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Developmental Biology

अलगाव और प्राथमिक चूहा वाल्व मध्यवर्ती कोशिकाओं के लक्षण वर्णन: एक नया मॉडल महाधमनी वाल्व कड़ा अध्ययन करने के लिए

Published: November 20, 2017 doi: 10.3791/56126
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1, 1
1Developmental Biology, The Roslin Institute and R(D)SVS, University of Edinburgh, 2Guangzhou Institute of Cardiovascular Disease, The Second Affiliated Hospital, School of Basic Medical Sciences, Guangzhou Medical University, 3Clinical Sciences and R(D)SVS, University of Edinburgh

Summary

इस प्रोटोकॉल अलगाव, संस्कृति का वर्णन है, और चूहे के कड़ा वाल्व मध्यवर्ती कोशिकाओं, calcific महाधमनी वाल्व रोग (CAVD) के इन विट्रो में एक उच्च शारीरिक व्युत्पंन । इस चूहे मॉडल का शोषण कोशिका और आणविक तंत्र है कि इस जटिल रोग प्रक्रिया आबाद की खोज में CAVD अनुसंधान की सुविधा ।

Abstract

Calcific महाधमनी वाल्व रोग (CAVD) महाधमनी वाल्व पत्रक के प्रगतिशील और अधिक मोटा होना की विशेषता है । यह एक शर्त अक्सर बुजुर्ग और अंत चरण गुर्दे की बीमारी (ESRD) रोगियों, जो सामांयतः hyperphosphatemia और अतिकैल्शियमरक्तता से पीड़ित में पाया जाता है । वर्तमान में, कोई दवा उपचार है कि इसकी प्रगति को रोक सकता है । तंत्र है कि इस रोग की प्रक्रिया आबाद अस्पष्ट रहते हैं । महाधमनी वाल्व पत्रक महाधमनी cusps की बाहरी सतहों पर वाल्व endothelial कोशिकाओं (VECs) की एक पतली परत से बना है, वाल्व मध्यवर्ती कोशिकाओं के साथ (VICs) VECs के बीच सैंडविच । एक चूहे के मॉडल का उपयोग vivo physiopathological सीरम फॉस्फेट (Pi) और hyperphosphatemia और अतिकैल्शियमरक्तता से पीड़ित रोगियों के कैल्शियम (सीए) के स्तर पर आधारित अस्थानिक कड़ा के इन विट्रो अध्ययन में सक्षम बनाता है । वर्णित प्रोटोकॉल के रूप में एक शुद्ध चूहा विक जनसंख्या के अलगाव के रूप में विक मार्करों की अभिव्यक्ति द्वारा दिखाए गए विवरण: अल्फा-चिकनी मांसपेशी actin (α-SMA) vimentin और ऊतक विकास कारक बीटा (TGFβ) 1 और 2, और भेदभाव के क्लस्टर के अभाव (सीडी) 31, एक VEC मार्कर. इन VICs का विस्तार करके, जैव रासायनिक, आनुवंशिक, और इमेजिंग अध्ययन के लिए अध्ययन और प्रमुख मध्यस्थों underpinning CAVD सुलझाया जा सकता है ।

Introduction

स्वस्थ महाधमनी वाल्व तीन पुस्तिकाओं, जो खोलने और वाल्व के समापन के दौरान यांत्रिक तनाव का वितरण समान रूप से बांटा गया है शामिल है । वाल्व पुस्तिका तीन अलग परतों की एक परिभाषित संरचना है: fibrosa, spongiosa, और ventricularis, प्रमुख कोशिका प्रकार के रूप में जो घर वाल्व मध्यवर्ती कोशिकाओं (VICs) । ये तीन परतें वाल्व endothelial कोशिकाओं (VECs)1के दो बिस्तरों के बीच सैंडविच हैं ।

VICs Calcific महाधमनी वाल्व कड़ा (CAVD), पश्चिमी दुनिया में सबसे आम हृदय वाल्व रोग की प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । CAVD एक प्रगतिशील शर्त है कि सक्रिय रूप से वाल्वुलर ऊतक और उसके आसपास के microenvironment द्वारा विनियमित है के रूप में वर्णित है । सेलुलर परिवर्तन शुरू में fibrotic और अधिक मोटा होना कारण, और अंततः महाधमनी वाल्व पत्रक के एक व्यापक कड़ा । यह तो महत्वपूर्ण महाधमनी वाल्व एक प्रकार का रोग और अंततः की ओर जाता है, वेंट्रिकुलर बहिर्वाह बाधा2छोड़ दिया, केवल व्यवहार्य उपचार के रूप में शल्य वाल्व प्रतिस्थापन छोड़ ।

CAVD के pathophysiology जटिल है, लेकिन शारीरिक हड्डी खनिज के समान तंत्र शेयर3। Whilst, अध्ययन के एक नंबर osteogenic ट्रांस भेदभाव और कड़ा4,5से गुजरना VICs की क्षमता का प्रदर्शन किया है, इस प्रक्रिया underpinning तंत्र अभी तक पूरी तरह से आविर्भाव हो, पर प्रकाश डाला CAVD के एक व्यवहार्य और प्रासंगिक इन विट्रो मॉडल के लिए महत्वपूर्ण आवश्यकता ।

प्रयोगशालाओं के एक नंबर से पिछले काम सफलतापूर्वक सुअर और गोजातीय मॉडल से VICs अलग है, और calcifying शर्तों के तहत इन कोशिकाओं को प्रसंस्कृत6,7,8। इन मॉडलों में महाधमनी वाल्व के बड़े आकार के कारण, एंजाइमी पाचन के माध्यम से कोशिकाओं का अलगाव अत्यधिक कोशिकाओं की शुद्ध आबादी पैदा करने में प्रभावी किया गया है । तथापि, इन मॉडलों को बड़े पशु प्रजातियों के लिए आणविक उपकरणों की सीमित उपलब्धता के कारण प्रतिबंधात्मक किया जा सकता है । इसके विपरीत, मूषक मॉडल अपेक्षाकृत कम लागत, आनुवंशिक हेरफेर के लिए संभावित, और आणविक उपकरण है कि आसानी से उपलब्ध है की व्यापक सरणी के कारण लाभप्रद रहते हैं । हालांकि, छोटे पशु मॉडलों से VICs के अलगाव व्यापक रूप से कार्यरत है, जो कठिनाइयों का सामना करना पड़ा जब छोटे ऊतक नमूनों के साथ काम करने की संभावना परिणाम है नहीं है ।

इस विस्तृत प्रोटोकॉल चूहे VICs के प्रत्यक्ष अलगाव के लिए एक व्यापक विधि की रिपोर्ट । वाल्व के सावधान विच्छेदन, द्वारा एंजाइमी डाइजेस्ट की एक श्रृंखला के बाद, VICs अलग किया जा सकता है और प्रयोगात्मक तकनीक की एक विस्तृत विविधता में कार्यरत, सेल संस्कृति, कड़ा सहित, और जीन अभिव्यक्ति । इस इन विट्रो CAVD के मॉडल निस्संदेह इस रोग की प्रक्रिया के बारे में हमारी जानकारी को बढ़ाने के लिए एक आवश्यक योगदान कर देगा ।

Protocol

सभी पशु प्रयोगों Roslin संस्थान के पशु उपयोगकर्ताओं समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, और जानवरों की देखभाल और जानवरों के उपयोग के लिए होम ऑफिस (यूके) दिशा निर्देशों के अनुसार बनाए रखा गया था । नीचे वर्णित प्रोटोकॉल के लिए, 5 सप्ताह पुराने, पुरुष Sprague Dawley चूहों का इस्तेमाल किया गया ।

1. रिएजेंट व्यंजनों

  1. Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) और पोषक तत्व मिश्रण एफ 12 (DMEM/F12) का उपयोग कर संस्कृति माध्यम तैयार करें । जोड़ें 10% निष्फल गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% gentamicin ।
  2. संस्कृति माध्यम का उपयोग कर कड़ा माध्यम तैयार करें और २.७ mm Ca/2.5 mm Pi ।
    1. 1 मीटर कैल्शियम क्लोराइड (CaCl2) को CaCl2 के ५५५ मिलीग्राम और 5 मिलीलीटर आसुत जल में भंग करके 1 मीटर CaCl2के 5 मिलीलीटर बनाने के लिए तैयार करें । समाधान को निष्फल करने के लिए ०.२२ µm सिरिंज फ़िल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर करें.
    2. ७१० मिलीग्राम निर्जल dibasic सोडियम फॉस्फेट (Na2HPO4) और ६०० मिलीग्राम के निर्जल monobasic सोडियम फॉस्फेट (2PO4), 5 मिलीलीटर आसुत में प्रत्येक अलग भंग द्वारा 1 मीटर सोडियम फॉस्फेट तैयार करें पानी. 2HPO4 और १,१३०2पीओ4, और एक ०.२२ µm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर के माध्यम से समाधान निष्फल के लिए ३,८७० µ एल का मिश्रण ।
  3. तैयार धोने बफर है हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) और 1% gentamicin युक्त ।

2. विच्छेदन डाकू की तैयारी

  1. बाहर एक हवादार डाकू में सभी विच्छेदों ले, पहले ७०% इथेनॉल से संक्रमित नमूनों और रिएजेंटों की बाँझ सुनिश्चित करने के लिए ।
  2. autoclaving द्वारा विच्छेदन उपकरण निष्फल एक चोंच में उपकरणों के सुझावों को विसर्जित द्वारा पीछा किया ७०% इथेनॉल युक्त उपयोग करने से पहले ।
  3. धोने बफर युक्त यूरिन तैयार करें, और पशु या ऊतकों के संपर्क में आने से पहले धो बफर में विच्छेदन उपकरण सोख । हर समय बर्फ पर वॉश बफर रखें ।

3. प्राथमिक चूहे VICs का निष्कर्षण

नोट: प्रोटोकॉल के लिए नीचे वर्णित, 5 सप्ताह पुराने, पुरुष Sprague Dawley चूहों का इस्तेमाल किया गया ।

  1. चुनना ब्रिटेन घर कार्यालय के दिशा निर्देशों के अनुसार गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन के द्वारा चूहों (~ १०० ग्राम) ।
  2. प्रत्येक चूहे के दिल से बाहर टुकड़े करने के लिए, एक गिलास विच्छेदन बोर्ड पर पशु लापरवाह जगह है, और ७०% इथेनॉल के साथ छिड़काव द्वारा त्वचा को संक्रमित ।
  3. विच्छेदन कैंची की सहायता से चूहे के midline में एक 4 सेमी चीरा, उदर गुहा बेनकाब करने के लिए, और ध्यान से रिब पिंजरे और फेफड़ों को हटाने के लिए, दिल का पर्दाफाश करने के लिए ।
  4. तेज, वसंत घुमावदार कैंची की एक जोड़ी के साथ दिल को हटा दें, और चूहों के सभी सकल विच्छेदन पूरा कर रहे हैं जब तक बर्फ कोल्ड वॉश बफर में विच्छेदित दिल की दुकान.
  5. सूक्ष्म टुकड़े प्रत्येक दिल के लिए, एक पेट्री धोने बफर में शामिल पकवान में उत्तरार्द्ध हस्तांतरण । आरोही महाधमनी और महाधमनी जड़ आसपास के एक छोटे से क्षेत्र के साथ छोड़ दिया जाना वसंत सीधे कैंची (6 मिमी ब्लेड) की एक जोड़ी के साथ हृदय की मांसपेशी ट्रिम कर दीजिए ।
  6. एक ही वसंत सीधे कैंची (6 मिमी ब्लेड) का उपयोग करना, ध्यान से बाईं निलय की ओर आरोही महाधमनी खुले और महाधमनी वाल्व पत्रक बेनकाब कटौती.
  7. खोला महाधमनी एक ताजा, बाँझ पेट्री HBSS से भरा पकवान में स्थानांतरण । टुकड़े बाहर महाधमनी वाल्व पत्रक, महाधमनी के आधार पर उनके अद्वितीय ' यू ' आकार द्वारा चिह्नित, Vannas प्रकार capsulotomy माइक्रो कैंची (3 मिमी ब्लेड) की एक जोड़ी के साथ ।
  8. सभी चौराहों पूरा कर रहे हैं जब तक एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में, बर्फ कोल्ड वॉश बफर के 1 मिलीलीटर में सभी पत्रक स्टोर.
  9. एक बार सभी पत्रक काटा गया है, उंहें 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए १०० x g में धोने बफर हटाने के लिए केंद्रापसारक ।
  10. नसबंदी सुनिश्चित करने के लिए सेल कल्चर हुड में क्रमिक चरण निष्पादित करें । VECs को हटाने के लिए, १०० µ एल ४२५ यू/एमएल collagenase द्वितीय में ३७ ° c पर 5 मिनट के लिए पत्रक को पचाने में । धीरे pipetting ऊपर और नीचे एक २०० µ l पिपेट टिप का उपयोग करके पाचन बाधित ।
  11. 30 एस के लिए १०० x g पर के लिए पत्रक गोली, और supernatant ध्यान से त्यागें । ५०० µ एल धोने बफर और पुनः के साथ दो बार धो-30 एस के लिए १०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं गोली ।
  12. के लिए पत्रक से VICs फसल, १०० के साथ डाइजेस्ट ४२५ U/एमएल collagenase द्वितीय के 2 घंटे के लिए µ एल, और फिर धीरे से VICs जारी pipetting ऊपर और नीचे एक २०० µ एल पिपेट टिप का उपयोग कर ।
  13. संस्कृति मध्यम के 19 मिलीलीटर में collagenase द्वितीय पतला और 5 मिनट के लिए ६७० x g पर VICs और शेष वाल्व पत्रक मलबे गोली के लिए केंद्रापसारक । supernatant त्यागें, और स्थानांतरण पुस्तिकाओं और VICs के लिए संस्कृति प्लेटों/कुप्पी तदनुसार (तालिका 1) ।
  14. संस्कृति संस्कृति माध्यम में 5-7 दिनों के लिए VICs, जब तक प्रवाह ३७ डिग्री सेल्सियस पर पहुंच गया है, 5% की उपस्थिति में (कार्बन डाइऑक्साइड) सह2, मध्यम बदलने के बाद ७२ एच । में बाद में उपयोग के लिए इन विट्रो प्रयोगों में, 5 बार अप करने के लिए पारित एक बार प्रभावित १००% तक पहुंचता है ।

4. चूहे VICs के कड़ा की प्रेरण

नोट: सभी प्रयोगों के लिए, एक hemocytometer के साथ कोशिकाओं गिनती.

  1. संदूषण को रोकने के लिए सभी प्राथमिक सेल सीडिंग और निष्फल डाकू में passaging प्रदर्शन । के लिए प्राथमिक रैट VICs तैयार करने के लिए इन विट्रो कड़ा प्रयोगों, १५०,००० कोशिकाओं के घनत्व पर बीज कोशिकाओं 6-अच्छी तरह से प्लेटों में/ संस्कृति माध्यम में बनाए रखें जब तक ≥ ९०% प्रवाह (आमतौर पर ७२ ज) ।
  2. कड़ा के साथ VICs इलाज बनाम नियंत्रण मध्यम और ३७ ° c पर मशीन, 5% सह की उपस्थिति में2, एक अतिरिक्त ७२ एच के लिए ।
  3. बाद के बहाव के विश्लेषण के लिए calcified प्राथमिक चूहा VICs का अध्ययन करने के लिए, कड़ा/नियंत्रण मध्यम निकालें और गैर-बाउंड Ca और Pi आयनों को निकालने के लिए monolayers वॉश बफ़र के साथ धो लें ।

5. चूहा विक लक्षण वर्णन

  1. vimentin और α-SMA के रूप में phenotypic मार्करों के लिए निगरानी करने के लिए immunostaining के लिए, बीज १५०,००० कोशिकाओं के घनत्व पर चूहे VICs/अच्छी तरह से 6 में कवर स्लिप युक्त प्लेटों (कोशिकाओं को कवर फिसल की सतह पर बढ़ेगा), और छोड़ने के लिए जब तक ५०% को प्रभावित ।
  2. संस्कृति माध्यम महाप्राण और 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ सेल monolayers को ठीक 10 मिनट के लिए उन्हें फॉस्फेट के साथ 3 बार धोने से पहले (पंजाब), 5 मिनट के लिए हर बार.
    चेतावनी: पीएफए विषाक्त है और ध्यान से नियंत्रित किया जाना चाहिए ।
  3. अवरुद्ध और permeabilization बफर (1x पंजाबियों, माध्यमिक एंटीबॉडी, ०.३% ट्राइटन एक्स के रूप में एक ही प्रजाति से सामांय सीरम के 5% के साथ सेल monolayer मशीन-१००) कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ।
  4. एंटीबॉडी कमजोर पड़ने बफर में पतला माउस विरोधी vimentin और खरगोश विरोधी α-SMA एंटीबॉडी के साथ सेल monolayers मशीन (1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन + ०.३% ट्राइटन X-१०० पंजाब में) रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर, धीरे से मिलाते हुए एक झूली कुरसी पर ।
    नोट: नकारात्मक नियंत्रण गैर संयुग्मित माउस आईजीजी और खरगोश आईजीजी, परीक्षण के नमूनों के रूप में एक ही कमजोर पड़ने का उपयोग शामिल है ।
  5. अगले दिन पर, पंजाबियों के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी 3 बार बंद धो, 5 मिनट हर बार के लिए ।
  6. धीरे से एक झूली कुरसी पर मिलाते हुए, कमरे के तापमान पर 1 ज के लिए fluorophore-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेल monolayers मशीन ।
  7. पंजाबियों के साथ 3 बार धो, और धीरे से बाहर tweeze coverslips (जो चूहे VICs होते हैं) संदंश और जगह की एक जोड़ी के साथ एक coverslip युक्त 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) । एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ visualizing से पहले 4 डिग्री सेल्सियस से कम 24 घंटे के लिए इलाज के लिए स्लाइड छोड़ दें ।
  8. पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए, बीज १५०,००० कोशिकाओं के घनत्व पर चूहे VICs/अच्छी तरह से 6 में प्लेटें और संस्कृति माध्यम में १००% तक विकसित करने के लिए छोड़ो धाराप्रवाह ।
  9. CD31 की अभिव्यक्ति को मापने के लिए एक पश्चिमी दाग को चलाने के लिए प्रोटीन के 8 µ g का उपयोग करें और किसी भी VEC संदूषण को बाहर सुनाएगा ।
    नोट: पहले9के रूप में वर्णित एक मानक पश्चिमी ब्लाट प्रोटोकॉल का पालन किया गया ।
  10. जीन अध्ययन के लिए, निर्माता के दिशानिर्देशों का पालन करते हुए एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करके ribonucleic एसिड (आरएनए) निकालें.
  11. पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) और वास्तविक समय पीसीआर (आरटी-पीसीआर; भी qPCR के रूप में जाना जाता है) हरे fluorophore का पता लगाने के साथ, संदर्भ जीन के रूप में Gapdh का उपयोग करके लक्ष्य जीन ' अभिव्यक्ति को मापने के लिए रिवर्स प्रतिलेखन का उपयोग कर सीडीएनए प्राप्त करें, जैसा कि पहले 10बताई ।
    1. पीसीआर विश्लेषण के लिए निम्न प्रोग्राम का उपयोग करें: 3 मिनट के लिए ९४ ° c के 1 चक्र, 30 एस के लिए ९४ डिग्री सेल्सियस के 30 s, ६३ ° c के लिए 30 s, ७२ ° c के लिए ३५ s, और अंत में 1 चक्र के लिए ७२ ° c 5 min.
    2. qPCR विश्लेषण के लिए निम्न प्रोग्राम का उपयोग करें: 10 मिनट के लिए ९५ ° c के 1 चक्र, ९५ ° c के ४० चक्र के लिए 15 s, ६० ° c 1 मिनट के लिए और 1 मिनट के लिए ९५ ° c का एक अतिरिक्त चक्र, 30 s के लिए ५५ ° c, और 30 s के लिए ९५ ° c.
  12. Tris/बोराटे/EDTA (TBE) बफर में 2% agarose जेल का उपयोग करके पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण करने के लिए जेल ट्रो चलाएं ।

6. मूषक विक कड़ा अध्ययन

  1. Alizarin रेड एस और जैव रासायनिक कड़ा अध्ययन के लिए, अनुभाग 4 में वर्णित सीडिंग और कड़ा दिशानिर्देशों का पालन करें ।
  2. 5% Alizarin लाल एस समाधान के साथ सेल monolayers दाग, धीरे से एक शेखर पर कमाल, 20 मिनट के लिए । बाद में आसुत जल के साथ 3 बार धोने, 5 मिनट के लिए हर बार । एक अच्छी तरह से की छवियों को प्राप्त ।
  3. सीए जमाव को बढ़ाता है, एक जैव रासायनिक सीए परख किट का उपयोग करें । नमकीन पानी सीए2 + आयनों कोमल आंदोलन के साथ, 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए ०.६ एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) का उपयोग कर ।
  4. supernatant फसल और सीए एकाग्रता एक सीए परख किट का उपयोग ( सामग्री की तालिकादेखें) निर्माता के दिशा निर्देशों का पालन उपाय ।
  5. कुल सेलुलर प्रोटीन के एक अंश के रूप में कैल्शियम एकाग्रता की गणना । ०.१ एम सोडियम हीड्राकसीड (NaOH) + ०.१% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) के साथ सेल monolayers से प्रकृति सेलुलर प्रोटीन । निर्धारित कुल प्रोटीन एकाग्रता का उपयोग कर एक डिटर्जेंट संगत (डीसी) प्रोटीन परख निर्माता के दिशा निर्देशों के बाद ।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य प्राथमिक चूहे VICs और संस्कृति के अलगाव के लिए उंहें इन विट्रो कड़ा प्रयोगों में वर्णन था । ऊपर वर्णित विधि को रोजगार से, चूहे VICs सफलतापूर्वक अलग किया जा सकता है और CAVD के लिए जिंमेदार तंत्र के अध्ययन के लिए विस्तारित ।

मूषक प्राथमिक VICs सह information with हुदैन विक मार्कर्स:

विक मार्करों: vimentin और α-SMA (लाल और हरे, क्रमशः, आंकड़ा 1a) के लिए जांच द्वारा इम्यूनोफ्लोरेसेंस के माध्यम से पृथक कोशिकाओं के विक phenotype की पुष्टि की गई थी, और पिछले रिपोर्टों के साथ समझौते में है11,12. गैर-संयुग्मित माउस और खरगोश आईजीजी का उपयोग करके प्रतिनिधि नकारात्मक नियंत्रण आरेख 1bमें दिखाए जाते हैं । साथ ही, विक-ग्रोथ रेगुलेटर TGFβ-1 और TGFβ-2 की अभिव्यक्ति को पीसीआर एनालिसिस (फिगर 1C) के इस्तेमाल की पुष्टि की गई । आदेश में पुष्टि करने के लिए कि अलग चूहे प्राथमिक VICs endothelial संदूषण से मुक्त थे, पश्चिमी ब्लाट विश्लेषण सत्यापित करने के लिए किया गया था कि चूहे VICs endothelial सेल मार्कर के लिए नकारात्मक थे, CD31, एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कुत्ते mitral VECs का उपयोग ( चित्र 1 d) ।

Ca और Pi प्रेरित चूहा विक कड़ा:

उन्नत प्रणालीगत Ca और/या Pi सांद्रता आमतौर पर इन विट्रो मेंVICs की कड़ा ड्राइव । अलग चूहे VICs की कड़ा क्षमता की सराहना करने के लिए, कोशिकाओं सीए और Pi, जो ESRD रोगियों में रोग अतिकैल्शियमरक्तता और hyperphosphatemia स्थितियों की नकल के स्तर को ऊंचा करने के लिए उजागर किया गया । के साथ VICs के उपचार २.७ mm ca/2.5 mm Pi प्रेरित कड़ा, के रूप में सीए जमाव के लिए Alizarin लाल एस धुंधला द्वारा निर्धारित (चित्र 2a) और वर्णमिति के निर्धारण के ca के स्तर के बाद एचसीएल नमकीन पानी (८१ गुना; विद्यार्थी के t-परीक्षण का उपयोग करके p < ०.०५; चित्र b) ।

जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन विक कड़ा के साथ जुड़े:

विट्रो में संवहनी कोशिकाओं के कड़ा एक अलग आणविक प्रोफ़ाइल के साथ जुड़ा हुआ है । वर्तमान अध्ययन में, २.७ mm Ca/2.5 mm Pi के साथ VICs के उपचार osteogenic मार्करों के mRNA अभिव्यक्ति में एक उल्लेखनीय वृद्धि प्रेरित: Msh homeobox 2, Msx2 (२.०४ गुना परिवर्तन; p < ०.०१; चित्र 3ए), क्षारीय फॉस्फेट, Alpl (१.४९ गुना बदलें; p < ०.००१; चित्र बी), और phosphoethanolamine/phosphocholine फॉस्फेट, Phospho1 (४.७ गुना परिवर्तन; एक-तरफ़ा ANOVA का उपयोग करके p < ०.०१; चित्र 3सी) । हालांकि, osteogenic मार्कर की अभिव्यक्ति, Runx2, और कड़ा अवरोध करनेवाला ectonucleotide pyrophasphatase, Enpp1, अपरिवर्तित बनी रही (चित्र 3d-ई) ।

Figure 1
चित्र 1. विक मार्कर की अभिव्यक्ति । (क) इम्यूनोफ्लोरेसेंस दिखा रहा है डबल धुंधला और अल्फा के colocalization-चिकनी मांसपेशी actin (α-SMA; हरा) और वाल्व मध्यवर्ती कोशिकाओं (vimentin) में VICs. (B) माउस और खरगोश आईजीजी का उपयोग करके नकारात्मक नियंत्रणों की प्रतिनिधि छवि । नाभिक 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) का उपयोग कर नीले रंग में दाग रहे हैं । स्केल बार = ५० µm. (C) में परिवर्तन की उपस्थिति वृद्धि कारक बीटा 1 (TGFβ-1) और TGFβ-2 में VICs (गलियाँ 1-3) के रूप में पीसीआर विश्लेषण द्वारा दर्शाए गए । 4 लेन पानी नियंत्रण है । संदर्भ जीन इस्तेमाल किया Gapdhथा । (घ) पश्चिमी दाग कुत्ते mitral वाल्व endothelial कोशिकाओं में CD31 की प्रचुर अभिव्यक्ति दिखा विश्लेषण (VECs) VICs में कोई अभिव्यक्ति की तुलना में । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. इन विट्रो कड़ा ऑफ रैट VICs. ca के साथ इलाज VICs में २.७ mm ca/2.5 mm Pi द्वारा निर्धारित के रूप में: (A) अच्छी तरह से में पूरे सेल monolayers के Alizarin लाल एस दाग दिखा तस्वीर, और (बी) वर्णमिति का निर्धारण ca के स्तर के बाद एचसीएल नमकीन पानी । दो डेटा समूहों के बीच महत्व का विश्लेषण करने के लिए छात्र का t-परीक्षण किया गया था । परिणाम नियंत्रण के साथ तुलना में अर्थ ± S.E.M. *p < ०.५ के रूप में प्रस्तुत किए गए हैं; (n = 4) ।

Figure 3
चित्र 3. जीन अभिव्यक्ति विक कड़ा के साथ जुड़े परिवर्तन । osteogenic मार्कर (A) Msx2की mRNA व्यंजक में फ़ोल्ड परिवर्तन, (B) Alpl, (C) Phospho1, (D) Runx2, और (E) Enpp1 में VICs के साथ २.७ mm Ca/2.5 mm Pi के लिए ४८ h. mRNA अभिव्यक्ति अंतर्जात संदर्भ जीन Gadph की तुलना में एक गुना परिवर्तन के रूप में दिखाया गया है । युग्म-वार तुलना को शामिल करने वाले सामान्य रेखीय मॉडल का उपयोग करके एक-तरफ़ा ANOVA कई समूहों के बीच महत्व का विश्लेषण करने के लिए किया गया था । परिणाम के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं मतलब ± S.E.M. * *p < ०.०१; नियंत्रण की तुलना में p < ०.००१; (n = 6) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

वाल्व पत्रक की संख्या कल्चरल प्लेट कुप्पी/
९ ते १५ 1 अच्छी तरह से 12 में प्लेट
15 से 30 1 अच्छी तरह से 6 में प्लेट
30 + t25

तालिका 1. प्रारंभिक सीडिंग के लिए आवश्यक पत्रक की संख्या के लिए सामान्य दिशानिर्देश.

Discussion

इस विस्तृत प्रोटोकॉल प्राथमिक चूहे VICs के अधिग्रहण के लिए एक व्यावहारिक विधि का वर्णन, एंजाइमी पाचन के माध्यम से चूहे दिल वाल्व से इन कोशिकाओं के अलगाव को सक्षम करने से । हमारी विधि आगे का समर्थन करता है और इन विट्रो मॉडल महाधमनी वाल्व13कड़ा अध्ययन करने के लिए एक पहले रिपोर्ट चूहे के उपयोग का विस्तार । महाधमनी वाल्व से VICs के अलगाव पड़ोसी VECs से संदूषण के लिए संभावित परिचय । हालांकि, हमारे इम्यूनोफ्लोरेसेंस डेटा की पुष्टि करें कि प्रारंभिक पाचन चरण VECs को निकालने के लिए पर्याप्त है, endothelial सेल मार्कर, CD31 के लिए पृथक कोशिकाओं नकारात्मक प्रतिपादन । इसके अलावा, α-SMA धुंधला VICs के सक्रिय phenotype, जो कड़ा12के लिए आवश्यक है की पुष्टि करता है ।

विक अलगाव पहले बड़े पशु मॉडल6,7,8में सूचित किया गया है । हालांकि, इन प्रजातियों के बहाव के अध्ययन के लिए उपलब्ध सीमित आनुवंशिक और आणविक उपकरणों के साथ ही दुनिया भर में प्रयोगशालाओं में उनके सीमित पहुंच से विवश हैं । इसके विपरीत, इस तरह के उपकरणों को अच्छी तरह से आसानी से उपलब्ध कुतर में स्थापित कर रहे है और इसलिए, चूहे व्युत्पंन VICs को अलग करने की क्षमता एक अधिक से अधिक प्रयोगात्मक डिजाइन क्षमता सक्षम बनाता है । युवा चूहों से VICs का उपयोग भी मतलब है कि कोशिकाओं को अपेक्षाकृत अधिक पुराने चूहों से अधिक प्रफलन हैं, इसलिए अधिक कोशिकाओं को उपज के लिए कम जानवरों की आवश्यकता होती है. हालांकि चूहे आसानी से सुलभ हैं, लेकिन चूहों के कारण विशेष रूप से छोटे दिल वाले, प्राथमिक माउस VICs के अलगाव अधिक समय लेने वाली और काफी अधिक पशुओं के लिए चूहे मॉडल के रूप में कोशिकाओं की एक ही उपज को अलग करने की आवश्यकता होगी ।

यह वर्णित दृष्टिकोण का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि VICs अस्थाई जंगली प्रकार और ट्रांसजेनिक चूहों, साथ ही हृदय रोग और वाल्व चोट के चूहे मॉडल से अलग किया जा सकता है । चूहा मॉडल का उपयोग बड़े पैमाने पर प्रयोगों के लिए पशुओं की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता होती है, इसलिए पशु उपयोग को कम करने के लिए, प्राथमिक चूहा VICs एक सेल लाइन का उत्पादन एक बार यह अच्छी तरह से किया गया है बदल सकता है ।

Whilst CAVD के गंभीर नैदानिक निहितार्थ व्यापक रूप से मांयता प्राप्त कर रहे हैं, अंतर्निहित करणीय तंत्र अभी तक निर्धारित किया जाना है । इसके अलावा, प्रभावी दवा उपचार है कि रोक सकता है और संभावित महाधमनी वाल्व कड़ा इलाज वर्तमान में उपलब्ध नहीं हैं । calcifying शर्तों के तहत VICs की संस्कृति इसलिए CAVD के इन विट्रो मॉडल में एक उच्च प्रासंगिक प्रदान करता है । हम बताते है कि ऊंचा Ca और Pi का स्तर प्रेरित osteogenic जीन मार्करों Msx2, Alpl, और Phospho1की अभिव्यक्ति में एक सहवर्ती वृद्धि के साथ अलग चूहे VICs के इन विट्रो कड़ा में । यह व्यापक रूप से स्थापित है कि इन मार्करों संवहनी कड़ा14,15,16के रोग की प्रक्रिया के साथ जुड़े रहे हैं । हमारे डेटा इसलिए पता चलता है कि calcifying माध्यम में चूहे VICs की संस्कृति एक उपयुक्त मॉडल है जिसके साथ महाधमनी वाल्व कड़ा इन विट्रो मेंअध्ययन करने के लिए है । वास्तव में, हमारी प्रयोगशाला से हाल के अध्ययनों से इस मॉडल का उपयोग किया है प्रदर्शित करने के लिए कि सीए विक के Annexin छठी संवर्धन के माध्यम से महाधमनी वाल्व कड़ा को बढ़ावा-व्युत्पंन मैट्रिक्स17।

चूहे VICs और उनके कुशल लक्षण वर्णन का उपयोग कर के लाभों के बावजूद, कुछ सीमाएं अभी भी मौजूद हैं । सबसे पहले, चूहे वाल्व के भीतर विक जनसंख्या का आकार बहुत छोटा है, और इसलिए कई जानवरों के क्रम में व्यापक के लिए पर्याप्त कोशिका संख्या उत्पंन करने के लिए आवश्यक है इन विट्रो अध्ययन । हालांकि, यह संभव है कि अमर वाल्व मध्यवर्ती कक्ष लाइनों में प्रारंभिक अध्ययन उपक्रम द्वारा इस सीमा को दूर, के रूप में हाल ही में हमारे द्वारा रिपोर्ट18, और बाद में प्राथमिक संस्कृतियों को रोजगार के लिए सत्यापित करें और इन निष्कर्षों का विस्तार ।

संक्षेप में, वर्णित विधि सफल अलगाव, संस्कृति, और प्राथमिक चूहे VICs, जो बाद में जैव रासायनिक परख सहित विश्लेषण की एक किस्म का उपयोग कर के रूप में अच्छी तरह से प्रोटीन और आरएनए विश्लेषण का मूल्यांकन किया जा सकता है की कड़ा बताते हैं । यह मॉडल एक विश्वसनीय और सुविधाजनक प्रणाली है जिसमें इन विट्रो मेंCAVD की जांच करने के लिए प्रदान करता है, और इस विनाशकारी रोग के लिए जिंमेदार आणविक तंत्र की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

CD31 एंटीबॉडी इस्तेमाल किया डॉ करेन टैन, एडिनबर्ग विश्वविद्यालय से एक उदार उपहार था । इस अध्ययन के एक संस्थान रणनीतिक कार्यक्रम अनुदान के रूप में जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद (BBSRC) से धन द्वारा समर्थित किया गया था (BB/J004316/ किउ/E/D/20221657) (VEM और CF), एक संस्थान कैरियर पथ फैलोशिप bb/F023928/1 (VEM), और एक BBSRC मामले में छात्र बी सी के माध्यम से छात्र धन/K011618/1 (नियंत्रण रेखा) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection scissors World Precision Instruments 14393 Autoclave before use.
Spring straight (8 mm blade) World Precision Instruments 15905 Autoclave before use.
SuperFine Vannas scissors (5 mm blade, 8 cm) World Precision Instruments 14003 Autoclave before use.
Dumont #5 tweezers (11 cm) World Precision Instruments 500342 Autoclave before use.
DMEM-F12 Thermo Fisher Scientific 11320074
Foetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 10500064 Filter before adding to culture medium.
Gentamicin Thermo Fisher Scientific 15710049
Absolute ethanol Thermo Fisher Scientific E/0650DF/17 Dilute to 70% v/v in distilled water.
Hydrochloric acid (HCl) Thermo Fisher Scientific H1150PB17 Dilute to 0.6M with distilled water.
Sodium hydroxide (NaOH) Thermo Fisher Scientific UN1823 Dilute to 0.1M with distilled water.
DAPI Thermo Fisher Scientific P36931
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A11005 1/250 dilution in antibody dilution buffer.
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit antibody Thermo Fisher Scientific A21206 1/250 dilution in antibody dilution buffer.
Superscript II kit Thermo Fisher Scientific 18064014
dNTP Thermo Fisher Scientific 18427013
Random primers Thermo Fisher Scientific P/N58875
Taq Polymerase kit Thermo Fisher Scientific 18038026
Tris/Borate/EDTA (TBE) Thermo Fisher Scientific AM9863 Dilute to 1x with distlled water, before use.
Agarose Thermo Fisher Scientific 16500 2% in 1x Tris/Borate/EDTA(TBE).
Lysis buffer (RIPA) Thermo Fisher Scientific 89900
T75 flask Thermo Fisher Scientific 156472
T175 flask Thermo Fisher Scientific 159920
qPCR plates Thermo Fisher Scientific AB0990
Rat Msx2 primer Qiagen QT01084090
Rat Alpl primer Qiagen QT00190680
Rat Enpp1 primer Qiagen QT00181426
RNeasy minikit Qiagen 74104
6-well plates Sigma CLS3516
T25 flask Sigma CLS430639
Monobasic phosphate Sigma S5011
Dibasic phosphate Sigma S5136
Calcium chloride Sigma C1016
Sodium dodecyl sulphate (SDS) Sigma 5030 Dilute to 0.1% with 0.1M NaOH.
Paraformaldehyde Sigma P6148 Dilute to 4% with PBS.
Triton X100 Sigma X100
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A3059
Alizarin red S Sigma A5533 Make up to 2% with distilled water, and adjust to pH 4.2.
TGFβ-1 primer pair: f: GCTACCATGCCAACTTCTGT r: TGTGTTGGTTGTAGAGGGCA Sigma Concentration used: 10 μM
TGFβ-2 primer pair: f: GAAGGCAGAGTTCAGGGTCT r: CGCTGGGTTGGAGATGTTAG Sigma Concentration used: 10 μM
Monoclonal Anti-β-Actin−Peroxidase antibody produced in mouse Sigma A3854 1/50000 dilution in 5% BSA in tris-buffered saline + 0.1% Tween (TBS/T).
Mouse anti-vimentin antibody Sigma v6389 1/900 dilution in antibody dilution buffer (1x phosphate buffered saline (PBS), 1% bovine serum albumin (BSA), 0.3% Triton X-100).
Mouse IgG Sigma I5381 Diluted to the same stock concentration as mouse anti-vimentin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer.
Rabbit IgG GeneTex GTX35035 Diluted to the same stock concentration as rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer.
Rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody Abcam ab5694 1/200 dilution in antibody dilution buffer.
Rabbit anti-CD31 Abcam ab28364 1/50 dilution in 5% BSA inTBS/T.
HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody Dako P0448 1/3000 dilution in in 5% BSA in TBS/T.
Collagenase II Worthington 41512862 Adjust to 425 U/mL with distilled water, and then filter.
SYBR green mastermix Primerdesign PrecisionPLUS-MX-SY
Calcium assay kit Randox CA590
DC protein assay kit Bio-Rad 5000111
ECL reagent GE Healthcare RPN2109
Hyperfilm ECL GE Healthcare 28906837
Nitrocellulose membrane GE Healthcare 10600007
PCR ladder Bioline BIO-33057
Loading dye for gel electrophoresis New England Biolabs B7025S
Syringe filters (0.22 μm) Merck Millipore SLGP033RS
Coverslips Scientific Laboratory Supplies LTD MIC3100
Hematocytometer Marienfeld Superior 640030
Name Company Catalog Number Comments
Camera set up for Alizarin red images:
Camera Nikon D800
Lens Nikon AF_s Micro, Nikko 105 mm, 1:2.8 GED
Dissection forceps 10 cm, curved ends World Precision Instruments 15915 Autoclave before use.

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References

  1. Dweck, M. R., Boon, N. a, Newby, D. E. Calcific aortic stenosis: a disease of the valve and the myocardium. J Am Coll Cardiol. 60 (19), 1854-1863 (2012).
  2. Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: Pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111, 3316-3326 (2005).
  3. Mohler, E. R., Gannon, F., Reynolds, C., Zimmerman, R., Keane, M. G., Kaplan, F. S. Bone formation and inflammation in cardiac valves. Circulation. 103 (11), 1522-1528 (2001).
  4. Monzack, E. L., Masters, K. S. Can valvular interstitial cells become true osteoblasts? A side-by-side comparison. J Heart Valve Dis. 20 (4), 449-463 (2011).
  5. Osman, L., Yacoub, M. H., Latif, N., Amrani, M., Chester, A. H. Role of human valve interstitial cells in valve calcification and their response to atorvastatin. Circulation. 114 (Suppl 1), (2006).
  6. Gu, X., Masters, K. S. Role of the Rho pathway in regulating valvular interstitial cell phenotype and nodule formation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 300 (2), H448-H458 (2011).
  7. Rodriguez, K. J., Masters, K. S. Regulation of valvular interstitial cell calcification by components of the extracellular matrix. J Biomed Mater Res A. 90 (4), 1043-1053 (2009).
  8. Rattazzi, M., Iop, L., et al. Clones of interstitial cells from bovine aortic valve exhibit different calcifying potential when exposed to endotoxin and phosphate. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (12), 2165-2172 (2008).
  9. Zhu, D., Hadoke, P. W. F., et al. Ablation of the androgen receptor from vascular smooth muscle cells demonstrates a role for testosterone in vascular calcification. Sci Rep. 6 (April), 24807 (2016).
  10. Zhu, D., Mackenzie, N. C. W., Millan, J. L., Farquharson, C., Macrae, V. E. Upregulation of IGF2 expression during vascular calcification. J Mol Endocrinol. 52 (2), 77-85 (2014).
  11. Latif, N., Quillon, A., et al. Modulation of human valve interstitial cell phenotype and function using a fibroblast growth factor 2 formulation. PLoS ONE. 10 (6), (2015).
  12. Liu, A. C., Joag, V. R., Gotlieb, A. I. The emerging role of valve interstitial cell phenotypes in regulating heart valve pathobiology. Am J Pathol. 171 (5), 1407-1418 (2007).
  13. Katwa, L. C., Ratajska, A., et al. Angiotensin converting enzyme and kininase-II-like activities in cultured valvular interstitial cells of the rat heart. Cardiovasc Res. 29 (1), 57-64 (1995).
  14. Shao, J. S., Cheng, S. L., Pingsterhaus, J. M., Charlton-Kachigian, N., Loewy, A. P., Towler, D. A. Msx2 promotes cardiovascular calcification by activating paracrine Wnt signals. J Clin Invest. 115, 1210-1220 (2005).
  15. Mackenzie, N. C. W., Zhu, D., Longley, L., Patterson, C. S., Kommareddy, S., MacRae, V. E. MOVAS-1 cell line: a new in vitro model of vascular calcification. Int J Mol Med. 27, 663-668 (2011).
  16. Kiffer-Moreira, T., Yadav, M. C., et al. Pharmacological inhibition of PHOSPHO1 suppresses vascular smooth muscle cell calcification. J Bone Miner Res. 28, 81-91 (2013).
  17. Cui, L., Rashdan, N. A., et al. End stage renal disease-induced hypercalcemia may promote aortic valve calcification via Annexin VI enrichment of valve interstitial cell derived-matrix vesicles. J Cell Physio. , (2017).
  18. Tsang, H., et al. Exploiting novel valve interstitial cell lines to study calcific aortic valve disease. Mol Med Rep. , In press (2017).

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विकास जीव विज्ञान अंक १२९ Calcific महाधमनी वाल्व रोग महाधमनी वाल्व मध्यवर्ती कोशिकाओं खनिज कैल्शियम फॉस्फेट महाधमनी
अलगाव और प्राथमिक चूहा वाल्व मध्यवर्ती कोशिकाओं के लक्षण वर्णन: एक नया मॉडल महाधमनी वाल्व कड़ा अध्ययन करने के लिए
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Lin, C., Zhu, D., Markby, G., Corcoran, B. M., Farquharson, C., Macrae, V. E. Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification. J. Vis. Exp. (129), e56126, doi:10.3791/56126 (2017).

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