Summary
Det här protokollet beskriver den isolering, kultur och förkalkning av råtta-derived ventil interstitiella celler, en mycket fysiologiska in vitro- modell av förkalkade aortaklaffen sjukdom (CAVD). Utnyttjande av denna råtta modell underlättar CAVD forskning att utforska cellen och molekylära mekanismer som ligger bakom denna komplexa patologisk process.
Abstract
Förkalkade aortaklaffen sjukdom (CAVD) kännetecknas av den progressiv förtjockning av aorta ventilen broschyrer. Det är ett tillstånd som ofta hittas hos äldre och slutstadiet njursjukdom (ESRD), som ofta lider av hyperphosphatemia och hyperkalcemi. För närvarande finns det ingen medicin terapier som kan stoppa dess progression. De mekanismer som ligger bakom denna patologiska processen förblir oklart. Aortaklaffen broschyren består av ett tunt lager av ventilen endotelceller (VECs) på de yttersta ytorna av de aorta kuspar, med ventil interstitiella celler (VICs) inklämt mellan VECs. Användning av en råtta modell gör det möjligt för in vitro- studier av ektopisk förkalkning utifrån i vivo physiopathological serumfosfat (Pi) och kalcium (Ca) nivåer av patienter som lider av hyperphosphatemia och hyperkalcemi. Protokollet beskrivs Detaljer isolering av en ren råtta VIC befolkningen som framgår av uttrycket av VIC markörer: alpha-smooth muscle aktin (α-SMA) vimentin och vävnad tillväxtfaktor beta (TGFβ) 1 och 2, och frånvaron av kluster av differentiering (CD) 31, en VEC markör. Genom att utvidga dessa VICs, kan biokemiska, genetiska och imaging studier utföras för att studera och riva upp den viktiga mediatorer som underbygger CAVD.
Introduction
Friska aortaklaffen består av tre broschyrer, som fördelningen av mekanisk stress under öppna och stänga ventilen fördelas lika. Den ventil bipacksedeln har en definierad struktur av tre distinkta lager: den fibrosa, spongiosa och ventricularis, vilket hus ventil interstitiella celler (VICs) som den dominerande celltypen. Dessa tre lager inklämt mellan två sängar ventil endotelceller (VECs)1.
VICs spelar en avgörande roll i utvecklingen av Calcific Aortic Valve förkalkning (CAVD), den vanligaste ventil hjärtsjukdom i västvärlden. CAVD beskrivs som ett progressivt tillstånd som regleras aktivt valvulär vävnaden och dess omgivande närmiljön. Cellulära förändringar orsaka initialt fibrotiska förtjockning och så småningom en omfattande förkalkning av aortaklaffen flygbladen. Detta sedan leder till betydande aortaklaffen stenos och slutligen lämnade ventricular utflöde obstruktion2, lämnar kirurgisk ventil ersättning som den enda möjliga behandlingen.
Patofysiologin bakom CAVD är komplex, men delar liknande mekanismer till fysiologiska ben mineralisering3. Medan ett antal studier har visat VICs förmåga att genomgå osteogent trans-differentiering och förkalkning4,5, mekanismerna bakom denna process har ännu inte vara helt klarlagd, belyser den viktigt krav för en genomförbar och relevanta in vitro- modell av CAVD.
Tidigare arbete av ett antal laboratorier har framgångsrikt isolerade VICs från svin och nötkreatur modeller och odlade dessa celler under calcifying villkor6,7,8. På grund av den stora storleken på aortaklaffen i dessa modeller, har isolering av celler genom enzymatisk nedbrytning varit mycket effektiva i att generera ren populationer av celler. Dessa modeller kan dock restriktivt på grund av den begränsade tillgången på molekylära verktyg för stora djurarter. Däremot förblir gnagare modeller fördelaktigt på grund av relativt sett lägre kostnader, potential för genetisk manipulation och det omfattande utbud av molekylära verktyg som är lätt tillgängliga. Men är isoleringen av VICs från små djurmodeller inte allmänt anställd, som är en sannolik följd av de svårigheter som uppstått när du arbetar med små vävnadsprover.
Detta detaljerade protokoll rapporterar en omfattande metod för direkta isolering av råtta VICs. Genom noggrann dissektion av ventilen, följt av en serie enzymatiska tumörheterogenitet, kan VICs isoleras och anställd i en mängd olika experimentella tekniker, inklusive cell kultur, förkalkning och gen uttryck. Denna mycket relevanta in vitro- modell av CAVD blir utan tvekan ett viktigt bidrag till att öka vår kunskap om denna patologisk process.
Protocol
Alla djurförsök godkändes av The Roslin Institute's Animal användare kommittén, och djuren bibehölls enligt Home Office (UK) riktlinjer för skötsel och användning av djur. För protokollet beskrivs nedan användes 5 - veckor gammal, manliga Sprague Dawley-råttor.
1. reagens recept
- Förbereda odlingsmedium använder Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) och näringsämne blandning F-12 (DMEM/F12). Lägga till 10% steriliserade Värmeinaktiverade fetalt bovint serum (FBS) och 1% gentamicin.
- Förbereda förkalkning medium med odlingsmedium och 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi.
- Förbereda 1 M kalciumklorid (CaCl2) genom vägning ut 555 mg CaCl2 och upplösning det i 5 mL destillerat vatten för att göra 5 mL 1 M CaCl2. Filtrera lösningen genom ett 0,22 µm spruta filter att sterilisera lösningen.
- Förbereda 1 M natriumfosfat genom vägning ut 710 mg vattenfri dibasisk natriumfosfat (Na2HPO4) och 600 mg vattenfri monobasiskt natriumfosfat (NaH2PO4), upplösning varje separat i 5 mL destillerat vatten. Kombinera 3,870 µL av Na2HPO4 och 1 130 µL av NaH2PO4och filtrera genom ett 0,22 µm spruta filter att sterilisera lösning.
- Förbereda den tvätta buffert innehållande Hank's Balanced Salt lösning (HBSS) och 1% gentamicin.
2. beredning av dissektion huven
- Utföra alla dissektioner i en ventilerad huva, tidigare desinficeras med 70% etanol att garantera sterilitet av prover och reagenser.
- Sterilisera dissektion verktyg i autoklav dem följt av nedsänkning tips av verktygen i en bägare som innehåller 70% etanol före användning.
- Förbereda bägare som innehåller tvättbuffert och blöta verktygen dissektion i tvättbuffert före komma i kontakt med djuret eller vävnader. Hela tiden hålla tvättbuffert på is.
3. utvinning av primära råtta VICs
Obs: För protokollet beskrivs nedan användes 5 - veckor gammal, manliga Sprague Dawley-råttor.
- Slakta råttorna (~ 100 g) av cervikal dislokation i enlighet med UK Home Office riktlinjer.
- För att dissekera ut hjärtat av varje råtta, placera djuret liggande ett glas dissekering styrelsen, och desinficera huden genom sprutning med 70% etanol.
- Gör ett 4 cm snitt i mittlinjen av råtta med hjälp av dissektion sax, att exponera bukhålan, och ta försiktigt bort den bröstkorgen och lungorna, att exponera hjärtat.
- Ta bort hjärtat med ett par skarpa, våren böjd sax och lagra dissekerade hjärtat i is kallt tvättbuffert tills alla brutto dissektioner av råttorna är komplett.
- För att mikro-dissekera varje hjärta, täckt överföring den senare i en petriskål av tvättbuffert. Trimma hjärtmuskeln med en våren rak sax (6 mm blad) lämnas med ett litet område kring aorta ascendens och aortaroten.
- Med samma våren rak sax (6 mm blad), noggrant skära öppna aorta ascendens mot vänster kammare och exponera aorta ventilen broschyrer.
- Överföra öppnade aorta i en fräsch, steril petriskål fylld med HBSS. Dissekera ut aortaklaffen flygbladen, kännetecknas av sin unika 'U' formen vid basen av aorta, med en Vännäs-typ capsulotomi mikro-sax (3 mm blad).
- Lagra alla broschyrer i 1 mL is kallt tvättbuffert, i en 1,5 mL mikrocentrifug rör tills alla dissektioner är komplett.
- När alla broschyrer har skördats, Centrifugera dem 100 x g för 1 minuter vid 4 ° C ta bort tvättbuffert.
- Utföra efterföljande steg i en cell kultur huva för sterilisering. Ta bort VECs, smälta broschyrerna i 100 µL 425 U/mL kollagenas II för 5 min vid 37 ° C. Störa matsmältningen genom att försiktigt upp och ner med en 200 µL pipettspetsen med.
- Centrifugera vid 100 x g under 30 s till pellet flygbladen, och kasta bort supernatanten noggrant. Tvätta två gånger med 500 µL tvättlösning och åter pellet cellerna genom centrifugering vid 100 x g i 30 s.
- För att skörda VICs från flygbladen, smälta med 100 µL av 425 U/mL kollagenas II för 2 h, och sedan släppa VICs genom pipettering försiktigt upp och ner med en 200 µL pipettspetsen.
- Späd kollagenas II i 19 mL odlingsmedium och centrifugera vid 670 x g i 5 min till pellet av VICs och återstående ventilen bipacksedel skräp. Kassera supernatanten och överföra flygblad och VICs till kultur plattor/kolvar med detta (tabell 1).
- Kultur VICs för 5-7 dagar i odlingsmedium, tills konfluens nås vid 37 ° C, i närvaro av 5% (koldioxid) CO2, ändra mediet efter 72 h. För senare användning i in vitro- experiment når passage upp till 5 gånger när confluency 100%.
4. induktion av förkalkning av råtta VICs
Obs: För alla experiment, räkna celler med en hemocytometer.
- Utföra alla primär cell sådd och passaging i steriliserade huvar att förhindra kontaminering. För att förbereda primära råtta VICs för in vitro- förkalkning experiment, utsäde cellerna på en täthet av 150 000 celler per brunn i 6 brunnar. Behålla i odlingsmedium tills ≥ 90% konfluens (vanligtvis 72 h).
- Behandla VICs med förkalkning kontra kontroll medium och inkubera vid 37 ° C, i närvaro av 5% CO2, för en ytterligare 72 h.
- För att studera förkalkade primära råtta VICs för efterföljande nedströms analyser, ta bort förkalkning/kontroll medium och tvätta enskiktslager med tvättbuffert ta bort icke-bundna Ca och Pi joner.
5. råtta VIC karakterisering
- För immunfärgning att övervaka för fenotypiska markörer såsom vimentin och α-SMA, utsäde till råtta VICs vid en densitet av 150 000 celler per brunn i 6 väl-plattor som innehåller täckglas (celler växer på ytan av täckglas), och att växa tills 50% konfluens.
- Sug ut odlingsmediet och fixa de cell enskiktslager med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 10 min innan du tvättar dem 3 gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), för 5 min varje gång.
Försiktighet: PFA är giftigt och måste hanteras försiktigt. - Inkubera i cell enskiktslager med blockering och permeabilisering buffert (1 x PBS, 5% av normala serum från samma art som den sekundära antikroppen, 0,3% Triton x-100) för 1 h i rumstemperatur.
- Inkubera i cell enskiktslager med musen anti-vimentin och kanin anti-α-SMA antikroppar utspätt i antikropp förtunningsbuffert (1% bovint serumalbumin + 0,3% Triton x-100 i PBS) över natten vid 4 ° C, försiktigt skaka på en rocker.
Obs: Negativa kontroller bestod av icke-konjugerad mus-IgG och kanin IgG, använda de samma utspädningarna som testproverna. - Nästa dag, tvätta av de primära antikropparna 3 gånger med PBS, för 5 min varje gång.
- Inkubera i cell enskiktslager med fluorophore-konjugerad sekundära antikroppar för 1 h i rumstemperatur, försiktigt skaka på en rocker.
- Tvätta 3 gånger med PBS och pincettliknande försiktigt ut den coverslips (som innehåller råtta VICs) med ett par pincett och plats på ett täckglas som innehåller 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI). Lämna bilderna ska härda i minst 24 timmar vid 4 ° C innan visualisera med fluorescens Mikroskop.
- För Western blot analys, utsäde råtta VICs med en täthet på 150 000 celler per brunn i 6 väl-plattor och lämna för att växa i odlingsmedium tills 100% konfluenta.
- Använd 8 µg av protein för att köra en Western blot för att mäta uttrycket av CD31 och utesluta VEC kontaminering.
Obs: Ett standard Western blot protokoll följdes som tidigare beskrivits9. - För genen studier, extrahera RNA (ribonukleinsyra) använda ett kommersiella kit som följer tillverkarens riktlinjer.
- Erhålla cDNA använder omvänd Transkription för att mäta målgener uttryck använder polymeras-kedjereaktion (PCR) och realtids-PCR (RT-PCR; kallas även qPCR) med gröna fluorophore upptäckt, använder Gapdh som Referensgenen, som tidigare beskrivs10.
- Använd följande program för PCR-analys: 1 cykel av 94 ° C för 3 min, 30 cykler av 94 ° C för 30 s, 63 ° C för 30 s, 72 ° C för 35 s, och slutligen 1 cykel av 72 ° C i 5 min.
- Använd följande program för qPCR-analys: 1 cykel av 95 ° C i 10 min, 40 cykler av 95 ° C i 15 s, 60 ° C i 1 min och en extra cykel på 95 ° C i 1 min, 55 ° C för 30 s och 95 ° C i 30 s.
- Kör en gelelektrofores för att analysera PCR-produkter använder en 2% agarosgel i Tris/Borat/EDTA (TBE) buffert.
6. råtta VIC förkalkning studier
- För Alizarin Red S och biokemiska förkalkning studier, Följ riktlinjerna för sådd och förkalkning som beskrivs i avsnitt 4.
- Färga de cell enskiktslager med 5% Alizarin Röd S lösning, försiktigt skaka på en shaker, i 20 min. Därefter tvätta 3 gånger med destillerat vatten, för 5 min varje gång. Hämta bilder i varje brunn.
- För att kvantifiera Ca nedfall, Använd en biokemisk Ca assay kit. Läcka ut Ca2 + joner med 0,6 M saltsyra (HCl) för 24 h vid 4 ° C, med försiktig skakning.
- Skörda den supernatanten och mått Ca koncentrationen använder en Ca-test kit (se Tabell för material) efter tillverkarens riktlinjer.
- Beräkna kalcium koncentrationen som en bråkdel av cellulära totalprotein. Denature cellproteiner från de cell enskiktslager med 0,1 M natriumhydroxid (NaOH) + 0,1% natriumsulfat natriumdodecylsulfat (SDS). Bestäm totala protein med ett tvättmedel kompatibel (DC) protein-analys följer tillverkarens riktlinjer.
Representative Results
Syftet med detta protokoll var att beskriva isolering av primära råtta VICs och kultur dem för in vitro- förkalkning experiment. Genom att använda metoden som beskrivs ovan, kan råtta VICs framgångsrikt isolerade och expanderat för att studera mekanismerna som ansvarar för CAVD.
Rat primära VICs lokalisera tillsammans med etablerade VIC markörer:
VIC fenotypen av isolerade celler bekräftades genom immunofluorescens av sondering på VIC markörer: vimentin och α-SMA (rött och grönt, respektive figur 1A), och är överens med tidigare rapporter11,12. De representativa negativa kontrollerna med hjälp av icke-konjugerad mus och kanin IgG visas i figur 1B. Dessutom bekräftades ett uttryck för VIC-tillväxt regulatorn TGFβ-1 och TGFβ-2 med hjälp av PCR-analys (figur 1 c). För att bekräfta att isolerade råtta primära VICs var fri från endotelceller kontaminering, Western blot analys utfördes för att kontrollera att råtta var VICs negativa för endotelceller markören, CD31, med Hundarnas mitral VECs som en positiv kontroll ( Figur 1 d).
Ca och Pi inducerar råtta VIC förkalkning:
Förhöjd systemisk Ca och/eller Pi koncentrationer kör vanligtvis förkalkning av VICs in vitro. För att uppskatta förkalkning potential isolerade råttans VICs, exponerades celler för förhöjda nivåer av Ca och Pi, vilket efterlikna hyperkalcemi och hyperphosphatemia sjukdomstillstånd hos ESRD patienter. Behandling av VICs med 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi inducerad förkalkning, som bestäms av Alizarin Red S färgning för Ca nedfall (figur 2A) och kolorimetrisk bestämning av Ca nivåer efter HCl urlakning (81 fålla; p < 0,05 med Student's t-Test; (Se figur 2B).
Uttryck genförändringar associerade med VIC förkalkning:
Förkalkning av vaskulära celler in vitro- associeras med en distinkt molekylär profil. I den aktuella studien, behandling av VICs med 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi inducerade en betydande ökning av mRNA-uttryck av osteogent markörer: Msh homeobox 2, Msx2 (2,04 faldig förändring; p < 0,01; Figur 3A), alkaliska fosfataser, Alpl (1.49 faldig förändring; p < 0,001; Figur 3B), och phosphoethanolamine/phosphocholine fosfatas, Phospho1 (4,7 faldig förändring; p < 0,01 med envägs ANOVA; Figur 3 c). Men förblev uttrycket av osteogent markör, Runx2och förkalkning hämmare ectonucleotide pyrophasphatase, Enpp1, oförändrade (figur 3D–E).
Figur 1. Uttryck av VIC markörer. (A) immunofluorescens visar dubbel färgning och colocalization av alpha-smooth muscle aktin (α-SMA; grön) och vimentin i ventilen interstitiella celler (VICs). (B) representativ bild av negativa kontroller med hjälp av mus och kanin IgG. Kärnorna är färgade i blått med 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI). Skalstapeln = 50 µm. (C), förekomsten av omvandla tillväxtfaktor beta 1 (TGFβ-1) och TGFβ-2 i VICs (Lanes 1 - 3) Som framgår av PCR-analys. Lane 4 är den vatten-kontrollen. Referensgenen används var Gapdh. (D) Western blot analys visar riklig uttrycket av CD31 i Hundarnas mitralisklaffstenos endotelceller (VECs) jämfört med inget uttryck i VICs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. In vitro förkalkning av råtta VICs. Ca nedfall i VICs behandlas med 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi som bestäms av: (A) fotografi visar Alizarin Red S färgning av hela cellen enskiktslager i brunnen och (B) kolorimetrisk bestämning av Ca nivåer efter HCl urlakning. Student's t-test utfördes för att analysera betydelsen mellan de två grupperna. Resultaten presenteras som menar ± S.E.M. *p < 0.5 jämfört med kontroll; (n = 4).
Figur 3. Uttryck genförändringar associerade med VIC förkalkning. Vik ändra i mRNA uttryck av osteogent markörer (A) Msx2, (B) Alpl, (C) Phospho1, (D) Runx2och (E) Enpp1 i VICs behandlas med 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi för 48 h. mRNA uttryck visas som en fold förändring jämfört med endogent Referensgenen Gadph. Envägs ANOVA använder allmänna linjära modellen innehåller parvisa jämförelser utfördes för att analysera betydelsen mellan flera grupper. Resultaten presenteras som menar ± S.E.M. **p < 0,01; p < 0,001 jämfört med kontroll; (n = 6). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Antal ventilen flygblad | Kultur plattan/kolv |
| 9 till 15 | 1 i 12-well plate |
| 15 till 30 | 1 i 6-well plate |
| 30 + | T25 |
Tabell 1. Allmänna riktlinjer för antal foldrar krävs för inledande sådd.
Discussion
Denna detaljerade protokollet beskriver en praktisk metod för förvärvet av primära råtta VICs, aktivera isolering av dessa celler från råtta hjärtklaffar genom enzymatisk nedbrytning. Vår metod ytterligare stöder och utökar användningen av en tidigare rapporterade råtta in vitro- modell att studera aortaklaffen förkalkning13. Isolering av VICs från aortaklaffen introducerar risken för kontaminering från angränsande VECs. Dock bekräftar vår immunofluorescens uppgifterna att det inledande matsmältning steget är tillräckliga för att undanröja de VECs, återgäldande de isolerade cellerna negativt för endotelceller markören, CD31. Dessutom, α-SMA färgning bekräftar aktiverade fenotypen av VICs, vilket krävs för förkalkning12.
VIC isoleringar har tidigare rapporterats i stort djur modeller6,7,8. Dessa arter är dock begränsade av de begränsa genetiska och molekylära verktyg som finns för nedströms studie, liksom deras begränsad tillgänglighet i laboratorier runt om i världen. Däremot är sådana verktyg väl etablerade i lättillgängliga gnagare och därför förmågan att isolera råtta-derived VICs möjliggör en större kapacitet att experimentell design. Användning av VICs från unga råttor innebär också att cellerna är relativt mer proliferativ än äldre råttor, som därför kräver mindre djur ge fler celler. Möss är lättillgänglig, men på grund av möss med särskilt mindre hjärtan, isolering av primära mus VICs skulle vara mer tidskrävande och betydligt fler djur skulle krävas att isolera samma avkastningen av celler som råtta modell.
En betydande fördel av detta beskrivs tillvägagångssätt är att VICs kan isoleras temporally från vildtyp och transgena råttor, samt råtta modeller av kardiovaskulär sjukdom och ventil skada. Med råtta modell skulle kräva ett större antal djur för storskaliga experiment, därför för att minska användning av djur, primära råtta VICs kan omformas för att producera en cellinje när det har varit väl karakteriserade.
Medan den svåra kliniska CAVD är allmänt erkända, har de underliggande orsakande mekanismerna ännu inte fastställas. Dessutom effektiv medicinering behandlingar som kan förebygga och potentiellt bota aortaklaffen förkalkning inte är tillgängliga på presenterar. VICs kultur under calcifying villkor ger därför en mycket relevant i vitro modell av CAVD. Vi visar att certifikatutfärdaren och Pi förhöjda inducerar i vitro förkalkning av isolerade råtta VICs med en samtidig ökning av uttrycket av osteogent gen markörer Msx2, Alploch Phospho1. Det är allmänt fastställt att dessa markörer är associerade med den patologiska processen vaskulär förkalkning14,15,16. Våra data visar därför att kulturen i råtta VICs i calcifying medium är en lämplig modell att studera aortaklaffen förkalkning i vitro. Färska studier från vårt laboratorium har verkligen utnyttjat denna modell för att demonstrera att Ca främjar aortaklaffen förkalkning genom Annexin VI anrikning av VIC-derived matrix blåsor17.
Trots fördelarna med att använda råtta VICs och deras effektiv karakterisering, det finns fortfarande vissa begränsningar. Först till VIC folkmängd inom råtta ventiler är mycket liten, och därför många djur behövs för att generera tillräckliga cell nummer för omfattande in vitro- studier. Det är dock möjligt att övervinna denna begränsning av företaget förundersökningar i förevigade ventil interstitiell cellinjer, som nyligen rapporterats av oss18, och därefter anställa primära kulturer att kontrollera och förlänga dessa fynd.
Sammanfattningsvis förklarar den beskrivna metoden den framgångsrika isolering, kultur och förkalkning av primära råtta VICs, som därefter kan bedömas med hjälp av olika analyser inklusive biokemiska analyser, samt protein och RNA analyser. Denna modell erbjuder en pålitlig och bekvämt system att undersöka CAVD in vitro-och ger ett värdefullt verktyg för att undersöka de molekylära mekanismerna som ansvarar för denna destruktiva sjukdom.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
CD31 antikropp används var en generös gåva från Dr Karen Tan, University of Edinburgh. Denna studie stöddes av finansiering från bioteknik och biologiska vetenskaper forskning rådet (BBSRC) i form av en Institute strategiska programmet Grant (BB/J004316/1; BBS/E/D/20221657) (VEM och CF), en Institute karriär vägen Fellowship BB/F023928/1 (VEM) och STUDENTTILLVARO finansiering via en BBSRC fall STUDENTTILLVARO BB/K011618/1 (LC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave before use. |
| Spring straight (8 mm blade) | World Precision Instruments | 15905 | Autoclave before use. |
| SuperFine Vannas scissors (5 mm blade, 8 cm) | World Precision Instruments | 14003 | Autoclave before use. |
| Dumont #5 tweezers (11 cm) | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave before use. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
| Foetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Filter before adding to culture medium. |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710049 | |
| Absolute ethanol | Thermo Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in distilled water. |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher Scientific | H1150PB17 | Dilute to 0.6M with distilled water. |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | UN1823 | Dilute to 0.1M with distilled water. |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | 1/250 dilution in antibody dilution buffer. |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | 1/250 dilution in antibody dilution buffer. |
| Superscript II kit | Thermo Fisher Scientific | 18064014 | |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | 18427013 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | P/N58875 | |
| Taq Polymerase kit | Thermo Fisher Scientific | 18038026 | |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) | Thermo Fisher Scientific | AM9863 | Dilute to 1x with distlled water, before use. |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500 | 2% in 1x Tris/Borate/EDTA(TBE). |
| Lysis buffer (RIPA) | Thermo Fisher Scientific | 89900 | |
| T75 flask | Thermo Fisher Scientific | 156472 | |
| T175 flask | Thermo Fisher Scientific | 159920 | |
| qPCR plates | Thermo Fisher Scientific | AB0990 | |
| Rat Msx2 primer | Qiagen | QT01084090 | |
| Rat Alpl primer | Qiagen | QT00190680 | |
| Rat Enpp1 primer | Qiagen | QT00181426 | |
| RNeasy minikit | Qiagen | 74104 | |
| 6-well plates | Sigma | CLS3516 | |
| T25 flask | Sigma | CLS430639 | |
| Monobasic phosphate | Sigma | S5011 | |
| Dibasic phosphate | Sigma | S5136 | |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma | 5030 | Dilute to 0.1% with 0.1M NaOH. |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS. |
| Triton X100 | Sigma | X100 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3059 | |
| Alizarin red S | Sigma | A5533 | Make up to 2% with distilled water, and adjust to pH 4.2. |
| TGFβ-1 primer pair: f: GCTACCATGCCAACTTCTGT r: TGTGTTGGTTGTAGAGGGCA | Sigma | Concentration used: 10 μM | |
| TGFβ-2 primer pair: f: GAAGGCAGAGTTCAGGGTCT r: CGCTGGGTTGGAGATGTTAG | Sigma | Concentration used: 10 μM | |
| Monoclonal Anti-β-Actin−Peroxidase antibody produced in mouse | Sigma | A3854 | 1/50000 dilution in 5% BSA in tris-buffered saline + 0.1% Tween (TBS/T). |
| Mouse anti-vimentin antibody | Sigma | v6389 | 1/900 dilution in antibody dilution buffer (1x phosphate buffered saline (PBS), 1% bovine serum albumin (BSA), 0.3% Triton X-100). |
| Mouse IgG | Sigma | I5381 | Diluted to the same stock concentration as mouse anti-vimentin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer. |
| Rabbit IgG | GeneTex | GTX35035 | Diluted to the same stock concentration as rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer. |
| Rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody | Abcam | ab5694 | 1/200 dilution in antibody dilution buffer. |
| Rabbit anti-CD31 | Abcam | ab28364 | 1/50 dilution in 5% BSA inTBS/T. |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Dako | P0448 | 1/3000 dilution in in 5% BSA in TBS/T. |
| Collagenase II | Worthington | 41512862 | Adjust to 425 U/mL with distilled water, and then filter. |
| SYBR green mastermix | Primerdesign | PrecisionPLUS-MX-SY | |
| Calcium assay kit | Randox | CA590 | |
| DC protein assay kit | Bio-Rad | 5000111 | |
| ECL reagent | GE Healthcare | RPN2109 | |
| Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906837 | |
| Nitrocellulose membrane | GE Healthcare | 10600007 | |
| PCR ladder | Bioline | BIO-33057 | |
| Loading dye for gel electrophoresis | New England Biolabs | B7025S | |
| Syringe filters (0.22 μm) | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Coverslips | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3100 | |
| Hematocytometer | Marienfeld Superior | 640030 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera set up for Alizarin red images: | |||
| Camera | Nikon D800 | ||
| Lens | Nikon AF_s Micro, Nikko 105 mm, 1:2.8 GED | ||
| Dissection forceps 10 cm, curved ends | World Precision Instruments | 15915 | Autoclave before use. |
References
- Dweck, M. R., Boon, N. a, Newby, D. E. Calcific aortic stenosis: a disease of the valve and the myocardium. J Am Coll Cardiol. 60 (19), 1854-1863 (2012).
- Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: Pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111, 3316-3326 (2005).
- Mohler, E. R., Gannon, F., Reynolds, C., Zimmerman, R., Keane, M. G., Kaplan, F. S. Bone formation and inflammation in cardiac valves. Circulation. 103 (11), 1522-1528 (2001).
- Monzack, E. L., Masters, K. S. Can valvular interstitial cells become true osteoblasts? A side-by-side comparison. J Heart Valve Dis. 20 (4), 449-463 (2011).
- Osman, L., Yacoub, M. H., Latif, N., Amrani, M., Chester, A. H. Role of human valve interstitial cells in valve calcification and their response to atorvastatin. Circulation. 114 (Suppl 1), (2006).
- Gu, X., Masters, K. S. Role of the Rho pathway in regulating valvular interstitial cell phenotype and nodule formation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 300 (2), H448-H458 (2011).
- Rodriguez, K. J., Masters, K. S. Regulation of valvular interstitial cell calcification by components of the extracellular matrix. J Biomed Mater Res A. 90 (4), 1043-1053 (2009).
- Rattazzi, M., Iop, L., et al. Clones of interstitial cells from bovine aortic valve exhibit different calcifying potential when exposed to endotoxin and phosphate. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (12), 2165-2172 (2008).
- Zhu, D., Hadoke, P. W. F., et al. Ablation of the androgen receptor from vascular smooth muscle cells demonstrates a role for testosterone in vascular calcification. Sci Rep. 6 (April), 24807 (2016).
- Zhu, D., Mackenzie, N. C. W., Millan, J. L., Farquharson, C., Macrae, V. E. Upregulation of IGF2 expression during vascular calcification. J Mol Endocrinol. 52 (2), 77-85 (2014).
- Latif, N., Quillon, A., et al. Modulation of human valve interstitial cell phenotype and function using a fibroblast growth factor 2 formulation. PLoS ONE. 10 (6), (2015).
- Liu, A. C., Joag, V. R., Gotlieb, A. I. The emerging role of valve interstitial cell phenotypes in regulating heart valve pathobiology. Am J Pathol. 171 (5), 1407-1418 (2007).
- Katwa, L. C., Ratajska, A., et al. Angiotensin converting enzyme and kininase-II-like activities in cultured valvular interstitial cells of the rat heart. Cardiovasc Res. 29 (1), 57-64 (1995).
- Shao, J. S., Cheng, S. L., Pingsterhaus, J. M., Charlton-Kachigian, N., Loewy, A. P., Towler, D. A. Msx2 promotes cardiovascular calcification by activating paracrine Wnt signals. J Clin Invest. 115, 1210-1220 (2005).
- Mackenzie, N. C. W., Zhu, D., Longley, L., Patterson, C. S., Kommareddy, S., MacRae, V. E. MOVAS-1 cell line: a new in vitro model of vascular calcification. Int J Mol Med. 27, 663-668 (2011).
- Kiffer-Moreira, T., Yadav, M. C., et al. Pharmacological inhibition of PHOSPHO1 suppresses vascular smooth muscle cell calcification. J Bone Miner Res. 28, 81-91 (2013).
- Cui, L., Rashdan, N. A., et al. End stage renal disease-induced hypercalcemia may promote aortic valve calcification via Annexin VI enrichment of valve interstitial cell derived-matrix vesicles. J Cell Physio. , (2017).
- Tsang, H., et al. Exploiting novel valve interstitial cell lines to study calcific aortic valve disease. Mol Med Rep. , In press (2017).
