Summary
Denne protokollen beskriver isolasjon, kultur og forkalkning av rotte-avledet ventil interstitielle cellene, en svært fysiologiske i vitro modell av calcific Aortaklaff sykdom (CAVD). Utnyttelse av denne rotte modell forenkler CAVD forskning i cellen og molekylære mekanismer som ligger til grunn for denne komplekse patologiske prosessen.
Abstract
Calcific Aortaklaff sykdom (CAVD) er preget av den progressive jevning av Aortaklaff løpesedler. Det er en tilstand som er ofte funnet i eldre og end-stage renal disease (ESRD) pasienter, som ofte lider av hyperphosphatemia og hypercalcemia. I dag finnes det ingen medisiner behandling som kan stoppe sin progresjon. Mekanismene underlie patologiske prosessen fortsatt uklare. Aortaklaff heftet består av et tynt lag av ventilen endotelceller (VECs) på den ytre overflaten av de aorta spisser, med ventil interstitielle cellene (VICs) klemt mellom VECs. Bruk av en rotte modell kan studere i vitro ektopisk forkalkninger basert på i vivo physiopathological serum fosfat (Pi) og kalsium (Ca) nivåer av pasienter som lider av hyperphosphatemia og hypercalcemia. Beskrevet protokollen detaljer isolering av rotte ren VIC befolkningen som vist av uttrykket av VIC markører: alpha-glatt muskel utgangen (α-SMA) vimentin og vev vekst faktor beta (TGFβ) 1 og 2, og fraværet av klynge av differensiering (CD) 31, en VEC markør. Ved å utvide disse VICs, kan biokjemiske genetiske og tenkelig studier utføres for å studere og løse viktige meglere underbygger CAVD.
Introduction
Sunn aortic ventilen består av tre brosjyrer, som distribusjon av mekanisk stress under åpning og lukking av ventilen er like delte. Ventilen brosjyren har en definert struktur av tre forskjellige sjiktene: fibrosa, spongiosa og ventricularis, hus ventil interstitielle cellene (VICs) som dominerende cellen. Disse tre lagene er klemt mellom to senger ventil endotelceller (VECs)1.
VICs spiller en avgjørende rolle i utviklingen av Calcific Aortic ventilen forkalkninger (CAVD), den vanligste hjertesykdom ventil i den vestlige verden. CAVD er beskrevet som en progressiv tilstand som er aktivt regulert Valvulær vevet og dens omkringliggende microenvironment. Mobilnettet endringer føre først fibrotiske fortykkelse, og til slutt en omfattende forkalkning av Aortaklaff løpesedler. Dette så fører til betydelig Aortaklaff stenose og til slutt venstre ventrikkel utløp obstruksjon2, forlater kirurgisk ventil erstatning som eneste levedyktige behandling.
I Patofysiologien ved CAVD er kompleks, men deler lignende mekanismer til fysiologiske bein mineralisering3. Mens, en rekke studier har vist evne til VICs å gjennomgå osteogenic trans-differensiering og forkalkninger4,5, mekanismer grunnlag for denne prosessen har ennå å bli fullt belyst, fremhever den avgjørende forutsetning for en mulig og relevant i vitro modell av CAVD.
Tidligere arbeid av en rekke laboratorier ble isolert VICs fra svin og storfe, og kultivert disse cellene under calcifying forhold6,7,8. På grunn av den store størrelsen på aortic ventilen i disse modellene, har isolering av celler gjennom enzymatisk fordøyelsen vært svært effektive i å generere ren bestander av celler. Men kan disse modellene være begrenset på grunn av den begrensede tilgjengeligheten av molekylære verktøy for store dyrearter. Derimot være gnager modeller fordelaktig på grunn av relativt lavere kostnader, potensialet for genetisk manipulasjon og omfattende utvalg av molekylære verktøy som er tilgjengelig. Imidlertid er isolering av VICs fra små dyr modeller ikke mye ansatt, som er en sannsynlig konsekvens av vanskelighetene når du arbeider med små vevsprøver.
Denne detaljerte protokollen rapporterer en omfattende metoden for direkte isolering av rotten VICs. Forsiktig Disseksjon av ventilen, etterfulgt av en rekke enzymatisk digestions, kan VICs isolert og ansatt i en rekke eksperimentelle teknikker, inkludert celle kultur og forkalkninger gene expression. Denne svært relevant i vitro modellen av CAVD vil utvilsomt gjøre et viktig bidrag til å øke vår kunnskap om denne patologiske prosessen.
Protocol
Alle dyreforsøk ble godkjent av The Roslin instituttets dyr brukere, og dyrene ble opprettholdt Home Office (UK) retningslinjer og bruk av dyr. For protokollen beskrevet nedenfor, ble 5 - uke gamle, mannlig Sprague Dawley rotter brukt.
1. reagens oppskrifter
- Forberede kultur medium bruker Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) og næringsstoff blanding F-12 (DMEM/F12). Legge til 10% sterilisert inaktivert fosterets bovin serum (FBS) og 1% gentamicin.
- Forberede forkalkninger middels bruker kultur medium og 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi.
- Klargjør 1 M veisalt (CaCl2) ved veiing ut 555 mg av CaCl2 og oppløses den i 5 mL destillert vann for å lage 5 mL av 1 M CaCl2. Filtrere løsningen gjennom et 0.22 µm sprøyte filter å sterilisere løsningen.
- Forberede 1 M natrium fosfat ved veiing 710 mg vannfri dibasic natrium fosfat (Na2HPO4) og 600 mg av vannfri monobasic natrium fosfat (NaH2PO4), oppløsende hver separat i 5 mL destillert vann. Kombiner 3,870 µL av Na2HPO4 og 1,130 µL av NaH2PO4og filteret gjennom et 0.22 µm sprøyte filter å sterilisere løsning.
- Forberede den vaske bufferen som inneholder Hanks balansert Salt løsning (HBSS) og 1% gentamicin.
2. forberedelse av disseksjon hette
- Utføre alle dissections i ventilert hette, tidligere desinfiseres med 70% etanol å sikre steriliteten av prøver og reagenser.
- Sterilisere disseksjon verktøy av autoklavering dem etterfulgt av leve tips av verktøyene i et beaker med 70% etanol før bruk.
- Forberede kanner med vaskebuffer og suge disseksjon verktøyene i vaskebuffer før komme i kontakt med dyr eller vev. Holde vaskebuffer på is til alle tider.
3. utvinning av primære rotte VICs
Merk: For protokollen beskrevet nedenfor, 5 - uke gamle, mannlig Sprague Dawley rotter ble brukt.
- Innhente rotter (~ 100 g) av cervical forvridning UK Home Office retningslinjer.
- For å analysere ut hjertet av hver rotte, plassere dyret supine på et glass disseksjon bord og rense huden ved å sprøyte med 70% etanol.
- Foreta en 4 cm snitt i midtlinjen av rotte ved hjelp av disseksjon saks, å avsløre bukhulen, og fjern forsiktig ribbeinet buret og lungene, å avsløre hjertet.
- Fjerne hjertet med en skarp, våren buet saks og lagre dissekert hjertet i isen kalde vaskebuffer til alle brutto disseksjoner av rotter er fullført.
- For å mikro-analysere hver hjerter, dekket overføring sistnevnte til en Petriskål i vaskebuffer. Trim cardiac muskler med en våren rett saks (6 mm blad) stå med et lite område rundt stigende aorta og aorta roten.
- Bruker samme våren rett saks (6 mm blad), nøye klippes stigende aorta mot venstre ventrikkel og utsette Aortaklaff løpesedler.
- Overføre åpnet aorta til en frisk og sterile Petriskål fylt med HBSS. Dissekere ut Aortaklaff flygeblader, preget av deres unike 'U' skikkelsen ved foten av aorta, med en Vannas-type capsulotomy mikro-saks (3 mm blad).
- Lagre alle flygeblader i 1 mL av is kaldt vaskebuffer, i en 1,5 mL microcentrifuge tube til alle disseksjoner er fullført.
- Når alle flygeblader har vært høstet, sentrifuge dem 100 x g for 1 min på 4 ° C fjerne vaske bufferen.
- Utføre fremgangsmåten i celle kultur hette å sikre sterilisering. For å fjerne VECs, fordøye flygeblader i 100 µL 425 U/mL collagenase II i 5 min på 37 ° C. Forstyrre fordøyelsen av pipettering forsiktig opp og ned ved hjelp av en 200 µL pipette tips.
- Sentrifuger 100 x g for 30 s pellets løpesedler, og forkaste nedbryting nøye. Vaske to ganger med 500 µL vaskebuffer og re pellets cellene med sentrifugering 100 x g for 30 s.
- For å høste VICs fra løpesedler, fordøye med 100 µL av 425 U/mL collagenase II for 2t og slipper VICs av pipettering forsiktig opp og ned ved hjelp av en 200 µL pipette tips.
- Fortynne collagenase II i 19 mL kultur medium og sentrifuger 670 x g for 5 min til pellets VICs og gjenværende ventil pakningsvedlegget rusk. Forkaste nedbryting og overføre brosjyrer og VICs til kultur plater/flasker tilsvarende (tabell 1).
- Kultur VICs 5-7 dager kultur medium, til confluency oppnås ved 37 ° C, i nærvær av 5% (karbondioksid) CO2, endre mediet etter 72 h. For senere bruk i vitro eksperimenter når passasjen opptil 5 ganger når confluency 100%.
4. induksjon av forkalkning av rotte VICs
Merk: For alle eksperimentene, telle celler med en hemocytometer.
- Utføre alle primære celle såing og passaging i steriliserte hoods å forhindre forurensing. For å forberede primære rotte VICs i vitro forkalkninger eksperimenter, frø cellene på en tetthet av 150.000 celler/godt i 6-og plater. Opprettholde kultur medium til ≥ 90% confluency (vanligvis 72 h).
- Behandle VICs med forkalkninger versus kontroll medium og ruge ved 37 ° C, i nærvær av 5% CO2, en ytterligere 72 h.
- For å studere calcified primære rotta VICs for påfølgende nedstrøms analyser, fjerne forkalkninger/kontroll mediet og vask monolayers med vaskebuffer fjerne ikke-bundet Ca og Pi ioner.
5. rotte VIC karakteristikk
- For immunostaining å overvåke fenotypiske markører som vimentin og α-SMA, frø rotta VICs på en tetthet av 150.000 celler/godt i 6 vel-plater inneholder cover slips (celler vil vokse på overflaten av cover papirlapper), og vokser frem 50% confluency.
- Sug opp kultur medium og fastsette celle monolayers med 4% paraformaldehyde (PFA) for 10 min før vask dem 3 ganger med fosfat bufret saltvann (PBS), i 5 min hver gang.
Forsiktig: PFA er giftig og må behandles forsiktig. - Inkuber celle monolayer med blokkering og permeabilization (1 x PBS, 5% av normal serum fra den samme arten som sekundær antistoffer, 0,3% Triton X-100) 1t ved romtemperatur.
- Inkuber celle monolayers med musen anti-vimentin og kanin anti-α-SMA antistoffer utvannet antistoff fortynning buffer (1% bovin serum albumin + 0,3% Triton X-100 i PBS) over natten ved 4 ° C, forsiktig rister på en rocker.
Merk: Negative kontroller besto av ikke-konjugerte musen IgG og kanin IgG, bruker de samme fortynninger som testprøvene. - På dagen kan du vaske av primære antistoffer 3 ganger med PBS, i 5 min hver gang.
- Inkuber celle monolayers med fluorophore-konjugerte sekundære antistoffer 1t i romtemperatur, forsiktig rister på en rocker.
- Vask 3 ganger med PBS, og forsiktig tweeze ut coverslips (som inneholder rotte VICs) med en tang og plass på en dekkglassvæske som inneholder 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). La lysbildene til cure for minst 24 timer på 4 ° C før visualisere med fluorescens mikroskop.
- For Western blot analyse, frø rotta VICs på en tetthet av 150 000 celler/godt i 6 vel-plater og la til å vokse i kultur medium til 100% confluent.
- Bruk 8 µg protein kjøre en Western blot å måle uttrykk for CD31 og eliminere noen VEC forurensning.
Merk: En protokoll som standard Western blot ble etterfulgt som beskrevet tidligere9. - For gen studier, ekstra ribonukleinsyre (RNA) ved hjelp av en kommersiell kit etter produsentens retningslinjer.
- Få cDNA bruker omvendt transkripsjon for å måle mål gener uttrykk med polymerasekjedereaksjons (PCR) og sanntid PCR (RT PCR, også kjent som qPCR) med grønne fluorophore deteksjon, bruker Gapdh som referanse genet, som tidligere beskrevet10.
- Bruk følgende program for PCR analyse: 1 syklus 94 ° c for 3 min, 30 sykluser av 94 ° C for 30 s, 63 ° C for 30 s, 72 ° C i 35 s, og til slutt 1 syklus av 72 ° C for 5 min.
- Bruk følgende program for qPCR analyse: 1 syklus 95 ° c for 10 min, 40 sykluser av 95 ° C for 15 s, 60 ° C i 1 min og en ekstra syklus 95 ° c for 1 minutt, 55 ° C for 30 s og 95 ° C for 30 s.
- Kjøre en gel geleelektroforese å analysere PCR produkter med en 2% agarose gel Tris/Borate/EDTA (TBE) buffer.
6. rotte VIC forkalkninger studier
- Alizarin rød S og biokjemiske forkalkninger studier, følg såing og forkalkninger retningslinjene som er beskrevet i delen 4.
- Stain celle monolayers med 5% Alizarin rød S løsning, forsiktig rocking på en shaker, for 20 min. Senere vaskes 3 ganger med destillert vann, i 5 min hver gang. Hente bilder i hver brønn.
- For å måle Ca deponering, bruke en biokjemiske Ca analysen kit. Leach Ca2 + ioner bruker 0.6 M saltsyre (HCl) for 24 h på 4 ° C, med milde agitasjon.
- Høste nedbryting og måle Ca konsentrasjonen med en Ca analysen kit (se Tabell for materiale) etter produsentens retningslinjer.
- Beregne kalsium konsentrasjon som en brøkdel av totale mobilnettet protein. Denature mobilnettet proteiner fra cellen monolayers med 0.1 M natriumhydroksid (NaOH) + 0,1% natrium dodecyl sulfat (SDS). Bestemme total protein konsentrasjonen med en vaskemiddel kompatibel (DC) protein analysen etter produsentens retningslinjer.
Representative Results
Målet med denne protokollen var å beskrive isolering av primære rotte VICs og kultur dem for i vitro forkalkninger eksperimenter. Ved å bruke metoden beskrevet ovenfor, kan rotte VICs være isolert og utvidet for å studere mekanismer som er ansvarlig for CAVD.
Rotte primære VICs co lokalisere med etablerte VIC indikatorer:
VIC fenotypen av isolerte celler ble bekreftet gjennom immunofluorescence av leter etter VIC markører: vimentin og α-SMA (rødt og grønt, henholdsvis figur 1A), og er i samsvar med tidligere rapporter11,12. Representant negative kontrollene ikke-konjugerte musen og kanin IgG vises i figur 1B. I tillegg ble uttrykk for VIC-vekst regulatoren TGFβ-1 og TGFβ-2 bekreftet PCR analyse (figur 1 c). For å bekrefte at isolert rotta primære VICs var fri fra endothelial forurensning, Western blot analyse ble gjennomført for å bekrefte at rotte var VICs negativ for endothelial celle markøren, CD31, med hjørnetann mitral VECs som en positiv ( Figur 1 d).
Ca og Pi indusere rotte VIC forkalkninger:
Forhøyede systemisk Ca og/eller Pi konsentrasjoner vanligvis kjøre forkalkning av VICs i vitro. Hvis du vil sette pris på forkalkninger potensialet av isolerte rotte VICs, ble cellene utsatt for forhøyede nivåer av Ca og Pi, som etterligner patologisk hypercalcemia og hyperphosphatemia forhold i ESRD pasienter. Behandling av VICs med 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi indusert forkalkninger, som bestemmes av Alizarin rød S flekker for Ca avsettelse (figur 2A) og kolorimetrisk fastsettelse av Ca-nivåer etter HCl utvasking (81 hjord. p < 0,05 ved hjelp av Student t-Test; Figur 2B).
Gene Expression filendringer tilknyttet VIC forkalkninger:
Forkalkning av vaskulære celler i vitro er forbundet med en tydelig molekylær profil. Studien, behandling av VICs med 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi forårsaket en betydelig økning i mRNA uttrykk for osteogenic markører: Msh homeobox 2, Msx2 (2.04 fold endring; p < 0.01; Figur 3A), alkalisk fosfatase, Alpl (1.49 kaste endring; p < 0,001; Figur 3B), og phosphoethanolamine/phosphocholine fosfatase, Phospho1 (4,7 fold endring; p < 0,01 med enveis ANOVA; Figur 3 c). Men forble uttrykket osteogenic markør, Runx2og forkalkninger hemmer ectonucleotide pyrophasphatase, Enpp1, uendret (figur 3D-E).
Figur 1. Uttrykk for VIC. (A) Immunofluorescence viser dobbelt flekker og colocalization alpha-glatt muskel utgangen (α-SMA, grønn) og vimentin ventil interstitielle cellene (VICs). (B) representativt bilde av negative kontroller ved hjelp av musen og kanin IgG. Kjerner er farget i blått bruker 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Skala bar = 50 µm. (C) tilstedeværelsen av transformasjon av vekstfaktor beta 1 (TGFβ-1) og TGFβ-2 i VICs (baner 1 - 3) Som vist av PCR analyse. Lane 4 er kontrollen vann. Referanse genet brukte var Gapdh. (D) Western blot analyse viser rikelig uttrykk for CD31 i hjørnetann mitral ventil endotelceller (VECs) i forhold til ingen uttrykk i VICs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. In vitro forkalkning av rotte VICs. Ca avsettelse i VICs behandlet med 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi som: (A) fotografi viser Alizarin rød S farging av hele cellen monolayers i godt og (B) kolorimetrisk fastsettelse av Ca-nivåer etter HCl utvasking. Student t-test ble utført for å analysere betydningen mellom de to gruppene. Resultatene presenteres som betyr ± S.E.M. *p < 0,5 sammenlignet med kontrollen. (n = 4).
Figur 3. Gene expression filendringer tilknyttet VIC forkalkninger. Fold endre i mRNA uttrykket for osteogenic (A) Msx2, (B) Alpl, (C) Phospho1, (D) Runx2og (E) Enpp1 i VICs behandlet med 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi for 48 h. mRNA uttrykk vises som en fold endring i forhold til endogene referanse genet Gadph. Enveis VARIANSANALYSE med generell lineær modell Innlemming pair-wise sammenligninger ble utført for å analysere betydningen mellom flere grupper. Resultatene presenteres som betyr ± S.E.M. **p < 0.01; p < 0,001 sammenlignet med kontrollen. (n = 6). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Antall ventil brosjyrer | Kultur plate/kolbe |
| 9 til 15 | 1 i 12-vel plate |
| 15 til 30 | 1 i 6-vel plate |
| 30 + | T25 |
Tabell 1. Generelle retningslinjer for antall brosjyrer kreves for innledende seeding.
Discussion
Denne detaljerte protokollen beskriver en praktisk metode for kjøp av primære rotte VICs, slik at isolering av disse cellene fra rotte hjertet ventiler gjennom enzymatisk fordøyelsen. Vår metode videre støtter og utvider en tidligere rapportert rotte i vitro modell å studere Aortaklaff forkalkninger13. Isolasjon av VICs fra aortic ventilen introduserer potensialet for forurensning fra nærliggende VECs. Men bekrefter våre immunofluorescence data at det første fordøyelse skrittet er tilstrekkelig å fjerne VECs, gjengivelse isolert cellene negativ for endothelial celle markøren, CD31. Videre bekrefter α-SMA flekker aktivert fenotypen av VICs, som kreves for forkalkninger12.
VIC isolasjoner tidligere er rapportert i stor dyr modeller6,7,8. Men er disse artene begrenset av begrenset genetiske og molekylære verktøy som er tilgjengelig for nedstrøms studien, samt deres begrenset tilgjengelighet i over hele verden. Slike verktøy er godt etablert i tilgjengelige gnagere og derfor muligheten til å isolere rotte-avledet VICs muliggjør større eksperimentell designkapasitet. Bruk av VICs fra ung rotter betyr også at cellene er relativt mer proliferativ enn eldre rotter, som krever mindre dyr til flere celler. Selv om mus er lett tilgjengelig, men på grunn av mus har spesielt små hjerter, isolasjon av hovedknappen på musen VICs ville være mer tidkrevende og betydelig mer dyr ville være nødvendig å isolere samme avkastningen av celler som rotte modell.
En betydelig fordel av denne beskrevet tilnærmingen er at VICs kan være isolert timelig fra vill type og transgene rotter, samt rotte modeller av hjerte sykdom og ventil skade. Ved hjelp av rotte modellen vil kreve et større antall dyr for storskala eksperimenter, derfor redusere dyr bruk, primære rotten VICs kan bli transformert til å produsere en celle linje når det har vært godt preget.
Mens alvorlig klinisk implikasjonene av CAVD er anerkjent, ennå de underliggende mekanismene som forårsaker bestemmes. I tillegg presenterer effektive medisiner behandling som kan forebygge og helbrede potensielt Aortaklaff forkalkninger ikke er tilgjengelig på. Kulturen i VICs under calcifying forhold gir derfor en svært relevant i vitro modell av CAVD. Vi viser at Ca og Pi forhøyde induserer i vitro forkalkning av isolerte rotte VICs med en samtidig økning i uttrykket av osteogenic genet markører Msx2, Alplog Phospho1. Det er mye etablert at disse markørene er forbundet med patologiske prosessen vaskulær forkalkninger14,15,16. Våre data viser derfor at kulturen i rotte VICs i calcifying medium er en passende modell med å studere Aortaklaff forkalkninger i vitro. Faktisk har studier fra vårt laboratorium utnyttet denne modellen for å demonstrere at Ca fremmer Aortaklaff forkalkninger gjennom Annexin VI anriking av VIC-avledet matrix blemmer17.
Til tross for fordeler av benytter rotte VICs og deres effektive karakterisering, eksisterer noen begrensninger fremdeles. Først VIC befolkningen i rotte ventiler er svært liten, og derfor mange dyr er nødvendig for å generere tilstrekkelig cellen tallene for omfattende i vitro studier. Det er imidlertid mulig å overkomme denne begrensningen av foretak forstudier i udødeliggjort ventil interstitiell cellelinjer, som nylig rapportert av oss18, og deretter ansette primære kulturer å bekrefte og utvide disse funnene.
I sammendraget forklarer metoden beskrevet vellykket isolasjon, kultur og forkalkning av primære rotte VICs, som senere vurderes ved hjelp av en rekke analyser inkludert biokjemiske analyser, samt protein og RNA analyser. Denne modellen gir et pålitelig og praktisk system å undersøke CAVD i vitro, og gir et verdifullt verktøy for å undersøke de molekylære mekanismene som er ansvarlig for denne ødeleggende sykdommen.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
CD31 antistoffer brukt var en sjenerøs gave fra Dr. Karen Tan, University of Edinburgh. Denne studien ble støttet av finansiering fra bioteknologi og Biological Sciences Research Council (BBSRC) i form av en Institute strategiske program tilskudd (BB/J004316/1; BBS/E/D/20221657) (VEM og CF), en Institute karriere banen Fellowship BB/F023928/1 (VEM) og studentship midler via en BBSRC tilfelle Studentship BB/K011618/1 (Langbane).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave before use. |
| Spring straight (8 mm blade) | World Precision Instruments | 15905 | Autoclave before use. |
| SuperFine Vannas scissors (5 mm blade, 8 cm) | World Precision Instruments | 14003 | Autoclave before use. |
| Dumont #5 tweezers (11 cm) | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave before use. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
| Foetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Filter before adding to culture medium. |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710049 | |
| Absolute ethanol | Thermo Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in distilled water. |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher Scientific | H1150PB17 | Dilute to 0.6M with distilled water. |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | UN1823 | Dilute to 0.1M with distilled water. |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | 1/250 dilution in antibody dilution buffer. |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | 1/250 dilution in antibody dilution buffer. |
| Superscript II kit | Thermo Fisher Scientific | 18064014 | |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | 18427013 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | P/N58875 | |
| Taq Polymerase kit | Thermo Fisher Scientific | 18038026 | |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) | Thermo Fisher Scientific | AM9863 | Dilute to 1x with distlled water, before use. |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500 | 2% in 1x Tris/Borate/EDTA(TBE). |
| Lysis buffer (RIPA) | Thermo Fisher Scientific | 89900 | |
| T75 flask | Thermo Fisher Scientific | 156472 | |
| T175 flask | Thermo Fisher Scientific | 159920 | |
| qPCR plates | Thermo Fisher Scientific | AB0990 | |
| Rat Msx2 primer | Qiagen | QT01084090 | |
| Rat Alpl primer | Qiagen | QT00190680 | |
| Rat Enpp1 primer | Qiagen | QT00181426 | |
| RNeasy minikit | Qiagen | 74104 | |
| 6-well plates | Sigma | CLS3516 | |
| T25 flask | Sigma | CLS430639 | |
| Monobasic phosphate | Sigma | S5011 | |
| Dibasic phosphate | Sigma | S5136 | |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma | 5030 | Dilute to 0.1% with 0.1M NaOH. |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS. |
| Triton X100 | Sigma | X100 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3059 | |
| Alizarin red S | Sigma | A5533 | Make up to 2% with distilled water, and adjust to pH 4.2. |
| TGFβ-1 primer pair: f: GCTACCATGCCAACTTCTGT r: TGTGTTGGTTGTAGAGGGCA | Sigma | Concentration used: 10 μM | |
| TGFβ-2 primer pair: f: GAAGGCAGAGTTCAGGGTCT r: CGCTGGGTTGGAGATGTTAG | Sigma | Concentration used: 10 μM | |
| Monoclonal Anti-β-Actin−Peroxidase antibody produced in mouse | Sigma | A3854 | 1/50000 dilution in 5% BSA in tris-buffered saline + 0.1% Tween (TBS/T). |
| Mouse anti-vimentin antibody | Sigma | v6389 | 1/900 dilution in antibody dilution buffer (1x phosphate buffered saline (PBS), 1% bovine serum albumin (BSA), 0.3% Triton X-100). |
| Mouse IgG | Sigma | I5381 | Diluted to the same stock concentration as mouse anti-vimentin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer. |
| Rabbit IgG | GeneTex | GTX35035 | Diluted to the same stock concentration as rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer. |
| Rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody | Abcam | ab5694 | 1/200 dilution in antibody dilution buffer. |
| Rabbit anti-CD31 | Abcam | ab28364 | 1/50 dilution in 5% BSA inTBS/T. |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Dako | P0448 | 1/3000 dilution in in 5% BSA in TBS/T. |
| Collagenase II | Worthington | 41512862 | Adjust to 425 U/mL with distilled water, and then filter. |
| SYBR green mastermix | Primerdesign | PrecisionPLUS-MX-SY | |
| Calcium assay kit | Randox | CA590 | |
| DC protein assay kit | Bio-Rad | 5000111 | |
| ECL reagent | GE Healthcare | RPN2109 | |
| Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906837 | |
| Nitrocellulose membrane | GE Healthcare | 10600007 | |
| PCR ladder | Bioline | BIO-33057 | |
| Loading dye for gel electrophoresis | New England Biolabs | B7025S | |
| Syringe filters (0.22 μm) | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Coverslips | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3100 | |
| Hematocytometer | Marienfeld Superior | 640030 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera set up for Alizarin red images: | |||
| Camera | Nikon D800 | ||
| Lens | Nikon AF_s Micro, Nikko 105 mm, 1:2.8 GED | ||
| Dissection forceps 10 cm, curved ends | World Precision Instruments | 15915 | Autoclave before use. |
References
- Dweck, M. R., Boon, N. a, Newby, D. E. Calcific aortic stenosis: a disease of the valve and the myocardium. J Am Coll Cardiol. 60 (19), 1854-1863 (2012).
- Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: Pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111, 3316-3326 (2005).
- Mohler, E. R., Gannon, F., Reynolds, C., Zimmerman, R., Keane, M. G., Kaplan, F. S. Bone formation and inflammation in cardiac valves. Circulation. 103 (11), 1522-1528 (2001).
- Monzack, E. L., Masters, K. S. Can valvular interstitial cells become true osteoblasts? A side-by-side comparison. J Heart Valve Dis. 20 (4), 449-463 (2011).
- Osman, L., Yacoub, M. H., Latif, N., Amrani, M., Chester, A. H. Role of human valve interstitial cells in valve calcification and their response to atorvastatin. Circulation. 114 (Suppl 1), (2006).
- Gu, X., Masters, K. S. Role of the Rho pathway in regulating valvular interstitial cell phenotype and nodule formation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 300 (2), H448-H458 (2011).
- Rodriguez, K. J., Masters, K. S. Regulation of valvular interstitial cell calcification by components of the extracellular matrix. J Biomed Mater Res A. 90 (4), 1043-1053 (2009).
- Rattazzi, M., Iop, L., et al. Clones of interstitial cells from bovine aortic valve exhibit different calcifying potential when exposed to endotoxin and phosphate. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (12), 2165-2172 (2008).
- Zhu, D., Hadoke, P. W. F., et al. Ablation of the androgen receptor from vascular smooth muscle cells demonstrates a role for testosterone in vascular calcification. Sci Rep. 6 (April), 24807 (2016).
- Zhu, D., Mackenzie, N. C. W., Millan, J. L., Farquharson, C., Macrae, V. E. Upregulation of IGF2 expression during vascular calcification. J Mol Endocrinol. 52 (2), 77-85 (2014).
- Latif, N., Quillon, A., et al. Modulation of human valve interstitial cell phenotype and function using a fibroblast growth factor 2 formulation. PLoS ONE. 10 (6), (2015).
- Liu, A. C., Joag, V. R., Gotlieb, A. I. The emerging role of valve interstitial cell phenotypes in regulating heart valve pathobiology. Am J Pathol. 171 (5), 1407-1418 (2007).
- Katwa, L. C., Ratajska, A., et al. Angiotensin converting enzyme and kininase-II-like activities in cultured valvular interstitial cells of the rat heart. Cardiovasc Res. 29 (1), 57-64 (1995).
- Shao, J. S., Cheng, S. L., Pingsterhaus, J. M., Charlton-Kachigian, N., Loewy, A. P., Towler, D. A. Msx2 promotes cardiovascular calcification by activating paracrine Wnt signals. J Clin Invest. 115, 1210-1220 (2005).
- Mackenzie, N. C. W., Zhu, D., Longley, L., Patterson, C. S., Kommareddy, S., MacRae, V. E. MOVAS-1 cell line: a new in vitro model of vascular calcification. Int J Mol Med. 27, 663-668 (2011).
- Kiffer-Moreira, T., Yadav, M. C., et al. Pharmacological inhibition of PHOSPHO1 suppresses vascular smooth muscle cell calcification. J Bone Miner Res. 28, 81-91 (2013).
- Cui, L., Rashdan, N. A., et al. End stage renal disease-induced hypercalcemia may promote aortic valve calcification via Annexin VI enrichment of valve interstitial cell derived-matrix vesicles. J Cell Physio. , (2017).
- Tsang, H., et al. Exploiting novel valve interstitial cell lines to study calcific aortic valve disease. Mol Med Rep. , In press (2017).
