Summary
Denne protokol beskriver isolation, kultur og forkalkning af rotte-afledte ventil interstitielle celler, en yderst fysiologiske i vitro model af forkalkede aortaklappen sygdom (CAVD). Udnyttelse af denne rotte model letter CAVD forskning i udforskning af celle og molekylære mekanismer, der ligger til grund for denne komplekse patologiske proces.
Abstract
Forkalkede aortaklappen sygdom (CAVD) er karakteriseret ved den gradvise fortykkelse af aorta ventilen foldere. Det er en tilstand, der ofte findes i ældre og slutstadiet nyresygdom (ESRD) patienter, der ofte lider af hyperphosphatemia og hypercalcæmi. I øjeblikket er der ingen medicin behandlingsformer, der kan stoppe sin progression. De mekanismer, der ligger til grund for denne patologiske proces forbliver uklart. Aortaklappen indlægsseddel er sammensat af et tyndt lag af ventil endotelceller (VECs) på den ydre overflade af aorta cusps med ventil interstitielle celler (VIC'erne) klemt inde mellem VECs. Brug af en rotte model gør det muligt for in vitro- undersøgelse af ektopisk kalcifikation baseret på i vivo physiopathological serum fosfat (Pi) og calcium (Ca) niveauer af patienter, der lider af hyperphosphatemia og hypercalcæmi. Den beskrevne protokol detaljer isolation af en ren rotte VIC befolkning som vist ved ekspression af VIC markører: alpha-glat muskel aktin (α-SMA) vimentin og væv vækst faktor beta (TGFβ) 1 og 2, og fraværet af klynge af differentiering (CD) 31, en VEC markør. Ved at udvide disse VIC'erne, kan biokemiske, genetiske og billeddiagnostiske undersøgelser udføres for at studere og optrævle de vigtigste mæglere bag CAVD.
Introduction
Sund aortaklappen består af tre foldere, som fordelingen af mekanisk stress under åbning og lukning af ventilen fordeles ligeligt. Ventilen indlægsseddel har en defineret struktur af tre adskilte lag: fibrosa, spongiosa og ventricularis, hvilket hus ventil interstitielle celler (VIC'erne) som den dominerende celletype. Disse tre lag er klemt inde mellem to senge af ventil endotelceller (VECs)1.
VIC'erne spiller en afgørende rolle i udviklingen af forkalkede aorta ventil forkalkning (CAVD), den mest almindelige hjertesygdomme ventil i den vestlige verden. CAVD er beskrevet som en progressiv tilstand, der er aktivt reguleret af de utætte hjerteklapper væv og dens omgivende mikromiljø. Cellulære ændringer forårsage oprindeligt fibrotisk fortykkelse, og til sidst en omfattende forkalkning af aortaklappen foldere. Dette så fører til signifikant aorta ventil stenose og i sidste ende, venstre ventrikel udstrømning obstruktion2, forlader kirurgisk ventil udskiftning som den eneste levedygtige behandling.
CAVD Patofysiologi er kompleks, men deler lignende mekanismer til fysiologiske knogle mineralisering3. Mens en række undersøgelser har påvist VIC'erne evne til at gennemgå osteogenic trans-differentiering og forkalkning4,5, mekanismerne bag denne proces har endnu at blive fuldt belyst, fremhæve den afgørende forudsætning for en realistisk og relevant i vitro model af CAVD.
Tidligere arbejde af en række laboratorier har succesfuldt isolerede VIC'erne fra svin og kvæg modeller og kulturperler disse celler under kalcificerende forhold6,7,8. På grund af den store størrelse af aortaklappen i disse modeller, har isolation af celler gennem enzymatisk fordøjelsen været meget effektiv til at generere ren populationer af celler. Disse modeller kan dog restriktive på grund af de begrænsede mængder af molekylære værktøjer til store dyrearter. Derimod forbliver gnavere modeller fordelagtig på grund af relativt lavere omkostninger, potentiale for genmanipulation og den omfattende vifte af molekylære værktøjer, der er let tilgængelige. Men isolering af VIC'erne fra små dyremodeller er ikke bredt ansat, som er en sandsynlig konsekvens af de vanskeligheder, når du arbejder med små vævsprøver.
Denne detaljerede protokollen rapporterer en omfattende metode til direkte isolering af rotte VIC'erne. Ved omhyggelig dissektion af ventilen, fulgt af en serie af enzymatiske digestions, kan VIC'erne isoleret og ansat i en lang række eksperimentelle teknikker, herunder celle kultur, forkalkning og gen udtryk. Denne yderst relevant i vitro model af CAVD vil uden tvivl gøre et væsentligt bidrag til at øge vores viden om denne patologiske proces.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af The Roslin Institute's Animal brugere, og dyrene var vedligeholdes i overensstemmelse med Home Office (UK) retningslinjer for pleje og brug af dyr. Beskrevet nedenfor-protokollen blev 5 - uger gamle, mandlige Sprague Dawley rotter brugt.
1. reagens opskrifter
- Forberede dyrkningsmediet ved hjælp af Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) og næringsstof blanding F-12 (DMEM/F12). Tilføje 10% steriliseret varme-inaktiverede føtal bovint serum (FBS) og 1% gentamicin.
- Forberede forkalkning medium ved hjælp af næringssubstratet og 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi.
- Forbered 1 M calciumchlorid (CaCl2) ved vejning ud 555 mg CaCl2 og opløse den i 5 mL destilleret vand for at lave 5 mL 1 M CaCl2. Opløsningen filtreres gennem et 0,22 µm sprøjte filter til at sterilisere løsningen.
- Forberede 1 M natrium fosfat ved vejning ud 710 mg vandfri dibasiske natrium fosfat (Na2HPO4) og 600 mg af vandfri monobasic natrium fosfat (NaH2PO4), opløse hver separat i 5 mL destilleret vand. Kombinere 3,870 µL af Na2HPO4 og 1130 µL af NaH2PO4og filter gennem et 0,22 µm sprøjte filter til at sterilisere løsning.
- Forberede den vaske buffer indeholdende Hank's Balanced Salt løsning (HBSS) og 1% gentamicin.
2. forberedelse af dissektion hætte
- Udføre alle dissektioner i en ventileret hætte, tidligere desinficeres med 70% ethanol til at sikre, at steriliteten af prøver og reagenser.
- Sterilisere dissektion værktøjer ved autoklavering dem efterfulgt af nedsænkning tips værktøjer i et bægerglas, der indeholder 70% ethanol før brug.
- Forberede bægre indeholdende vaskebuffer, og suge dissektion værktøjer i wash buffer inden kommer i kontakt med dyr eller væv. Holde vaskebuffer på is på alle tidspunkter.
3. udvinding af primære rotte VIC'erne
Bemærk: For protokollen beskrevet nedenfor, 5 - uger gamle, mandlige Sprague Dawley rotter blev brugt.
- Frasortering rotter (~ 100 g) af cervikal dislokation efter britiske Home Office retningslinjer.
- For at dissekere ud midt i hver rotte, placere dyret liggende på et glas dissektion bord og desinficere huden ved sprøjtning med 70% ethanol.
- Gøre en 4 cm indsnit i midterlinjen af rotten ved hjælp af dissektion saks, at eksponere i bughulen, og fjern forsigtigt brystkassen og lunger, at eksponere hjertet.
- Fjern hjertet med et par skarpe, foråret buet saks, og opbevar dissekeret hjertet i is koldt wash buffer, indtil alle brutto dissektioner af rotter er komplet.
- For at mikro-dissekere hver hjerte, dækket overførsel sidstnævnte i en petriskål i wash buffer. Trim hjertemuskulaturen med en foråret lige saks (6 mm klinge) at være efterladt med et lille område omkring opstigende aorta og aorta-roden.
- Ved hjælp af den samme forår lige saks (6 mm klinge), omhyggeligt skar opstigende aorta til venstre hjertekammer og udsætte aorta ventilen foldere.
- Overføre åbnede aorta i en frisk, steril petriskål fyldt med HBSS. Dissekere ud aorta ventil foldere, kendetegnet ved deres unikke 'U' form i bunden af aorta, med en markriyor-type capsulotomi mikro-saks (3 mm klinge).
- Gemme alle foldere i 1 mL af is kold vaskebuffer i 1,5 mL microcentrifuge rør indtil alle dissektioner er komplet.
- Når alle brochurer er blevet høstet, centrifugeres dem ved 100 x g i 1 min. ved 4 ° C for at fjerne wash buffer.
- Udføre efterfølgende trin i en celle kultur hood at sikre sterilisering. Hvis du vil fjerne VECs, fordøje foldere i 100 µL 425 U/mL collagenase II i 5 min ved 37 ° C. Forstyrre fordøjelsen af forsigtigt pipettering op og ned ved hjælp af en 200 µL pipette tip.
- Der centrifugeres ved 100 x g i 30 s til pellet foldere, og supernatanten omhyggeligt. Vaskes to gange med 500 µL wash buffer og re sammenpresse cellerne ved centrifugering ved 100 x g i 30 s.
- For at høste VIC'erne fra foldere, fordøje med 100 µL af 425 U/mL collagenase II for 2 h og derefter slippe VIC'erne af forsigtigt pipettering op og ned ved hjælp af en 200 µL pipette tip.
- Fortynd collagenase II i 19 mL af næringssubstratet og centrifugeres ved 670 x g i 5 min at sammenpresse VIC'erne og resterende ventilen indlægsseddel debris. Kassere supernatanten, og overføre foldere og VIC'erne til kultur plader/kolber i overensstemmelse hermed (tabel 1).
- Kultur VIC'erne for 5-7 dage dyrkningsmedium, indtil confluency er nået ved 37 ° C i 5% (kuldioxid) CO2, skiftende medium efter 72 timer. Efterfølgende anvendes i in vitro- eksperimenter når passage op til 5 gange når confluency 100%.
4. induktion af forkalkning af rotte VIC'erne
Bemærk: For alle eksperimenter, tælle celler med en hemocytometer.
- Udføre alle primære celle såning og passaging i steriliseret hætter at forhindre forurening. For at forberede primære rotte VIC'erne til in vitro- eksperimenter med forkalkning, seed celler med en tæthed på 150.000 celler/brønd i 6-godt plader. Opretholde dyrkningsmedium indtil ≥ 90% confluency (typisk 72 h).
- Behandle VIC'erne med forkalkning versus kontrol medium og inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2, for en yderligere 72 h.
- For at studere de forkalkede primære rotte VIC'erne for efterfølgende downstream analyser, fjerne forkalkning/kontrol medium og vaske encellelag med wash buffer til at fjerne ikke-bundet Ca og Pi ioner.
5. rotte VIC karakterisering
- Immunfarvning overvåge for fænotypisk markører, såsom vimentin og α-SMA, frø rotte VIC'erne med en tæthed på 150.000 celler/brønd i 6 well-plader der indeholder dækning underkjoler (celler vil vokse på overfladen af cover podekviste), og lad det vokse indtil 50% confluency.
- Opsug næringssubstratet og fastsætte celle encellelag med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 10 min før vask dem 3 gange med fosfatbufferet saltopløsning (PBS), for 5 min hver gang.
Forsigtig: PFA er giftigt og skal håndteres forsigtigt. - Inkuber celle éncellelag med blokering og permeabilization buffer (1 x PBS, 5% af normal serum fra samme art som den sekundære antistof, 0,3% Triton X-100) i 1 time ved stuetemperatur.
- Inkuber celle encellelag med musen anti-vimentin og kanin anti-α-SMA antistoffer fortyndet i antistof fortynding buffer (1% bovint serumalbumin + 0,3% Triton X-100 i PBS) natten over ved 4 ° C, forsigtigt ryster på en rocker.
Bemærk: Negative Kontroller bestod af ikke-konjugeret mus IgG og kanin IgG, ved hjælp af de samme fortyndinger som de klargjorte prøver. - Den næste dag, vaskes de primære antistoffer 3 gange med PBS, for 5 min hver gang.
- Inkubér monolag celle med fluorophore-konjugeret sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur, forsigtigt ryster på en rocker.
- Vask 3 gange med PBS, og forsigtigt pluk ud af coverslips, (som indeholder rotte VIC'erne) med et par pincet og sted på en coverslip indeholdende 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Forlade dias til at helbrede i mindst 24 timer ved 4 ° C før visualisering med et fluorescens mikroskop.
- Western blot analyse, seed rotte VIC'erne med en tæthed på 150.000 celler/brønd i 6 well-plader og lad det vokse i dyrkningsmediet indtil 100% sammenflydende.
- Bruge 8 µg protein til at køre en vestlige skamplet for at måle udtryk for CD31 og udelukke kontaminering VEC.
Bemærk: En standard vestlige skamplet protokol blev efterfulgt som tidligere beskrevet9. - Gen undersøgelser, udtrække ribonukleinsyre (RNA) ved hjælp af en kommerciel kit efter producentens retningslinjer.
- Få cDNA ved hjælp af reverse transkription for at måle mål gener udtryk ved hjælp af Polymerasekædereaktionen (PCR) og real-time PCR (RT-PCR; også kendt som qPCR) med grønne fluorophore opdagelse, ved hjælp af Gapdh som reference-genet som tidligere beskrevet10.
- Brug følgende program for PCR analyse: 1 cyklus af 94 ° C i 3 min, 30 cyklusser af 94 ° C til 30 s, 63 ° C i 30 s, 72 ° C i 35 s, og endelig 1 cyklus ved 72 ° C i 5 min.
- Brug følgende program for qPCR analyse: 1 cyklus på 95 ° C i 10 min, 40 cyklusser af 95 ° C i 15 s, 60 ° C i 1 min og en yderligere cyklus på 95 ° C i 1 minut, 55 ° C til 30 s og 95 ° C til 30 s.
- Køre en gelelektroforese for at analysere PCR produkter ved hjælp af en 2%-agarosegel i Borat-Tris-EDTA (TBE) buffer.
6. rotte VIC forkalkning undersøgelser
- For Alizarin rød S og biokemiske forkalkning undersøgelser, Følg venligst såning og forkalkning retningslinjer beskrevet i afsnit 4.
- Pletten celle encellelag med 5% Alizarin rød S løsning, blidt vuggende på en shaker, i 20 min. Efterfølgende vask 3 gange med destilleret vand i 5 min. hver gang. Erhverve billeder i hver brønd.
- For at kvantificere Ca deposition, bruge en biokemiske Ca assay kit. Udvaskes Ca2 + ioner med 0,6 M saltsyre (HCl) i 24 timer ved 4 ° C, med blid agitation.
- Høste supernatanten og måle Ca koncentrationen ved hjælp af en Ca assay kit (Se Tabel af materialer) efter producentens retningslinjer.
- Beregne calcium koncentration som en brøkdel af samlede cellulære proteiner. Denaturere cellulære proteiner fra celle encellelag med 0,1 M natriumhydroxid (NaOH) + 0,1% sodium dodecyl sulphate (SDS). Bestemme den samlede proteinkoncentration ved hjælp af et vaskemiddel kompatibel (DC) protein assay efter producentens retningslinjer.
Representative Results
Formålet med denne protokol var at beskrive isolering af primære rotte VIC'erne og kultur dem til in vitro- eksperimenter med forkalkning. Ved at ansætte den ovenfor beskrevne metode, kan rotte VIC'erne med held isoleret og udvidet for studier af de mekanismer, der er ansvarlige for CAVD.
Rotte primære VIC'erne lokalisere samarbejde med etablerede VIC markører:
VIC Fænotypen af isolerede celler blev bekræftet gennem immunfluorescens af sondering for VIC markører: vimentin og α-SMA (rød og grøn, henholdsvis figur 1A), og er enig med tidligere rapporter11,12. De repræsentative negative kontroller ved hjælp af ikke-konjugeret mus og kanin IgG er vist i figur 1B. Derudover blev udtryk af VIC-vækst regulator TGFβ-1 og TGFβ-2 bekræftet ved hjælp af PCR analyse (figur 1 c). For at bekræfte, at den isolerede rotte primære VIC'erne var gratis fra endotel forurening, Western blot analyse blev udført for at kontrollere rotten var VIC'erne negativ i endothelial celle markør, CD31, ved hjælp af canine mitral VECs som positiv kontrol ( Figur 1 d).
Ca og Pi fremkalde rotte VIC forkalkning:
Forhøjede systemisk Ca og/eller Pi koncentrationer drive typisk forkalkning af VIC'erne in vitro. For at forstå forkalkning potentialet i den isolerede rotte VIC'erne, blev cellerne udsat til forhøjede niveauer af Ca og Pi, som efterligner patologiske hypercalcæmi og hyperphosphatemia tilstande i ESRD patienter. Behandling af VIC'erne med 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi induceret forkalkning, som bestemmes af Alizarin rød S farvning for Ca deposition (figur 2A) og kolorimetriske bestemmelse af Ca niveauer efter HCl udvaskning (81 fold; p < 0,05 ved hjælp af Student's t-Test; Figur 2B).
Gen Expression ændringer forbundet med VIC forkalkning:
Forkalkning af vaskulære celler in vitro- er forbundet med en særskilt molekylære profil. I den foreliggende undersøgelse, behandling af VIC'erne med 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi induceret en betydelig stigning i mRNA udtryk for de osteogenic markører: Msh HOXD 2, Msx2 (2.04 fold ændring; p < 0,01; Figur 3A), alkalisk fosfatase, Alpl (1,49 fold ændring; p < 0,001; Figur 3B), og phosphoethanolamine/phosphocholine fosfatase, Phospho1 (4,7 fold ændring; p < 0,01 ved hjælp af en-vejs ANOVA; Figur 3 c). Dog forblev udtryk for den osteogenic markør, Runx2og forkalkning hæmmer ectonucleotide pyrophasphatase, Enpp1, uændret (figur 3D-E).
Figur 1. Udtryk for VIC markører. (A) immunofluorescens viser dobbelt farvning og colocalization af alpha-glat muskel aktin (α-SMA; grøn) og vimentin i ventil interstitielle celler (VIC'erne). (B) repræsentativt billede af negative kontroller ved hjælp af mus og kanin IgG. Kerner er bejdset i blue ved hjælp af 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Skalalinjen = 50 µm. (C) tilstedeværelsen af omdanne vækst faktor beta 1 (TGFβ-1) og TGFβ-2 i VIC'erne (baner 1 - 3) Som det fremgår af PCR analyse. Lane 4 er vandkontrol. Reference gen anvendes var Gapdh. (D) Western blot analyse viser den rigelige udtryk for CD31 i canine mitralklap endotelceller (VECs) i forhold til ingen udtryk i VIC'erne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. In vitro forkalkning af rotte VIC'erne. Ca deposition i VIC'erne behandlet med 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi som bestemt ved: (A) fotografi viser Alizarin rød S farvning af hele cellen encellelag brønd, og (B) kolorimetriske bestemmelse af Ca niveauer efter HCl udvaskning. Student's t-test blev udført for at analysere betydning mellem to datagrupperne. Resultaterne er præsenteret som betyder ± S.E.M. *p < 0.5 sammenlignet med kontrol; (n = 4).
Figur 3. Gen expression ændringer forbundet med VIC forkalkning. Fold ændre i mRNA udtryk af osteogenic markører (A) Msx2, (B) Alpl, (C) Phospho1, (D) Runx2og (E) Enpp1 i VIC'erne behandlet med 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi for 48 h. mRNA udtryk er vist som en fold ændring i forhold til det endogene reference gen Gadph. En-vejs ANOVA ved hjælp af generelle lineære model indarbejde parvise sammenligninger blev udført for at analysere betydningen mellem flere grupper. Resultaterne er præsenteret som betyder ± S.E.M. **p < 0,01; p < 0,001 sammenlignet med kontrol; (n = 6). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Antallet af ventilen foldere | Kultur plade/kolbe |
| 9-15 | 1 godt i 12-godt plade |
| 15 til 30 | 1 godt i 6-godt plade |
| 30 + | T25 |
Bord 1. Generelle retningslinjer for antallet af foldere kræves for indledende seeding.
Discussion
Denne detaljerede protokol beskriver en praktisk metode til erhvervelse af primære rotte VIC'erne, aktivering af isolation af disse celler fra rotte hjerteklapper gennem enzymatisk nedbrydning. Vores metode yderligere understøtter og udvider anvendelsen af en tidligere rapporteret rotte i vitro model til at studere aortaklappen forkalkning13. Isolering af VIC'erne fra aortaklappen introducerer potentialet for forurening fra nærliggende VECs. Men vores immunofluorescens data bekræfter, at det oprindelige fordøjelse skridt er tilstrækkelige til at fjerne VECs, gengivelse de isolerede celler negative i endothelial celle markør, CD31. Desuden bekræfter α-SMA farvning den aktiverede Fænotypen af VIC'erne, hvilke er krævede nemlig forkalkning12.
VIC isolering er tidligere blevet rapporteret i store dyre modeller6,7,8. Men disse arter er begrænset af de begrænsede genetiske og molekylære værktøjer tilgængelige for downstream undersøgelse, samt deres begrænset tilgængelighed i laboratorier rundt om i verden. Derimod er sådanne værktøjer veletableret i let tilgængelige gnavere og derfor evnen til at isolere rotte-afledte VIC'erne muliggør en større eksperimentelle design kapacitet. Brug af VIC'erne fra unge rotter betyder også, at cellerne er relativt mere proliferativ end ældre rotter, som derfor kræver mindre dyr at give flere celler. Selv om mus er lettilgængelig, men på grund af mus har især mindre hjerter, isolation af primære mus VIC'erne ville være mere tidskrævende og betydeligt flere dyr ville være forpligtet til at isolere det samme udbytte af celler som rotte model.
En væsentlig fordel ved denne beskrevne fremgangsmåde er at VIC'erne kan isoleres tidsligt fra vildtype og transgene rotter samt rotte modeller af hjerte-kar-sygdom og ventil skade. Ved hjælp af rotte model ville kræve et større antal dyr for storstilet forsøg, således for at reducere brug af dyr, primære rotte VIC'erne kan blive omdannet til at producere en cellelinje, når det har været godt præget.
Mens de alvorlige kliniske konsekvenser af CAVD er almindelig anerkendt, har af underliggende udløsende mekanismer endnu skal fastlægges. Derudover effektiv medicin behandlingsformer, der kan forebygge og potentielt helbrede aortaklappen forkalkning ikke er tilgængelige på nuværende. VIC'erne kultur under kalcificerende forhold giver derfor en yderst relevant i vitro model af CAVD. Vi viser, at forhøjede Ca og Pi niveauer fremkalde i vitro forkalkning af isolerede rotte VIC'erne med en ledsagende stigning i udtryk af osteogenic gen markører Msx2, Alplog Phospho1. Det er bredt fastslået, at disse markører er forbundet med den patologiske proces af vaskulære forkalkning14,15,16. Vores data viser derfor, at kulturen i rotte VIC'erne i kalcificerende medium er en passende model til at studere aortaklappen forkalkning in vitro. Ja, de seneste undersøgelser fra vores laboratorium har udnyttet denne model til at påvise, at Ca fremmer aortaklappen forkalkning gennem Annexin VI berigelse af VIC-afledte matrix vesikler17.
Trods fordelene ved at bruge rotte VIC'erne og deres effektiv karakterisering, eksisterer nogle begrænsninger stadig. Først, VIC indbyggertal i rotte ventiler er meget små, og derfor mange dyr er nødvendige for at generere tilstrækkelig celle tal for omfattende in vitro- undersøgelser. Det er dog muligt at overvinde denne begrænsning af virksomhed forundersøgelser i udødeliggjort ventil interstitiel cellelinjer, som for nylig rapporteret af os18, og efterfølgende ansættelse primære kulturer til at kontrollere og udvide disse resultater.
I Resumé forklarer metoden beskrevet vellykket isolering, kultur og forkalkning af primære rotte VIC'erne, som efterfølgende kan vurderes ved hjælp af en række analyser herunder biokemiske assays, såvel som proteiner og RNA analyser. Denne model tilbyder en pålidelig og praktisk system til at undersøge CAVD i in vitro, og giver et værdifuldt redskab for at undersøge de molekylære mekanismer, der er ansvarlige for denne ødelæggende sygdom.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
CD31 antistof anvendes var en generøs gave fra Dr. Karen Tan, University of Edinburgh. Denne undersøgelse blev støttet af midler fra Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) i form af et institut strategiske program tilskud (BB/J004316/1; BBS/E/D/20221657) (VEM og CF), et institut karriere sti Fellowship BB/F023928/1 (VEM), og studentship finansiering via en BBSRC sag Studentship BB/K011618/1 (LC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave before use. |
| Spring straight (8 mm blade) | World Precision Instruments | 15905 | Autoclave before use. |
| SuperFine Vannas scissors (5 mm blade, 8 cm) | World Precision Instruments | 14003 | Autoclave before use. |
| Dumont #5 tweezers (11 cm) | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave before use. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
| Foetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Filter before adding to culture medium. |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710049 | |
| Absolute ethanol | Thermo Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in distilled water. |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher Scientific | H1150PB17 | Dilute to 0.6M with distilled water. |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | UN1823 | Dilute to 0.1M with distilled water. |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | 1/250 dilution in antibody dilution buffer. |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | 1/250 dilution in antibody dilution buffer. |
| Superscript II kit | Thermo Fisher Scientific | 18064014 | |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | 18427013 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | P/N58875 | |
| Taq Polymerase kit | Thermo Fisher Scientific | 18038026 | |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) | Thermo Fisher Scientific | AM9863 | Dilute to 1x with distlled water, before use. |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500 | 2% in 1x Tris/Borate/EDTA(TBE). |
| Lysis buffer (RIPA) | Thermo Fisher Scientific | 89900 | |
| T75 flask | Thermo Fisher Scientific | 156472 | |
| T175 flask | Thermo Fisher Scientific | 159920 | |
| qPCR plates | Thermo Fisher Scientific | AB0990 | |
| Rat Msx2 primer | Qiagen | QT01084090 | |
| Rat Alpl primer | Qiagen | QT00190680 | |
| Rat Enpp1 primer | Qiagen | QT00181426 | |
| RNeasy minikit | Qiagen | 74104 | |
| 6-well plates | Sigma | CLS3516 | |
| T25 flask | Sigma | CLS430639 | |
| Monobasic phosphate | Sigma | S5011 | |
| Dibasic phosphate | Sigma | S5136 | |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma | 5030 | Dilute to 0.1% with 0.1M NaOH. |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS. |
| Triton X100 | Sigma | X100 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3059 | |
| Alizarin red S | Sigma | A5533 | Make up to 2% with distilled water, and adjust to pH 4.2. |
| TGFβ-1 primer pair: f: GCTACCATGCCAACTTCTGT r: TGTGTTGGTTGTAGAGGGCA | Sigma | Concentration used: 10 μM | |
| TGFβ-2 primer pair: f: GAAGGCAGAGTTCAGGGTCT r: CGCTGGGTTGGAGATGTTAG | Sigma | Concentration used: 10 μM | |
| Monoclonal Anti-β-Actin−Peroxidase antibody produced in mouse | Sigma | A3854 | 1/50000 dilution in 5% BSA in tris-buffered saline + 0.1% Tween (TBS/T). |
| Mouse anti-vimentin antibody | Sigma | v6389 | 1/900 dilution in antibody dilution buffer (1x phosphate buffered saline (PBS), 1% bovine serum albumin (BSA), 0.3% Triton X-100). |
| Mouse IgG | Sigma | I5381 | Diluted to the same stock concentration as mouse anti-vimentin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer. |
| Rabbit IgG | GeneTex | GTX35035 | Diluted to the same stock concentration as rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer. |
| Rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody | Abcam | ab5694 | 1/200 dilution in antibody dilution buffer. |
| Rabbit anti-CD31 | Abcam | ab28364 | 1/50 dilution in 5% BSA inTBS/T. |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Dako | P0448 | 1/3000 dilution in in 5% BSA in TBS/T. |
| Collagenase II | Worthington | 41512862 | Adjust to 425 U/mL with distilled water, and then filter. |
| SYBR green mastermix | Primerdesign | PrecisionPLUS-MX-SY | |
| Calcium assay kit | Randox | CA590 | |
| DC protein assay kit | Bio-Rad | 5000111 | |
| ECL reagent | GE Healthcare | RPN2109 | |
| Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906837 | |
| Nitrocellulose membrane | GE Healthcare | 10600007 | |
| PCR ladder | Bioline | BIO-33057 | |
| Loading dye for gel electrophoresis | New England Biolabs | B7025S | |
| Syringe filters (0.22 μm) | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Coverslips | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3100 | |
| Hematocytometer | Marienfeld Superior | 640030 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera set up for Alizarin red images: | |||
| Camera | Nikon D800 | ||
| Lens | Nikon AF_s Micro, Nikko 105 mm, 1:2.8 GED | ||
| Dissection forceps 10 cm, curved ends | World Precision Instruments | 15915 | Autoclave before use. |
References
- Dweck, M. R., Boon, N. a, Newby, D. E. Calcific aortic stenosis: a disease of the valve and the myocardium. J Am Coll Cardiol. 60 (19), 1854-1863 (2012).
- Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: Pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111, 3316-3326 (2005).
- Mohler, E. R., Gannon, F., Reynolds, C., Zimmerman, R., Keane, M. G., Kaplan, F. S. Bone formation and inflammation in cardiac valves. Circulation. 103 (11), 1522-1528 (2001).
- Monzack, E. L., Masters, K. S. Can valvular interstitial cells become true osteoblasts? A side-by-side comparison. J Heart Valve Dis. 20 (4), 449-463 (2011).
- Osman, L., Yacoub, M. H., Latif, N., Amrani, M., Chester, A. H. Role of human valve interstitial cells in valve calcification and their response to atorvastatin. Circulation. 114 (Suppl 1), (2006).
- Gu, X., Masters, K. S. Role of the Rho pathway in regulating valvular interstitial cell phenotype and nodule formation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 300 (2), H448-H458 (2011).
- Rodriguez, K. J., Masters, K. S. Regulation of valvular interstitial cell calcification by components of the extracellular matrix. J Biomed Mater Res A. 90 (4), 1043-1053 (2009).
- Rattazzi, M., Iop, L., et al. Clones of interstitial cells from bovine aortic valve exhibit different calcifying potential when exposed to endotoxin and phosphate. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (12), 2165-2172 (2008).
- Zhu, D., Hadoke, P. W. F., et al. Ablation of the androgen receptor from vascular smooth muscle cells demonstrates a role for testosterone in vascular calcification. Sci Rep. 6 (April), 24807 (2016).
- Zhu, D., Mackenzie, N. C. W., Millan, J. L., Farquharson, C., Macrae, V. E. Upregulation of IGF2 expression during vascular calcification. J Mol Endocrinol. 52 (2), 77-85 (2014).
- Latif, N., Quillon, A., et al. Modulation of human valve interstitial cell phenotype and function using a fibroblast growth factor 2 formulation. PLoS ONE. 10 (6), (2015).
- Liu, A. C., Joag, V. R., Gotlieb, A. I. The emerging role of valve interstitial cell phenotypes in regulating heart valve pathobiology. Am J Pathol. 171 (5), 1407-1418 (2007).
- Katwa, L. C., Ratajska, A., et al. Angiotensin converting enzyme and kininase-II-like activities in cultured valvular interstitial cells of the rat heart. Cardiovasc Res. 29 (1), 57-64 (1995).
- Shao, J. S., Cheng, S. L., Pingsterhaus, J. M., Charlton-Kachigian, N., Loewy, A. P., Towler, D. A. Msx2 promotes cardiovascular calcification by activating paracrine Wnt signals. J Clin Invest. 115, 1210-1220 (2005).
- Mackenzie, N. C. W., Zhu, D., Longley, L., Patterson, C. S., Kommareddy, S., MacRae, V. E. MOVAS-1 cell line: a new in vitro model of vascular calcification. Int J Mol Med. 27, 663-668 (2011).
- Kiffer-Moreira, T., Yadav, M. C., et al. Pharmacological inhibition of PHOSPHO1 suppresses vascular smooth muscle cell calcification. J Bone Miner Res. 28, 81-91 (2013).
- Cui, L., Rashdan, N. A., et al. End stage renal disease-induced hypercalcemia may promote aortic valve calcification via Annexin VI enrichment of valve interstitial cell derived-matrix vesicles. J Cell Physio. , (2017).
- Tsang, H., et al. Exploiting novel valve interstitial cell lines to study calcific aortic valve disease. Mol Med Rep. , In press (2017).
