Summary
このプロトコルでは、分離、カルチャ、および石灰化弁のラット由来間質細胞の石灰性大動脈弁疾患 (CAVD) の高い生理生体外モデルをについて説明します。このモデルラットの搾取は、CAVD セルとこの複雑な病理学的プロセスの根底にある分子メカニズムを探る研究を促進します。
Abstract
石灰性大動脈弁疾患 (CAVD) は、大動脈弁のリーフレットの進歩的な肥厚が特徴です。一般的高りん血症、高カルシウム血症に苦しむ人腎臓病 (ESRD) 患者、高齢者や終末期に頻繁にある状態です。現時点では、その進行を止めることができます薬物療法がないです。この病理学的プロセスの基になるメカニズムは不明します。大動脈弁尖が弁血管内皮細胞 (VECs) の薄層弁間質細胞 (VICs)、VECs に挟まれたとの大動脈弁尖の外側表面上で構成されます。ラット モデル使用する生体内でphysiopathological 血清リン酸 (Pi) と高りん血症、高カルシウム血症に苦しむ患者のカルシウム (Ca) 濃度に基づく異所性石灰化の生体外で研究。記述されていたプロトコル ヴィック マーカーの式で示すように、純粋なラット ビクトリア州人口の分離の詳細: α-平滑筋アクチン (α SMA) ビメンチンと組織成長因子 β (TGFβ) 1、2 と分化 (CD) 31、VEC のクラスターがない場合マーカー。これらの VICs を展開して研究し、CAVD を支える重要な仲介物質を解明する生化学的、遺伝子およびイメージングの研究を実行できます。
Introduction
健康な大動脈弁は、バルブの開閉時の機械的応力分布は均等に分配する 3 つのリーフレットで構成されます。弁尖が定義した 3 つの層の構造: 線維、海綿と ventricularis、どの家が優勢な細胞型と間質細胞 (VICs) をバルブします。これらの 3 つの層に挟まれた弁血管内皮細胞 (VECs)12 台のベッド。
VICs は、進行の石灰性大動脈弁石灰化 (CAVD)、西部の世界で最も一般的な心臓弁疾患で重要な役割を果たします。CAVD は積極的に弁膜組織とその周囲の微小環境によって調節される進歩的な条件として記述されます。携帯電話の変更は、当初、線維性肥厚と最終的に大動脈弁尖の広範な石灰化を引き起こします。これは、重要な大動脈弁狭窄につながる、最終的には、左室流出路閉塞2、唯一の可能な治療として外科的な弁置換を残してします。
CAVD の病態が複雑な生理学的な骨の鉱化作用の3に同じようなメカニズムを共有します。ながら、研究の数は、骨トランス分化および石灰化4,5を受けるための VICs の能力を示している、このプロセスを支えるメカニズムがまだ完全に解明されて強調表示、CAVD の実現と関連する体外モデルの重要な要件です。
研究所の数によって前作が正常にブタとウシのモデルから VICs を分離し、石灰化条件6,7,8の下でこれらの細胞を培養します。これらのモデルの大動脈弁のサイズが大きいため酵素消化を通って細胞の分離はセルの純粋な人口を生成する非常に効果的なされています。ただし、これらのモデルは大型動物種における分子ツールの限定のために制限することができます。対照的に、齧歯動物モデルの比較的低コスト、遺伝子操作の可能性、容易に利用可能な分子ツールの広範な配列による有利なまま。ただし、小型動物モデルからの VICs の隔離は広く採用されない、小さい組織サンプルを扱うときの問題の起こりそうな結果であります。
この詳細なプロトコルは、ラット VICs の直接の隔離のための包括的な法を報告します。酵素の消化力のシリーズに続く、バルブを細かくして VICs を分離し、さまざまな実験、細胞培養、石灰化と遺伝子発現を含むで採用できます。この関連性の高い体外モデル CAVD の間違いなくこの病理学的プロセスの私達の知識の向上に不可欠な貢献になります。
Protocol
すべての動物実験は、ロスリン研究所の動物ユーザー委員会によって承認された、動物のケアとの動物の使用のためのホーム オフィス (イギリス) ガイドラインに従って維持されました。下記プロトコル、5 週間の古い、男性スプレイグ ラットが使用されました。
1. 試薬のレシピ
- ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) と栄養混合物 F-12 (DMEM/f12 キー) を使用して培養液の準備します。10% 滅菌熱不活化牛胎児血清 (FBS) と 1% のゲンタマイシンを追加します。
- 培養液と 2.7 mM Ca/2.5 Pi を使用して石灰化媒体の準備します。
- CaCl2 555 mg を量り分けると 1 M CaCl2の 5 mL を作るため 5 mL の蒸留水に溶解して1 M 塩化カルシウム(CaCl2) を準備します。ソリューションをソリューションを殺菌する 0.22 μ m シリンジ フィルターをフィルターします。
- 計量 710 mg 無水塩基リン酸ナトリウム (Na2HPO4) うちと無水塩基性リン酸ナトリウム (NaH2PO4) 600 mg を 5 mL の蒸留水に溶解して1 M リン酸ナトリウムを準備します。水。ソリューションを殺菌する 0.22 μ m シリンジ フィルターを通して 3,870 μ L の Na2HPO4 1,130 μ NaH2PO4とフィルターを組み合わせます。
- 準備、洗浄バッファーをハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS) と 1% のゲンタマイシンを含有します。
2. 解離フードの準備
- 以前サンプルおよび試薬の無菌性を確保するための 70% エタノールで消毒、換気フードのすべての解剖を実施します。
- 郭清ツールをそれらを使用する前に 70% エタノールを含むビーカーにツールのヒントを浸すことによって続いたオートクレーブで滅菌します。
- ビーカー洗浄バッファーを含むを準備し、動物や組織と接触する前に洗浄バッファーで郭清ツールを浸します。すべての回で氷の上洗浄バッファーを保持します。
3. 初代ラット VICs の抽出
注: 以下に示すプロトコルの 5 週間の古い、男性スプレイグ ラットが使用されました。
- ラットを処分 (~ 100 g) 英国ホーム オフィスのガイドラインに従って子宮頸の転位で。
- 各ラットの心臓を解剖するには、ガラス解剖板に動物の仰臥位を配置し、70% エタノールを噴霧して皮膚を消毒します。
- ラットの腹腔内を公開し、胸郭と肺、心臓を公開する慎重に取り外します、解剖はさみの助けを借りて正中線で 4 cm の切開を行います。
- シャープのペアで心臓を取り出して曲線はさみを春ラットの総解剖のすべてが完了するまで氷冷洗浄バッファーで切り裂かれた心を保管します。
- マイクロ - それぞれの心の解剖、ペトリ皿に転送、後者は洗浄バッファーで説明します。小さな周辺では、上行大動脈、大動脈と左に春まっすぐハサミ (6 mm 刃) と心筋をトリムします。
- 同じを使用してまっすぐはさみ (6 mm 刃) の春、慎重に左心室に向かって上行大動脈を切開、大動脈弁のリーフレットを公開します。
- 新鮮な滅菌シャーレ HBSS でいっぱいに開いた大動脈を転送します。Vannas 型 capsulotomy マイクロ剪刀 (刃 3 mm) のペアで、大動脈の基部、ユニークな 'U' の形状によって特徴づけられる、大動脈弁のリーフレットを解剖します。
- すべてのチラシを 1 mL の氷冷洗浄バッファーすべて解剖が完了するまでは、1.5 mL 遠心チューブに格納します。
- すべてのチラシが収穫された後は、洗浄バッファーを削除する 4 ° C で 1 分 100 × g で遠心します。
- 滅菌を確実に細胞文化フードで後続の手順を実行します。100 μ L 425 U/mL コラゲナーゼ II 37 ° C で 5 分間のリーフレットを消化、VECs を削除するには200 μ L ピペット チップを使って軽くピペッティングして消化を中断します。
- 100 × g で遠心する 30 s、リーフレットをペレットし、上澄みを慎重に廃棄します。500 μ L の洗浄バッファーで 2 回洗浄し、30 の 100 × g で遠心分離によって細胞を再ペレット s。
- チラシから VICs を収穫するには、2 h 425 U/mL コラゲナーゼ II の 100 μ L で消化し、上下に 200 μ L ピペット チップを使用して軽くピペッティングして VICs を解放します。
- 19 ml 培養液とビックスと残りの弁尖の残骸をペレットに 5 分間、670 × g で遠心するコラゲナーゼ II を希釈します。培養上清を破棄し、それに応じて文化板/フラスコにリーフレットや VICs を転送 (表 1)。
- 培養 72 時間後のメディアの変更培地、37 ° c、5% (二酸化炭素) CO2の存在下での confluency に到達するまでに 5-7 日間 VICs。In vitroの実験でその後の使用のための通路 5 回まで合流したら 100% に達する。
4. ラット VICs の石灰化の誘導
注: すべての実験のため、診断とセルをカウントします。
- シードと汚染を防ぐために滅菌のフードの継のすべての一次電池を実行します。石灰化実験の in vitroの初代ラット VICs を準備をするには、細胞/ウェル 6 ウェル プレートで 150,000 の密度で細胞を播きます。≥ 90% の confluency (通常 72 h) まで培地の維持します。
- 石灰化を制御媒体対 VICs を扱い、37 ° c、5% CO2、さらに 72 時間の存在下で孵化させなさい。
- 以降の下流解析の石灰化の初代ラット VICs を勉強するには、石灰化/制御媒体を削除および非バインドの Ca と Pi のイオンを除去するのに洗浄バッファーで単分子膜を洗浄します。
5. ラット ヴィックのキャラクタリゼーション
- ビメンチンと α-SMA のシード細胞/ウェル 6 ウェル プレートで 150,000 の密度でラット VICs などの表現型マーカーを監視する免疫染色を含むカバー スリップ (セルはカバー スリップの表面に増加します)、50% の confluency まで成長しておきます。
- 培養培地を吸引し、5 分毎回 10 分のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 3 回を洗濯する前に 4% パラホルムアルデヒド (PFA) と細胞膜を修正します。
注意: PFA は毒性があり慎重に処理する必要があります。 - ブロックと透過バッファーでセル単一層を孵化させなさい (1 × PBS、二次抗体と同じ種から正常な血清の 5%、0.3% トリトン X-100) 室温で 1 時間。
- 細胞膜を抗体希釈バッファーで希釈し、マウス抗ビメンチンとウサギ抗 α SMA の抗体とインキュベート (1% ウシ血清アルブミン + 0.3 %pbs でトリトン X-100) 一晩 4 ° c、そっとロッカーに揺れ。
注: 否定的なコントロールから成って非共役マウス IgG とウサギ IgG、テスト サンプルとして同じ希釈液を使用します。 - 次の日 3 回 5 分たびに PBS の一次抗体を洗浄します。
- ロッカーに優しく揺れ、常温で 1 h の蛍光標識二次抗体と細胞膜を孵化させなさい。
- PBS 洗浄 3 回、鉗子、coverslip 含む 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 上の場所のペアを持つ coverslips (ラット VICs を含んだ) を軽くピンセットで抜きます。蛍光顕微鏡による可視化の前に 4 ° C で、少なくとも 24 時間を治すためスライドを残します。
- 西部のしみの分析の 150,000 の密度で VICs 6 ウェル プレートで細胞/ウェルと合流まで 100% 成長培地のままのラットをシードします。
- CD31 の発現を測定し、VEC 汚染を排除するのに西部のしみを実行するのに蛋白質の 8 μ g を使用します。
注: 標準的な西部のしみのプロトコルは、9を前述のように続いた。 - 遺伝子研究、製造元のガイドラインに従って商業キットを使用してリボ核酸 (RNA) を抽出します。
- ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) を使用してターゲット遺伝子発現を測定する逆のトランスクリプションを使用して cDNA を取得およびリアルタイム PCR (RT-PCR 法; 別名 qPCR) 緑蛍光検出、以前として参照の遺伝子としてGapdhの使用10を説明します。
- PCR 解析の次のプログラムを使用: 94 ° C の 3 分の 1 サイクル 30 サイクル 94 ° C の 30 s、63 ° C、30 s、72 ° C、35 s、および 5 分の 72 ° C の最後に 1 サイクル。
- QPCR 分析のために次のプログラムを使用: 95 ° c、10 分間 1 サイクル 95 の 40 のサイクルの 30 s、95 ° C、30 ° C 15 秒、1 分、1 分、55 ° C の 95 ° C の追加サイクルの 60 ° C の s。
- トリス、ホウ酸塩、EDTA (TBE) バッファーに 2% の agarose のゲルを使用して PCR の製品を分析するゲルの電気泳動を実行します。
6. ラット ヴィック石灰化研究
- アリザリン赤 S および生化学的な石灰化研究は、セクション 4 で説明されているシードと石灰化のガイドラインに従ってください。
- 5% アリザリンレッド S 溶液、20 分間、シェーカーで優しくロッキングと細胞膜を染色します。その後 5 分間たびに、蒸留水で 3 回を洗ってください。各ウェルの画像を取得します。
- Ca 沈着を定量化するには、生化学的 Ca 測定キットを使用します。穏やかな動揺と、4 ° C で 24 時間 0.6 M 塩酸 (HCl) を使用して Ca2 +イオンを溶出します。
- 収穫 Ca アッセイを用いた Ca 濃度キット (材料表参照) 清とメジャー メーカーのガイドラインに従います。
- 総細胞蛋白質の一部分としてカルシウム濃度を計算します。0.1 M 水酸化ナトリウム (NaOH) + 0.1% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) と細胞膜から細胞蛋白質を変化します。製造元のガイドラインに従って、互換性のある洗剤 (DC) 蛋白質のアッセイを用いた総蛋白濃度を決定します。
Representative Results
このプロトコルの目的は、初代ラット VICs の分離を記述し、石灰化の in vitro実験のためそれらの文化でした。上記の方法を採用し、ラット VICs できます正常に分離して、CAVD 機構の研究のために拡張します。
ラット一次 VICs を共同設立ヴィック マーカーとローカライズします。
ヴィックのマーカーの調査によって蛍光抗体法を通じて単離細胞のヴィックの表現型を確認した: ビメンチンと α SMA (赤と緑、それぞれ、図 1 a)、以前レポート11,12と一致しています。図 1 bは、非共役のマウスおよびウサギ IgG による代表的なネガティブ コントロールを示しています。さらに、PCR を用いた (図 1) ヴィック成長調整剤 TGFβ 1 TGFβ 2 の発現が確認されました。ラット摘出主 VICs 内皮細胞汚染から解放されたラットを確認する西部のしみの分析を行ったことを確認するために VICs が陰性で血管内皮細胞マーカー、CD31、肯定的なコントロール (として犬の僧帽弁 VECs の使用図 1)。
Ca と Pi は、ラット ヴィック石灰化を誘発します。
全身 Ca や Pi 濃度通常 VICs体外の石灰化はドライブします。ラット VICs の石灰化潜在性を認めて、細胞は Ca と Pi の慢性腎不全患者における高カルシウム血症と高りん血症病態を模倣のレベルが上昇にさらされました。アリザリン赤 S 染色 (図 2 a) Ca 沈着と次の HCl (81 倍の溶出 Ca 濃度の比色定量法が定める、2.7 mM Ca/2.5 Pi と VICs の治療による石灰化、p < 0.05 使用学生のt-テスト;図 2 b)。
ヴィックの石灰化に関連する遺伝子発現の変動:
培養血管細胞の石灰化は、異なる分子プロファイルに関連付けられます。本研究では 2.7 mM Ca/2.5 Pi と VICs の治療による骨のマーカーの発現が大幅に増加: Msh ホメオ ボックス 2、 Msx2 (2.04 倍変更;p < 0.01;図 3 a)、アルカリホスファターゼ、 Alpl (1.49 倍変更;p < 0.001;図 3 b) と phosphoethanolamine/phosphocholine ホスファターゼ、 Phospho1 (4.7 倍変更;一方向の分散分析; を使用してp < 0.01図 3)。しかし、骨のマーカー、 Runx2, 石灰化阻害剤 ectonucleotide pyrophasphatase、 Enpp1式は変更されません (図 3 D-E) 残った。
図 1。ヴィックのマーカーの発現します。(A) 蛍光二重染色と α-平滑筋アクチン (α SMA; グリーン) とビメンチン弁間質細胞 (VICs) で表示します。(B) マウスおよびウサギ IgG を使用して否定的なコントロールの代表的なイメージ。核が青色 4', 6-diamidino-2-phenylindole を使用して (DAPI) で染色します。スケールバー = 50 μ m. トランスフォーミング増殖因子 β 1 (TGFβ 1) の存在 (C) と VICs のTGFβ 2 (レーン 1-3) PCR 解析によって示すように。レーン 4、水コントロールです。使用される参照の遺伝子は、 Gapdhだった。(D) 西部のしみの分析 VICs でない式と比較して犬の僧帽弁内皮細胞 (VECs) CD31 の豊かな表情を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。石灰化の in vitroラット VICs 。VICs の Ca 沈着治療 2.7 mm Ca/2.5 Pi によって決定される: (A) ワカ アリザリン赤 S はまあ、および (B) 次の塩酸溶出 Ca 濃度の比色定量のセル全体を単分子膜の染色します。学生のt-2 つのデータ グループ間の意義を分析する試験を行った。± S.E.M. を意味するように結果が表示されます *p < 0.5 コントロールと比較して(n = 4)。
図 3。ヴィックの石灰化に関連する遺伝子発現変動。(A) Msx2 Alpl(B)、(C) Phospho1、(D) Runx2、骨マーカーの発現の変更フォールドと VICs で (E) Enpp1治療 Ca/2.5 mM の Pi 2.7 mM48 h. mRNA 発現は内因性の参照の遺伝子と比較してフォールドの変更として表示されますGadph.複数のグループ間の意義を分析する対比較を組み込む一般的な線形モデルを用いた一方向の分散分析を行った。± S.E.M. を意味するように結果が表示されます * *p < 0.01;p < 0.001 コントロールと比較して(n = 6)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 弁尖の数 | 文化プレート/フラスコ |
| 15 に 9 | 12 ウェル プレートでよく 1 |
| 15 に 30 | 6 ウェル プレートでよく 1 |
| 30 + | T25 |
表 1.初期シードに必要なチラシの数のための一般的なガイドライン。
Discussion
この詳細なプロトコルでは、初代ラット VICs、酵素消化によるラット心臓弁からこれらのセルの隔離の有効化の獲得のための実用的な方法について説明します。私たちのメソッドは、さらにサポートし、大動脈弁石灰化13を勉強する以前に報告されたラットの in vitroモデルの用途が広がります。大動脈弁からの VICs の隔離は、隣接 VECs から汚染の可能性を紹介します。ただし、蛍光抗体法によりデータは初期消化手順が VECs は、血管内皮細胞マーカー、CD31 陰性隔離されたセルのレンダリングを削除するための十分なことを確認します。さらに、α SMA の染色は、石灰化12に必要な VICs のアクティブ化された表現型を確認します。
ビクトリア州の分離は、以前報告されている大型動物モデル6,7,8。ただし、これらの種は、限られた下流の研究だけでなく、世界中の研究所で、アクセシビリティが制限されて利用可能なツールの遺伝学的および分子によって制限されます。対照的に、このようなツールは容易に入手できる齧歯動物およびしたがって、ラット由来の VICs により大容量の実験的なデザインを分離する機能に定評。幼若ラットから VICs の使用はまた細胞が比較的より古いラット、したがってより多くの細胞を生成するための動物を必要とするよりも増殖を意味します。マウスが容易にアクセスできるが、マウスのため、分離の特に小さい心を持つマウスの主の VICs は、時間がかかるだろうし、かなり多くの動物はラットのモデルとしてセルの同じ収量を分離する必要があります。
この記述方法の重要な利点は VICs が野生型遺伝子導入ラットと心血管疾患と弁の傷害のモデルラットから一時的に分離することができます。モデルラットを用いた多数動物の大規模な実験、したがってをする必要が動物の使用を減らす、初代ラット VICs は一度も特徴とされているセルの行を生成する変換ことができます。
CAVD の厳しい臨床的意義が広く認識しながら根本的な原因となるメカニズムまだ覚悟しなければなりません。さらに、できなくなり、大動脈弁の石灰化を治す可能性のある治療法は利用できませんでの効果的な薬を提示します。石灰化する条件の下で VICs の文化したがって、CAVD の関連性の高い体外モデルを提供します。Ca と Pi レベルの上昇がラット骨遺伝子マーカー Msx2、 Alpl、およびPhospho1の発現の増加と VICs の試験管に石灰化を誘導するを紹介します。広く、これらのマーカーは、血管石灰化14,15,16の病理学的プロセスに関連付けられているを設立します。我々 のデータしたがってラット VICs 石灰化する中での文化が大動脈弁石灰化の培養を研究するための適切なモデルであることを示します。確かに、当研究室の最近の研究は、Ca がヴィック由来の小胞の17のアネキシン VI 濃縮によって大動脈弁の石灰化を促進することを示すこのモデルを活用しています。
ラット VICs とその効率的な特性を使用しての利点があるにもかかわらず、いくつかの制限はまだ存在します。まず、ラット バルブ内のビクトリア州人口のサイズは非常に小さい、従って多くの動物は広範な生体外で研究の十分なセル番号を生成するために必要な。ただし、不死化弁間質細胞ライン、18、私たちによって最近報告されて、確認し、これらの調査結果を拡張後に初代培養を用いた予備的な調査を実施しこの制限を克服することが可能です。
要約すると、この方法は、分離を成功させる、カルチャ、およびプライマリ ラット VICs は、その後様々 な生化学的な試金蛋白質など分析・ RNA 解析を使用して査定されるかもしれないの石灰化について説明します。このモデルは、CAVD体外、調査される信頼性と便利なシステムを提供しています、この破壊的な疾患の分子機構を調査するための貴重なツールを提供します。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
CD31 抗体の使用は、博士カレン ・ タン、エジンバラ大学から寛大な贈り物だった。本研究は、バイオ テクノロジーと研究所戦略的プログラム助成 (BB/J004316/1; の形で生物科学研究会議 (BBSRC) からの資金によって支えられました。BBS/E/D/20221657) (系粘弾性体と CF)、研究所キャリア パス交わり BB/F023928/1 (系粘弾性体)、および就労資金 BBSRC 場合就労 BB/K011618/1 (LC) を経由。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave before use. |
| Spring straight (8 mm blade) | World Precision Instruments | 15905 | Autoclave before use. |
| SuperFine Vannas scissors (5 mm blade, 8 cm) | World Precision Instruments | 14003 | Autoclave before use. |
| Dumont #5 tweezers (11 cm) | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave before use. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
| Foetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Filter before adding to culture medium. |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710049 | |
| Absolute ethanol | Thermo Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in distilled water. |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher Scientific | H1150PB17 | Dilute to 0.6M with distilled water. |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | UN1823 | Dilute to 0.1M with distilled water. |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | 1/250 dilution in antibody dilution buffer. |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | 1/250 dilution in antibody dilution buffer. |
| Superscript II kit | Thermo Fisher Scientific | 18064014 | |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | 18427013 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | P/N58875 | |
| Taq Polymerase kit | Thermo Fisher Scientific | 18038026 | |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) | Thermo Fisher Scientific | AM9863 | Dilute to 1x with distlled water, before use. |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500 | 2% in 1x Tris/Borate/EDTA(TBE). |
| Lysis buffer (RIPA) | Thermo Fisher Scientific | 89900 | |
| T75 flask | Thermo Fisher Scientific | 156472 | |
| T175 flask | Thermo Fisher Scientific | 159920 | |
| qPCR plates | Thermo Fisher Scientific | AB0990 | |
| Rat Msx2 primer | Qiagen | QT01084090 | |
| Rat Alpl primer | Qiagen | QT00190680 | |
| Rat Enpp1 primer | Qiagen | QT00181426 | |
| RNeasy minikit | Qiagen | 74104 | |
| 6-well plates | Sigma | CLS3516 | |
| T25 flask | Sigma | CLS430639 | |
| Monobasic phosphate | Sigma | S5011 | |
| Dibasic phosphate | Sigma | S5136 | |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma | 5030 | Dilute to 0.1% with 0.1M NaOH. |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS. |
| Triton X100 | Sigma | X100 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3059 | |
| Alizarin red S | Sigma | A5533 | Make up to 2% with distilled water, and adjust to pH 4.2. |
| TGFβ-1 primer pair: f: GCTACCATGCCAACTTCTGT r: TGTGTTGGTTGTAGAGGGCA | Sigma | Concentration used: 10 μM | |
| TGFβ-2 primer pair: f: GAAGGCAGAGTTCAGGGTCT r: CGCTGGGTTGGAGATGTTAG | Sigma | Concentration used: 10 μM | |
| Monoclonal Anti-β-Actin−Peroxidase antibody produced in mouse | Sigma | A3854 | 1/50000 dilution in 5% BSA in tris-buffered saline + 0.1% Tween (TBS/T). |
| Mouse anti-vimentin antibody | Sigma | v6389 | 1/900 dilution in antibody dilution buffer (1x phosphate buffered saline (PBS), 1% bovine serum albumin (BSA), 0.3% Triton X-100). |
| Mouse IgG | Sigma | I5381 | Diluted to the same stock concentration as mouse anti-vimentin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer. |
| Rabbit IgG | GeneTex | GTX35035 | Diluted to the same stock concentration as rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer. |
| Rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody | Abcam | ab5694 | 1/200 dilution in antibody dilution buffer. |
| Rabbit anti-CD31 | Abcam | ab28364 | 1/50 dilution in 5% BSA inTBS/T. |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Dako | P0448 | 1/3000 dilution in in 5% BSA in TBS/T. |
| Collagenase II | Worthington | 41512862 | Adjust to 425 U/mL with distilled water, and then filter. |
| SYBR green mastermix | Primerdesign | PrecisionPLUS-MX-SY | |
| Calcium assay kit | Randox | CA590 | |
| DC protein assay kit | Bio-Rad | 5000111 | |
| ECL reagent | GE Healthcare | RPN2109 | |
| Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906837 | |
| Nitrocellulose membrane | GE Healthcare | 10600007 | |
| PCR ladder | Bioline | BIO-33057 | |
| Loading dye for gel electrophoresis | New England Biolabs | B7025S | |
| Syringe filters (0.22 μm) | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Coverslips | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3100 | |
| Hematocytometer | Marienfeld Superior | 640030 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera set up for Alizarin red images: | |||
| Camera | Nikon D800 | ||
| Lens | Nikon AF_s Micro, Nikko 105 mm, 1:2.8 GED | ||
| Dissection forceps 10 cm, curved ends | World Precision Instruments | 15915 | Autoclave before use. |
References
- Dweck, M. R., Boon, N. a, Newby, D. E. Calcific aortic stenosis: a disease of the valve and the myocardium. J Am Coll Cardiol. 60 (19), 1854-1863 (2012).
- Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: Pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111, 3316-3326 (2005).
- Mohler, E. R., Gannon, F., Reynolds, C., Zimmerman, R., Keane, M. G., Kaplan, F. S. Bone formation and inflammation in cardiac valves. Circulation. 103 (11), 1522-1528 (2001).
- Monzack, E. L., Masters, K. S. Can valvular interstitial cells become true osteoblasts? A side-by-side comparison. J Heart Valve Dis. 20 (4), 449-463 (2011).
- Osman, L., Yacoub, M. H., Latif, N., Amrani, M., Chester, A. H. Role of human valve interstitial cells in valve calcification and their response to atorvastatin. Circulation. 114 (Suppl 1), (2006).
- Gu, X., Masters, K. S. Role of the Rho pathway in regulating valvular interstitial cell phenotype and nodule formation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 300 (2), H448-H458 (2011).
- Rodriguez, K. J., Masters, K. S. Regulation of valvular interstitial cell calcification by components of the extracellular matrix. J Biomed Mater Res A. 90 (4), 1043-1053 (2009).
- Rattazzi, M., Iop, L., et al. Clones of interstitial cells from bovine aortic valve exhibit different calcifying potential when exposed to endotoxin and phosphate. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (12), 2165-2172 (2008).
- Zhu, D., Hadoke, P. W. F., et al. Ablation of the androgen receptor from vascular smooth muscle cells demonstrates a role for testosterone in vascular calcification. Sci Rep. 6 (April), 24807 (2016).
- Zhu, D., Mackenzie, N. C. W., Millan, J. L., Farquharson, C., Macrae, V. E. Upregulation of IGF2 expression during vascular calcification. J Mol Endocrinol. 52 (2), 77-85 (2014).
- Latif, N., Quillon, A., et al. Modulation of human valve interstitial cell phenotype and function using a fibroblast growth factor 2 formulation. PLoS ONE. 10 (6), (2015).
- Liu, A. C., Joag, V. R., Gotlieb, A. I. The emerging role of valve interstitial cell phenotypes in regulating heart valve pathobiology. Am J Pathol. 171 (5), 1407-1418 (2007).
- Katwa, L. C., Ratajska, A., et al. Angiotensin converting enzyme and kininase-II-like activities in cultured valvular interstitial cells of the rat heart. Cardiovasc Res. 29 (1), 57-64 (1995).
- Shao, J. S., Cheng, S. L., Pingsterhaus, J. M., Charlton-Kachigian, N., Loewy, A. P., Towler, D. A. Msx2 promotes cardiovascular calcification by activating paracrine Wnt signals. J Clin Invest. 115, 1210-1220 (2005).
- Mackenzie, N. C. W., Zhu, D., Longley, L., Patterson, C. S., Kommareddy, S., MacRae, V. E. MOVAS-1 cell line: a new in vitro model of vascular calcification. Int J Mol Med. 27, 663-668 (2011).
- Kiffer-Moreira, T., Yadav, M. C., et al. Pharmacological inhibition of PHOSPHO1 suppresses vascular smooth muscle cell calcification. J Bone Miner Res. 28, 81-91 (2013).
- Cui, L., Rashdan, N. A., et al. End stage renal disease-induced hypercalcemia may promote aortic valve calcification via Annexin VI enrichment of valve interstitial cell derived-matrix vesicles. J Cell Physio. , (2017).
- Tsang, H., et al. Exploiting novel valve interstitial cell lines to study calcific aortic valve disease. Mol Med Rep. , In press (2017).
