Summary
Bu iletişim kuralı yalıtım, kültür ve kalsifikasyon sıçan kaynaklı Vana interstisyel hücrelerin son derece fizyolojik vitro manken kireçlenmeler aort kapak hastalığı (CAVD) açıklanmaktadır. Bu fare modeli sömürü CAVD araştırma hücre ve moleküler mekanizmaları bu karmaşık patolojik süreç altında yatan Exploring kolaylaştırır.
Abstract
Kireç aort kapak hastalığı (CAVD) aort kapak broşürler ilerici kalınlaşma ile karakterizedir. Sık sık Hiperfosfatemi ve Hiperkalsemi muzdarip yaşlı ve son aşama böbrek hastalığı (ESRD) hastalarda, buldum bir durumdur. Şu anda, ilerlemesi durdurabilir hiçbir ilaç tedavileri vardır. Bu patolojik süreç altında yatan mekanizmaları belirsiz kalır. Aort kapak broşürü hücrelerle VECs arasında gözükeceksin Vana interstisyel (kurban) aort cusps dış yüzeylerinde Vana endotel hücrelerinin (VECs) ince bir tabaka oluşur. Bir fare modeli kullanın Ektopik kalsifikasyon in vivo Fizyopatolojik serum fosfat (PI) ve kalsiyum (Ca) düzeyleri Hiperfosfatemi ve Hiperkalsemi muzdarip hastaların temel vitro çalışma sağlar. VIC işaretleri ifade tarafından gösterildiği gibi saf sıçan VIC nüfus yalıtım açıklanan protokol detayları: Alfa-düz kas aktin (α-SMA) vimentin ve doku büyüme faktörü beta (TGFβ) 1 ve 2 ve küme farklılaşma (CD) 31, bir VEC yokluğu işaret. Bu kurban genişleterek, biyokimyasal, genetik ve görüntüleme çalışmaları çalışma ve CAVD destek anahtar arabulucu unravel gerçekleştirilebilir.
Introduction
Sağlıklı aort kapak için eşit mekanik stres dağıtım sırasında açılış ve kapanış Vana paylaştırıldı üç broşürler oluşur. Vana belgesi üç farklı katmanların tanımlanmış bir yapısı vardır: fibrosa, spongiosa ve ventricularis, hangi ev Vana interstisyel hücreleri (kurban) baskın hücre türü olarak. Bu üç katman Vana endotel hücreleri (VECs)1iki yatak arasında gözükeceksin.
Kurban, kireçlenmeler aort kapak kalsifikasyon (CAVD), Batı dünyasında en yaygın kalp kapak hastalığı ilerleme kritik bir rol oynamaktadır. CAVD aktif olarak valvular doku ve onun çevresindeki microenvironment tarafından yetkilendirilmekte ilerici bir koşulu olarak tanımlanıyor. Hücresel değişiklikler başlangıçta fibrotik kalınlaşma ve sonunda aort kapak broşürler geniş bir kalsifikasyon neden. Bu önemli aort stenozu yol açar ve sonuçta, sol ventrikül çıkış obstrüksiyonu2cerrahi kapak replasmanı tek uygun tedavi olarak bırakarak.
CAVD Patofizyoloji karmaşıktır, ancak fizyolojik kemik Qafqaz3benzer mekanizmalar paylaşır. Iken çalışmalar bir dizi Osteojenik trans-farklılaşma ve kalsifikasyon4,5geçmesi kurban yeteneğini göstermiştir, bu işlem destek mekanizmaları tam aydınlatılmamıştır, vurgulama henüz CAVD mümkün ve ilgili vitro modelinin çok önemli gereksinimini.
Laboratuvarlar bir dizi önceki iş başarıyla domuz ve sığır modellerden kurban izole ve koşullar6,7,8kalsifiye altında bu hücreler kültürlü. Bu modeller aort kapak büyük büyüklüğü nedeniyle, yalıtım hücrelerin Enzimatik sindirim yoluyla saf nüfus hücre oluşturmak için son derece etkili olmuştur. Ancak, bu modeller büyük hayvan türleri için moleküler araçlar sınırlı yer nedeniyle kısıtlayıcı olabilir. Buna ek olarak, kemirgen modelleri nispeten daha düşük maliyet, potansiyel genetik manipülasyon için ve kolayca kullanılabilir moleküler araçları geniş yelpazede nedeniyle avantajlı kalır. Ancak, kurban izolasyonu küçük hayvan modelleri yaygın olarak, hangi küçük doku örnekleri ile çalışırken karşılaşılan zorluklar, büyük olasılıkla bir sonucudur istihdam değil.
Bu ayrıntılı iletişim kuralı sıçan kurban doğrudan yalıtım için kapsamlı bir yöntemi bildirir. Enzimatik sindirim, bir sıra tarafından Vana, dikkatli diseksiyon tarafından kurban izole ve deneysel teknikleri, hücre kültürü, kalsifikasyon ve gen ifadesi de dahil olmak üzere çok çeşitli olarak istihdam. Bu son derece alakalı vitro modeli CAVD, hiç şüphesiz bu patolojik süreci ile ilgili bilgilerimizi artırmak için önemli bir katkı sağlayacaktır.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Roslin Enstitüsü nün hayvan kullanıcılar Komitesi tarafından kabul edildi ve hayvanların bakım ve hayvanların kullanımı için Home Office (UK) kuralları uyarınca muhafaza. Aşağıda belirtilen iletişim kuralı için 5 - hafta yaşlı, erkek Sprague Dawley Rat kullanıldı.
1. reaktif tarifleri
- Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) ve besin karışımı F-12 (DMEM/F12) kullanarak kültür ortamı hazırlamak. Steril % 10 ısı inaktive fetal sığır serum (FBS) ve % 1 gentamisin ekleyin.
- Kalsifikasyon orta kültür orta ve 2.7 mM Ca/2.5 mM Pi kullanarak hazırlayın.
- 1 M Kalsiyum klorür (CaCl2) CaCl2 555 mg tartma ve 1 M CaCl25 mL 5 mL distile su içinde eriterek hazırlayın. Çözüm çözüm sterilize etmek için 0,22 µm şırınga filtre ile filtre.
- 1 M sodyum fosfat 710 mg susuz dibasic sodyum fosfat (Na2HPO4) dışarı ve 600 mg susuz yem mono sodyum fosfat (NaH2PO4), her biri ayrı ayrı 5 mL distile eriterek ağırlığında hazırlamak su. Na2HPO4 3,870 µL ve NaH2PO4ve filtre 1,130 µL çözüm sterilize etmek için bir 0,22 µm şırınga filtreden birleştirir.
- Hank'in dengeli tuz çözüm (HBSS) ve % 1 gentamisin içeren arabellek yıkayın hazırlayın.
2. diseksiyon Hood hazırlanması
- Daha önce kısırlık örnekleri ve reaktifler sağlamak için % 70 etanol ile dezenfekte havalandırılmış bir başlıklı tüm gruptakiler yerine getirir.
- Diseksiyon araçları tarafından ipuçları araçları kullanmadan % 70 etanol önce içeren bir ölçek çeker tarafından takip ısıyla sterilize.
- Yıkama arabellek içeren kadehler hazırlamak ve hayvan veya dokulara temas gelmeden önce yıkama arabellekte diseksiyon araçları ıslatın. Yıkama arabellek buz üzerinde tutunuz.
3. birincil fare kurban çıkarımı
Not: aşağıda belirtilen iletişim kuralı için 5 - hafta yaşlı, erkek Sprague Dawley Rat kullanıldı.
- Fareler itlaf (~ 100 gr) tarafından İngiltere'de Home Office kurallarına uygun olarak servikal çıkığı.
- Her fare kalp incelemek için hayvan bir cam diseksiyon gemide sırtüstü yerleştirin ve % 70 etanol ile püskürtülerek cilt dezenfekte.
- 4 cm kesi farenin orta hat diseksiyon makası, karın boşluğu maruz ve göğüs kafesi ve akciğerler kalp ortaya çıkarmak için dikkatli bir şekilde kaldırmak için yardımı ile yapmak.
- Keskin bir çift ile kalp çıkarın, eğri makas bahar ve tüm brüt diseksiyonlarının Rats'in tamamlanana kadar buz soğuk yıkama arabellekte disseke kalp saklayın.
- Mikro teşrih-her kupa için yıkama arabellekte transfer ikinci bir petri içine kapalı. Artan aort ve aortik kökü çevreleyen küçük bir alan ile kalmak bahar düz makas (6 mm bıçak) ile kalp kası kırpın.
- İstimal ayni düz makas (6 mm bıçak) Bahar, dikkatli bir şekilde artan aort doğru sol ventrikül kesmiş ve aort kapak broşürler bulaşmasına neden.
- Transfer açılan aorta içine taze, steril Petri kabına HBSS ile dolu. Kenasen tipi capsulotomy mikro-makas (3 mm bıçak) ile aort temelini onların benzersiz 'U' şeklinde işaretlenmiş aort kapak broşürleri incelemek.
- Tüm diseksiyonlarının tamamlanana kadar 1.5 mL microcentrifuge tüp buz soğuk yıkama arabellekte 1 mL tüm broşürleri saklayın.
- Bir kez tüm broşürler hasat var, onları vasıl 100 x g 4 ° C'de yıkama arabellek kaldırmak için 1 dk santrifüj kapasitesi.
- Sonraki adımları izleyerek sterilizasyon emin olmak için bir hücre kültür mahallede. VECs kaldırmak için 100 µL 425 U/mL collagenase II 37 ° C'de 5 min için broşürler sindirmek Sindirim yavaşça 200 µL pipet ucu kullanarak yukarı ve aşağı pipetting tarafından bozabilir.
- 100 x g, santrifüj 30 s broşürler cips ve süpernatant dikkatli atmak için. Yıkama ile iki kez 500 µL yıkama tampon ve hücreleri tarafından Santrifüjü 100 x g 30 için de yeniden cips s.
- Kurbanlar broşürler dan hasat için 425 U/mL collagenase II 2 h 100 µL ile sindirmek ve sonra yavaşça 200 µL pipet ucu kullanarak yukarı ve aşağı pipetting tarafından kurban bırakın.
- Collagenase II kültür orta ve santrifüj 670 x g kurban ve kalan Vana belgesi enkaz cips 5 min için de 19 ml seyreltik. Süpernatant atmak ve broşürler ve kurban kültür plakaları/Şişeler için buna göre transfer (Tablo 1).
- Confluency varlığında % 5 (karbon dioksit) CO2orta 72 h sonra değişen, 37 ° C'de ulaşılana kadar kurbanlar için 5-7 gün içinde kültür çevre, kültür. Vitro deneyler sonraki kullanıma geçiş ilâ 5 kere confluency sonra % 100 ulaşır.
4. indüksiyon sıçan kurban kalsifikasyon
Not: Tüm deneyler için bir hemasitometre içeren hücreleri saymak.
- Tüm İlköğretim tohum ve steril davlumbaz kontaminasyonu önlemek için passaging hücre gerçekleştirin. Birincil fare kurban vitro kalsifikasyon deneyler için hazırlamak için hücreleri 150.000 hücreler/iyi içinde 6-şey plakaları yoğunluğu, tohum. Kültür ortamında ≥ % 90 confluency (genellikle 72 h) kadar korumak.
- Kurbanlar kalsifikasyon karşı denetim orta ile tedavi ve varlığında % 5 CO2, için bir ek 72 h 37 ° C'de kuluçkaya.
- Sonraki aşağı akım analizleri için kalsifiye birincil fare kurban çalışmaya, kalsifikasyon/denetim orta kaldırmak ve monolayers bağlı olmayan Ca ve Pi iyonları kaldırmak için yıkama arabelleği ile yıkayın.
5. fare VIC karakterizasyonu
- İmmunostaining fenotipik işaretler için vimentin ve α-SMA, tohum hücreleri/iyi 6 iyi-tabaklar içinde 150.000 yoğunluğu, sıçan kurban olarak izlemek için içeren kapak fişleri, (hücreleri kapak kâğıdını yüzeyinde büyür) ve % 50 confluency kadar büyümeye bırakın.
- Kültür orta Aspire edin ve hücre monolayers %4 paraformaldehyde (PFA) ile 10 dakikadır tamponlanmış fosfat serum (PBS), 3 kez yıkama önce 5 min her zaman için düzeltin.
Dikkat: PFA toksik ve dikkatle ele alınması gerekir. - Arabellek engelleme ve permeabilization ile hücre monolayer kuluçkaya (1 x PBS, normal serum ikincil antikor olarak aynı türlerden % 5, % 0.3 Triton X-100) oda sıcaklığında 1 h için.
- Hücre monolayers ile fare anti-vimentin ve tavşan anti-α-SMA antikor antikor seyreltme arabellekte seyreltilmiş kuluçkaya (%1 sığır serum albümin + % 0,3 PBS Triton X-100) gecede 4 ° C'de bir rocker üzerinde hafifçe sallayarak.
Not: Negatif denetimleri non-Birleşik fare IgG ve tavşan IgG, aynı dilutions test numuneleri kullanılarak oluşuyordu. - Sonraki günde 3 kez ile PBS, 5 min her zaman için birincil antikorlar kapalı yıkayın.
- Hücre monolayers fluorophore Birleşik bir rocker üzerinde hafifçe sallayarak oda sıcaklığında 1 h için ikincil antikorlar ile kuluçkaya.
- 3 kez PBS ile yıkama ve yavaşça forseps ve yer 4', 6-diamidino-2-phenylindole içeren bir coverslip (DAPI) üzerinde bir çift ile (sıçan kurban içeren) coverslips aldım. Floresan mikroskop ile görselleştirme önce en az 24 Saat 4 ° C'de tedavisi için slaytlar bırakın.
- Western blot analizi için fareyi kurban 150.000 yoğunluğu, hücreler/6 iyi-levha iyi ve %100 kadar Konfluent kültür ortamda büyümeye bırakın tohum.
- Protein 8 µg CD31 ifade ölçmek ve herhangi bir VEC kirlenme kural bir Western blot çalıştırmak için kullanın.
Not: Standart Western blot protokolü9daha önce açıklandığı gibi izledi. - Gen araştırmaları için ribonükleik asit (RNA) üreticinin yönergeleri izleyerek ticari bir seti kullanarak ayıklayın.
- Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) kullanarak hedef genlerin ifade ölçmek için ters transkripsiyon kullanarak cDNA elde etmek ve Gapdh olarak daha önce başvuru gen olarak kullanarak gerçek zamanlı PCR (RT-PCR; olarak da bilinen qPCR) ile yeşil fluorophore algılama, 10nitelendirdi.
- PCR analiz için aşağıdaki programı kullanın: 1 döngüsü 30 devredir 30 94 ° c 94 ° C 3 dakika, s, 63 ° C 30 s, 72 ° C için 35 s ve son olarak 1 çevriminde 5 dk 72 ° c.
- QPCR analiz için aşağıdaki programı kullanın: 1 döngüsü 40 döngüleri 95 95 ° C 10 dk, ° C-15 s, 60 ° C için 1 dakika ve ek çevriminin 95 ° C için 1 dakika, 55 ° C için 30 s ve 95 ° C 30 s.
- Bir Jel Elektroforez, PCR ürünleri % 2 özel jel Tris/Bor/EDTA (TBE) bir arabellek kullanarak çözümlemek için çalıştırın.
6. fare VIC kalsifikasyon çalışmaları
- Alizarin Red S ve biyokimyasal kalsifikasyon çalışmalar için lütfen 4 bölümünde açıklanan tohum ve kalsifikasyon yönergeleri izleyin.
- %5 Alizarin kırmızı S çözüm, yavaşça 20 min için bir shaker üzerinde sallanan ile hücre monolayers leke. Daha sonra 3 kez 5 min her zaman için distile su ile yıkayın. Her iyi görüntüler elde etmek.
- CA ifade ölçmek için bir biyokimyasal Ca tahlil seti kullanın. Nazik ajitasyon ile 4 ° C'de 24 h için 0,6 M hidroklorik asit (HCl) kullanarak Ca2 + iyonları leach.
- Süpernatant ölçü Ca tahlil kullanarak Ca konsantrasyon Kiti ( Tablo malzemelerigörmek) hasat ve üreticinin yönergeleri izleyerek.
- Toplam hücresel protein bir kesir olarak kalsiyum konsantrasyonu hesaplayın. Hücre monolayers 0.1 M sodyum hidroksit (NaOH) + % 0,1 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) ile gelen hücresel proteinler denatüre. Üreticinin yönergeleri izleyerek deterjan bir uyumlu (DC) protein tahlil kullanarak toplam protein konsantrasyonu belirlemek.
Representative Results
Bu iletişim kuralının amacı birincil fare kurban yalıtım tarif ve onları vitro kalsifikasyon deneyler için kültür oldu. Yukarıda açıklanan yöntemi kullanarak, sıçan kurban başarılı bir şekilde izole ve CAVD için sorumlu mekanizmaları incelenmesi için genişletilmiş.
Sıçan birincil kurban kurulan VIC işaretleri ile birlikte yerelleştirmek:
VIC fenotip izole hücre ile ayirt VIC işaretçileri için yoklama tarafından doğrulandı: vimentin ve α-SMA (kırmızı ve yeşil, sırasıyla, şekil 1A) ve ile anlaşma önceki raporları11,12' dir. Non-Birleşik fare ve tavşan IgG temsilcisi negatif denetimler şekil 1Badımında gösterilir. Ayrıca, VIC-büyüme regülatörü TGFβ-1 ve TGFβ-2 ifadesi PCR analizi (şekil 1 c) kullanılarak doğrulandı. İzole sıçan birincil kurban endotel kirlenme özgür olduklarını, Western blot analizi şu sıçanı doğrulamak için gerçekleştirilen onaylamak için kurban köpek mitral VECs olumlu denetim ( kullanarak endotel hücre işaretçisi, CD31, negatif Şekil 1 d).
CA ve Pi sıçan VIC kalsifikasyon neden:
Yükseltilmiş sistemik Ca ve/veya Pi konsantrasyonları tipik olarak kurban içinde vitrokalsifikasyon sürücü. İzole sıçan kurban kalsifikasyon potansiyelini anlamak için hücreleri ESRD hastalarda patolojik olarak Gelişen Hiperkalsemi ve Hiperfosfatemi koşulları taklit Ca ve Pi, yüksek düzeyde maruz bırakıldı. Ca ifade (şekil 2A) ve Ca seviyeleri (81 kat; leaching HCl aşağıdaki Renkölçer belirlenmesi için Alizarin Red S boyama tarafından belirlenen kalsifikasyon, kurban tedavi 2.7 mM Ca/2.5 mM Pi ile indüklenen p < 0,05 kullanarak öğrencinin t-Test; Şekil 2B).
VIC kalsifikasyon ile ilişkili gen ifade değişiklikler:
Vasküler hücre vitro kalsifikasyon ayrı bir moleküler profiliyle ilişkilidir. Bu da çalışmanın, mRNA ifade Osteojenik işaretleri önemli bir artış kurban tedavi 2.7 mM Ca/2.5 mM Pi ile indüklenen: Msh homeobox 2, Msx2 (2.04 kat Değiştir; p < 0,01; Şekil 3A), alkalen fosfataz, Alpl (1,49 kat Değiştir; p < 0,001; Şekil 3B) ve phosphoethanolamine/phosphocholine fosfataz, Phospho1 (4.7 kat Değiştir; p < 0,01 tek yönlü ANOVA kullanarak; Şekil 3 c). Ancak, ifade Osteojenik marker, Runx2ve kalsifikasyon inhibitörü ectonucleotide pyrophasphatase, Enpp1, değişmeden (şekil 3D-E) kaldı.
Şekil 1. VIC işaretleri ifade. (A)ayirt çift boyama ve colocalization Alfa-düz kas aktin (α-SMA; yeşil) ve vimentin Vana interstisyel hücrelerde (kurban) gösterilen. (B) kullanarak fare ve tavşan IgG negatif Denetim Temsilcisi görüntüsü. Çekirdeklerin 4', 6-diamidino-2-phenylindole kullanarak Mavili (DAPI) lekeli. Ölçek çubuğu 50 µm. (C) dönüştürme büyüme faktörü beta 1 (TGFβ-1) varlığını = ve TGFβ-2 kurban ' (şerit 1 - 3 PCR analiz tarafından gösterildiği gibi). Lane 4 su denetimidir. Kullanılan referans gen Gapdhyapıldı. (D) Western blot analizi köpek mitral kapak endotel hücreleri (VECs) ile karşılaştırıldığında hiçbir ifadede kurban CD31 bol ifadesi gösteriliyor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Vitro kalsifikasyon sıçan kurban. Kurban CA aşırı yükünün tedavi 2.7 mM Ca/2.5 mM tarafından belirlenen Pi ile:(a)fotoğraf tüm cep telefonu monolayers iyi ve (B) HCl leaching takip Ca seviyeleri Renkölçer belirlenmesi, Alizarin Red S boyama gösterilen. Öğrenci t-testi gerçekleştirilen önemini iki veri grupları arasında çözümlenecek. Sonuçları sunulmuştur demek gibi ± S.E.M. *p < 0,5 karşılaştırıldığında kontrolü ile; (n = 4).
Şekil 3. VIC kalsifikasyon ile ilişkili gen ifade değişiklik. Kat değiştirmek Osteojenik işaretleri mRNA ifade(a) Msx2, (B) Alpl, (C) Phospho1, (D) Runx2ve (E) Enpp1 kurban 2.7 mM Ca/2.5 mM için Pi ile tedavi 48 h. mRNA ifade endojen başvuru gene ile karşılaştırıldığında kat değişiklik olarak gösterilir Gadph. Tek yönlü ANOVA Pair-Wise karşılaştırmalar birleştirilerek Genel doğrusal model kullanarak birden çok grupları arasında önemi analiz etmek için gerçekleştirildi. Sonuçları sunulmuştur demek gibi ± S.E.M. **p < 0,01; p < 0,001 denetimine göre; (n = 6). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Vana broşürler sayısı | Kültür plaka/şişesi |
| 9-15 | 12-şey plaka de 1. |
| 15-30 | 6-şey plaka de 1. |
| 30 + | T25 |
Tablo 1. İlk tohumlama için gerekli broşürler sayısı için genel kurallar.
Discussion
Bu ayrıntılı Protokolü birincil fare kurban, sıçan kalp kapakları Enzimatik sindirim yoluyla bu hücrelerden yalıtım etkinleştirme edinimi için pratik bir yöntem açıklanır. Bizim yöntem daha fazla destekler ve aort kapak kalsifikasyon13çalışmaya daha önce raporlanmış sıçan vitro manken kullanımı uzanır. Kurban izolasyonu aort kapak komşu VECs bulaşma olasılığını sunar. Ancak, bizim ayirt veri ilk sindirim adım izole hücreler endotel hücre işaretçisi, CD31 için negatif işleme VECs kaldırmak için yeterli olduğunu doğrulayın. Ayrıca, α-SMA boyama kurbanlar, aktif fenotip kalsifikasyon12için gerekli olan doğruluyor.
VIC izolasyonların içinde daha önce bildirilmiştir büyük hayvan modelleri6,7,8. Ancak, bu tür aşağı akım çalışma yanı sıra dünya çapında laboratuarlarında sınırlı onların erişilebilirlik için sınırlı genetik ve moleküler araçları tarafından sınırlandırılmıştır. Buna ek olarak, bu tür araçlar hazır kemirgenler ve bu nedenle, yeteneğini daha büyük bir deneysel tasarım kapasitesi sıçan kaynaklı kurban sağlar izole etmek iyi kurulmuş. Genç sıçanlar kurban kullanımından da hücreleri nispeten daha büyük fareler, bu nedenle daha fazla hücre verim için daha az hayvan gerektiren proliferatif olduğu anlamına gelir. Fareler kolayca erişilebilir olmakla birlikte, ama fareler nedeniyle özellikle küçük Kalpler, yalıtım sahip birincil fare kurban daha uzun sürmesine olacağını ve önemli ölçüde daha fazla hayvan sıçan model olarak hücre verim aynı yalıtmak için gerekli olacaktır.
Açıklanan bu yaklaşımın önemli avantajı kurban geçici vahşi türü ve transgenik fareler, yanı sıra fare modelleri, kardiyovasküler hastalık ve Vana yaralanma ayrılmış olabilir olduğunu. Fare modeli kullanarak hayvanlar daha çok sayıda büyük ölçekli deneyler için bu nedenle hayvan kullanımını azaltmak için gerektirecektir, birincil fare kurban bu iyi karakterize bir kez bir hücre kültürünü üretmek için dönüştürülebilir.
CAVD ciddi klinik etkileri yaygın olarak kabul ederken, temel etken mekanizmaları henüz belirlenmesi gerekir. Buna ek olarak, önlemek ve potansiyel olarak aort kapak kalsifikasyon tedavi tedaviler mevcut değildir etkili ilaç mevcut. Kalsifiye koşullar altında kurban kültürünün bu nedenle CAVD son derece alakalı vitro modeli sağlar. Ca ve Pi düzeyleri Osteojenik gen işaretleri Msx2, Alplve Phospho1ifade eşlik eden bir artış ile izole sıçan kurban vitro kalsifikasyon neden göster. Yaygın olarak bu işaretleri Vasküler kalsifikasyon14,15,16patolojik süreci ile ilişkili olan kuruldu. Bizim veri bu nedenle orta kalsifiye içinde sıçan kurban kültürü ile aort kapak kalsifikasyon içinde vitroçalışma için uygun bir model olduğunu gösteriyor. Gerçekten de, bizim laboratuvar son çalışmalardan Ca aort kapak kalsifikasyon Annexin VI zenginleştirme VIC kaynaklı matris veziküller17aracılığıyla teşvik göstermek için bu modeli kullanılan.
Rat kurban ve onların verimli karakterizasyonu kullanmanın yararları rağmen hala bazı sınırlamalar var. İlk olarak, VIC nüfus içinde sıçan vanalar boyutu çok küçük, ve bu nedenle birçok hayvan geniş vitro çalışmalar yeterli cep numaralarını oluşturması için gereklidir. Ancak, bu girişim ön çalışmalar gibi son zamanlarda bizim tarafımızdan18bildirdi ve daha sonra birincil kültürler için istihdam doğrulamak ve bu bulgular genişletmek ölümsüzleştirdi Vana interstisyel hücre hatlarında, tarafından bu sınırlamayı aşmak mümkündür.
Özet olarak, başarılı yalıtım, kültür ve kalsifikasyon birincil sıçan kurban, daha sonra çeşitli biyokimyasal testleri yanı sıra protein analizleri ve RNA analizleri kullanarak değerlendirildi açıklanan yöntemi açıklar. Bu model hangi CAVD vitroaraştırmak güvenilir ve uygun bir sistem sunuyor ve moleküler mekanizmaları yıkıcı bu hastalık için sorumlu soruşturma için değerli bir araç sağlar.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Kullanılan CD31 antikor Dr Karen Tan, Edinburgh Üniversitesi cömert bir hediye etmişti. Bu çalışmada Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC) bir Enstitüsü Stratejik programı hibe (BB/J004316/1; şeklinde fon tarafından desteklenmiştir BBS/E/D/20221657) (VEM ve CF), bir Enstitüsü kariyer yolu bursu BB/F023928/1 (VEM) ve öğrencilik bir BBSRC durumda öğrencilik BB/K011618/1 (LC) yoluyla finansman.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave before use. |
| Spring straight (8 mm blade) | World Precision Instruments | 15905 | Autoclave before use. |
| SuperFine Vannas scissors (5 mm blade, 8 cm) | World Precision Instruments | 14003 | Autoclave before use. |
| Dumont #5 tweezers (11 cm) | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave before use. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
| Foetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Filter before adding to culture medium. |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710049 | |
| Absolute ethanol | Thermo Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in distilled water. |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher Scientific | H1150PB17 | Dilute to 0.6M with distilled water. |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | UN1823 | Dilute to 0.1M with distilled water. |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | 1/250 dilution in antibody dilution buffer. |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | 1/250 dilution in antibody dilution buffer. |
| Superscript II kit | Thermo Fisher Scientific | 18064014 | |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | 18427013 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | P/N58875 | |
| Taq Polymerase kit | Thermo Fisher Scientific | 18038026 | |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) | Thermo Fisher Scientific | AM9863 | Dilute to 1x with distlled water, before use. |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500 | 2% in 1x Tris/Borate/EDTA(TBE). |
| Lysis buffer (RIPA) | Thermo Fisher Scientific | 89900 | |
| T75 flask | Thermo Fisher Scientific | 156472 | |
| T175 flask | Thermo Fisher Scientific | 159920 | |
| qPCR plates | Thermo Fisher Scientific | AB0990 | |
| Rat Msx2 primer | Qiagen | QT01084090 | |
| Rat Alpl primer | Qiagen | QT00190680 | |
| Rat Enpp1 primer | Qiagen | QT00181426 | |
| RNeasy minikit | Qiagen | 74104 | |
| 6-well plates | Sigma | CLS3516 | |
| T25 flask | Sigma | CLS430639 | |
| Monobasic phosphate | Sigma | S5011 | |
| Dibasic phosphate | Sigma | S5136 | |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma | 5030 | Dilute to 0.1% with 0.1M NaOH. |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS. |
| Triton X100 | Sigma | X100 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3059 | |
| Alizarin red S | Sigma | A5533 | Make up to 2% with distilled water, and adjust to pH 4.2. |
| TGFβ-1 primer pair: f: GCTACCATGCCAACTTCTGT r: TGTGTTGGTTGTAGAGGGCA | Sigma | Concentration used: 10 μM | |
| TGFβ-2 primer pair: f: GAAGGCAGAGTTCAGGGTCT r: CGCTGGGTTGGAGATGTTAG | Sigma | Concentration used: 10 μM | |
| Monoclonal Anti-β-Actin−Peroxidase antibody produced in mouse | Sigma | A3854 | 1/50000 dilution in 5% BSA in tris-buffered saline + 0.1% Tween (TBS/T). |
| Mouse anti-vimentin antibody | Sigma | v6389 | 1/900 dilution in antibody dilution buffer (1x phosphate buffered saline (PBS), 1% bovine serum albumin (BSA), 0.3% Triton X-100). |
| Mouse IgG | Sigma | I5381 | Diluted to the same stock concentration as mouse anti-vimentin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer. |
| Rabbit IgG | GeneTex | GTX35035 | Diluted to the same stock concentration as rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer. |
| Rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody | Abcam | ab5694 | 1/200 dilution in antibody dilution buffer. |
| Rabbit anti-CD31 | Abcam | ab28364 | 1/50 dilution in 5% BSA inTBS/T. |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Dako | P0448 | 1/3000 dilution in in 5% BSA in TBS/T. |
| Collagenase II | Worthington | 41512862 | Adjust to 425 U/mL with distilled water, and then filter. |
| SYBR green mastermix | Primerdesign | PrecisionPLUS-MX-SY | |
| Calcium assay kit | Randox | CA590 | |
| DC protein assay kit | Bio-Rad | 5000111 | |
| ECL reagent | GE Healthcare | RPN2109 | |
| Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906837 | |
| Nitrocellulose membrane | GE Healthcare | 10600007 | |
| PCR ladder | Bioline | BIO-33057 | |
| Loading dye for gel electrophoresis | New England Biolabs | B7025S | |
| Syringe filters (0.22 μm) | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Coverslips | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3100 | |
| Hematocytometer | Marienfeld Superior | 640030 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera set up for Alizarin red images: | |||
| Camera | Nikon D800 | ||
| Lens | Nikon AF_s Micro, Nikko 105 mm, 1:2.8 GED | ||
| Dissection forceps 10 cm, curved ends | World Precision Instruments | 15915 | Autoclave before use. |
References
- Dweck, M. R., Boon, N. a, Newby, D. E. Calcific aortic stenosis: a disease of the valve and the myocardium. J Am Coll Cardiol. 60 (19), 1854-1863 (2012).
- Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: Pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111, 3316-3326 (2005).
- Mohler, E. R., Gannon, F., Reynolds, C., Zimmerman, R., Keane, M. G., Kaplan, F. S. Bone formation and inflammation in cardiac valves. Circulation. 103 (11), 1522-1528 (2001).
- Monzack, E. L., Masters, K. S. Can valvular interstitial cells become true osteoblasts? A side-by-side comparison. J Heart Valve Dis. 20 (4), 449-463 (2011).
- Osman, L., Yacoub, M. H., Latif, N., Amrani, M., Chester, A. H. Role of human valve interstitial cells in valve calcification and their response to atorvastatin. Circulation. 114 (Suppl 1), (2006).
- Gu, X., Masters, K. S. Role of the Rho pathway in regulating valvular interstitial cell phenotype and nodule formation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 300 (2), H448-H458 (2011).
- Rodriguez, K. J., Masters, K. S. Regulation of valvular interstitial cell calcification by components of the extracellular matrix. J Biomed Mater Res A. 90 (4), 1043-1053 (2009).
- Rattazzi, M., Iop, L., et al. Clones of interstitial cells from bovine aortic valve exhibit different calcifying potential when exposed to endotoxin and phosphate. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (12), 2165-2172 (2008).
- Zhu, D., Hadoke, P. W. F., et al. Ablation of the androgen receptor from vascular smooth muscle cells demonstrates a role for testosterone in vascular calcification. Sci Rep. 6 (April), 24807 (2016).
- Zhu, D., Mackenzie, N. C. W., Millan, J. L., Farquharson, C., Macrae, V. E. Upregulation of IGF2 expression during vascular calcification. J Mol Endocrinol. 52 (2), 77-85 (2014).
- Latif, N., Quillon, A., et al. Modulation of human valve interstitial cell phenotype and function using a fibroblast growth factor 2 formulation. PLoS ONE. 10 (6), (2015).
- Liu, A. C., Joag, V. R., Gotlieb, A. I. The emerging role of valve interstitial cell phenotypes in regulating heart valve pathobiology. Am J Pathol. 171 (5), 1407-1418 (2007).
- Katwa, L. C., Ratajska, A., et al. Angiotensin converting enzyme and kininase-II-like activities in cultured valvular interstitial cells of the rat heart. Cardiovasc Res. 29 (1), 57-64 (1995).
- Shao, J. S., Cheng, S. L., Pingsterhaus, J. M., Charlton-Kachigian, N., Loewy, A. P., Towler, D. A. Msx2 promotes cardiovascular calcification by activating paracrine Wnt signals. J Clin Invest. 115, 1210-1220 (2005).
- Mackenzie, N. C. W., Zhu, D., Longley, L., Patterson, C. S., Kommareddy, S., MacRae, V. E. MOVAS-1 cell line: a new in vitro model of vascular calcification. Int J Mol Med. 27, 663-668 (2011).
- Kiffer-Moreira, T., Yadav, M. C., et al. Pharmacological inhibition of PHOSPHO1 suppresses vascular smooth muscle cell calcification. J Bone Miner Res. 28, 81-91 (2013).
- Cui, L., Rashdan, N. A., et al. End stage renal disease-induced hypercalcemia may promote aortic valve calcification via Annexin VI enrichment of valve interstitial cell derived-matrix vesicles. J Cell Physio. , (2017).
- Tsang, H., et al. Exploiting novel valve interstitial cell lines to study calcific aortic valve disease. Mol Med Rep. , In press (2017).
