f: GAAGGCAGAGTTCAGGGTCT r: CGCTGGGTTGGAGATGTTAG | Sigma | Concentration used: 10 μM | |
| Monoclonal Anti-β-Actin−Peroxidase antibody produced in mouse | Sigma | A3854 | 1/50000 dilution in 5% BSA in tris-buffered saline + 0.1% Tween (TBS/T). |
| Mouse anti-vimentin antibody | Sigma | v6389 | 1/900 dilution in antibody dilution buffer (1x phosphate buffered saline (PBS), 1% bovine serum albumin (BSA), 0.3% Triton X-100). |
| Mouse IgG | Sigma | I5381 | Diluted to the same stock concentration as mouse anti-vimentin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer. |
| Rabbit IgG | GeneTex | GTX35035 | Diluted to the same stock concentration as rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer. |
| Rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody | Abcam | ab5694 | 1/200 dilution in antibody dilution buffer. |
| Rabbit anti-CD31 | Abcam | ab28364 | 1/50 dilution in 5% BSA inTBS/T. |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Dako | P0448 | 1/3000 dilution in in 5% BSA in TBS/T. |
| Collagenase II | Worthington | 41512862 | Adjust to 425 U/mL with distilled water, and then filter. |
| SYBR green mastermix | Primerdesign | PrecisionPLUS-MX-SY | |
| Calcium assay kit | Randox | CA590 | |
| DC protein assay kit | Bio-Rad | 5000111 | |
| ECL reagent | GE Healthcare | RPN2109 | |
| Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906837 | |
| Nitrocellulose membrane | GE Healthcare | 10600007 | |
| PCR ladder | Bioline | BIO-33057 | |
| Loading dye for gel electrophoresis | New England Biolabs | B7025S | |
| Syringe filters (0.22 μm) | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Coverslips | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3100 | |
| Hematocytometer | Marienfeld Superior | 640030 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera set up for Alizarin red images: | |||
| Camera | Nikon D800 | ||
| Lens | Nikon AF_s Micro, Nikko 105 mm, 1:2.8 GED | ||
| Dissection forceps 10 cm, curved ends | World Precision Instruments | 15915 | Autoclave before use. |
References
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