Summary
Este protocolo descreve o isolamento, cultura e calcificação de células intersticiais do rato-derivado da válvula, um modelo altamente fisiológica em vitro da doença valvar aórtica calcífica (CAVD). Exploração deste modelo de rato facilita a pesquisa CAVD em explorar a célula e os mecanismos moleculares que estão subjacentes a este complexo processo patológico.
Abstract
Valvopatia aórtica calcífica (CAVD) é caracterizada por espessamento progressivo dos folhetos da válvula aórtica. É uma condição frequentemente encontrada nos pacientes idosos e fase final da doença renal (DRT), que geralmente sofrem de hiperfosfatemia e hipercalcemia. Presentemente, existem sem terapias de medicação que podem parar sua progressão. Os mecanismos subjacentes a esse processo patológico permanecem obscuros. Folheto da válvula aórtica é composto por uma fina camada de células endoteliais de válvula (VECs) nas superfícies exteriores das cúspides da aorta, com células intersticiais de válvula (VICs) imprensadas entre os VECs. O uso de um modelo do rato permite o estudo em vitro de calcificação ectópica baseada na vivo soro fisiopatológicas fosfato (Pi) e os níveis de cálcio (Ca) dos pacientes que sofrem de hiperfosfatemia e hipercalcemia. O protocolo descrito detalha o isolamento de um rato puro população VIC, como mostrado pela expressão de marcadores de VIC: músculo liso-alfa actina (α-SMA) vimentina e tecido fator de crescimento beta (TGFβ) 1 e 2 e a ausência de cluster de diferenciação (CD) 31, um VEC marcador. Expandindo as vítimas, estudos bioquímicos, genéticos e de imagem podem ser realizados para estudar e desvendar os mediadores chaves subjacente CAVD.
Introduction
A válvula aórtica saudável é composta de três folhetos, para que a distribuição do esforço mecânico durante a abertura e fechamento da válvula é repartida igualmente. Folheto da válvula tem uma estrutura definida de três camadas distintas: a fibro, spongiosa e ventricularis, que casa válvula células intersticiais (VICs) como o tipo de célula predominante. Essas três camadas são imprensadas entre duas camas de válvula células endoteliais (VECs)1.
VICs desempenham um papel fundamental na progressão de calcificar aórtica válvula calcificação (CAVD), a doença valvular cardíaca mais comum no mundo ocidental. CAVD é descrito como uma condição progressiva que ativamente regulada o tecido valvular e seu microambiente circundante. As mudanças celulares inicialmente causam espessamento fibrótico e eventualmente uma extensa calcificação dos folhetos da válvula aórtica. Isto então leva à estenose da valva aórtica significativa e, finalmente, deixou saída ventricular obstrução2, deixando a substituição cirúrgica da válvula como o tratamento só viável.
A fisiopatologia da CAVD é complexa, mas compartilha mecanismos semelhantes ao de mineralização óssea fisiológica3. Ao mesmo tempo, vários estudos têm demonstrado a capacidade de VICs submeter-se a trans-diferenciação osteogênica e calcificação4,5, os mecanismos subjacentes a esse processo ainda precisa ser totalmente elucidado, destacando o exigência crucial para um modelo viável e relevante em vitro de CAVD.
Trabalhos anteriores por um número de laboratórios com sucesso isolado vítimas de modelos de suínos e bovinos e culta essas células sob condições6,7,8de calcificação. Devido ao grande tamanho da válvula aórtica nesses modelos, isolamento de células através da digestão enzimática tem sido altamente eficaz na geração de populações puras de células. No entanto, estes modelos podem ser restritivos devido à limitada disponibilidade de ferramentas moleculares para espécies animais grandes. Em contraste, modelos de roedores permanecem vantajosos devido a custos relativamente mais baixos, potencial de manipulação genética e a ampla gama de ferramentas moleculares que estão prontamente disponíveis. No entanto, o isolamento das vítimas de pequenos modelos animais não é amplamente empregado, que é uma consequência provável das dificuldades encontradas ao trabalhar com amostras pequenas.
Este protocolo detalhado informa um método abrangente para o isolamento direto do rato vítimas. Por dissecção cuidadosa da válvula, seguida por uma série de digestões enzimáticas, vítimas podem ser isoladas e empregadas em uma grande variedade de técnicas experimentais, incluindo a expressão de gene, calcificação e cultura de células. Este modelo altamente relevantes em vitro de CAVD fará, sem dúvida, um contributo essencial para aumentar o nosso conhecimento deste processo patológico.
Protocol
Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de usuários do Instituto Roslin o Animal, e os animais foram mantidos em conformidade com diretrizes do Home Office (Reino Unido) para o cuidado e o uso de animais. Para o protocolo descrito abaixo, foram usados ratos Sprague Dawley de 5 - semana de idade, do sexo masculinos.
1. reagente receitas
- Prepare o meio de cultura usando de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) e mistura de nutrientes F-12 (DMEM/F12). Adicione 10% esterilizado inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS) e gentamicina 1%.
- Prepare o meio de calcificação usando meio de cultura e 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi.
- Prepare-se 1 M de cloreto de cálcio (CaCl2) pesando fora 555 mg de CaCl2 e dissolvendo-o em 5 mL de água destilada para completar 5 mL de 1 M CaCl2. Filtre a solução através de um filtro de seringa 0,22 µm para esterilizar a solução.
- Prepare-se 1 M de fosfato de sódio por pesagem 710 mg anidro fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4) e 600 mg de fosfato de sódio monobásico anidro (NaH2PO4), dissolvendo cada um separadamente em 5 mL de água destilada água. Combine 3.870 µ l de Na2HPO4 e 1.130 µ l de NaH2PO4e filtro através de um filtro de seringa 0,22 µm para esterilizar a solução.
- Prepare o tampão de lavagem contendo gentamicina solução sal equilibrado (HBSS) e 1% de Hank.
2. preparação do exaustor de dissecação
- Realize todas as dissecções em uma campânula ventilada, previamente desinfectada com álcool 70% para garantir a esterilidade das amostras e reagentes.
- Esterilize instrumentos de dissecação por autoclave-los seguidos por imersão as dicas das ferramentas em um béquer contendo antes de etanol 70% de usar.
- Preparar o béquer contendo tampão de lavagem e mergulhe os instrumentos de dissecação em tampão de lavagem antes de entrar em contacto com o animal ou tecidos. Mantenha o tampão de lavagem no gelo em todos os momentos.
3. extração de rato primária das vítimas
Nota: Para o protocolo descrito abaixo, foram usados ratos Sprague Dawley de 5 - semana de idade, do sexo masculinos.
- Abater os ratos (~ 100 g) por deslocamento cervical em conformidade com diretrizes de UK Home Office.
- Para dissecar o coração de cada rato, coloque o animal em decúbito dorsal em um tabuleiro de dissecação de vidro e desinfectar a pele por pulverização com etanol a 70%.
- Faça uma incisão de 4 cm na linha média do rato com o auxílio de tesouras de dissecação, para expor a cavidade abdominal e remova cuidadosamente a caixa torácica e os pulmões, para expor o coração.
- Remover o coração com um par de afiada, tesoura curva de primavera e armazenar o coração dissecado em tampão de lavagem frio de gelo até que todas as dissecções brutas dos ratos estão completas.
- Para microdissecar cada coração, transferência, este último em um prato de Petri coberto de tampão de lavagem. Guarnição do músculo cardíaco com uma tesoura reta Primavera (lâmina de 6 mm) para ficar com uma pequena área em torno da aorta ascendente e a raiz da aorta.
- Usando a mesma mola tesoura reta (lâmina de 6 mm), cuidadosamente aberto a aorta ascendente para o ventrículo esquerdo e expor os folhetos da válvula aórtica.
- Transferência da aorta aberta em uma placa de Petri estéril, fresco cheio de HBSS. Disse o folhetos da válvula aórtica, marcado pela sua única forma de 'U' na base da aorta, com um par de capsulotomia Vannas-tipo micro tesoura (lâmina de 3 mm).
- Armazene todos os folhetos em 1 mL de tampão de lavagem frio do gelo, em um tubo de microcentrifuga de 1,5 mL até todas as dissecções são completas.
- Uma vez que todos os folhetos foram colhidos, centrifugá-los a 100 x g por 1 min a 4 ° C para remover o tampão de lavagem.
- Execute as etapas subsequentes em uma capa de cultura celular para garantir a esterilização. Para remover os VECs, digerir os folhetos em 100 µ l 425 U/mL colagenase II por 5 min a 37 ° C. Perturbar a digestão pipetando delicadamente acima e para baixo usando a ponta da pipeta 200 µ l.
- Centrifugar 100 x g por 30 s para os folhetos de pelotas e descartar o sobrenadante cuidadosamente. Lave duas vezes com tampão de lavagem 500 µ l e re-pelota as células por centrifugação a 100 x g durante 30 s.
- Para colher as vítimas de folhetos, digerir com 100 µ l de 425 colagenase U/mL II para 2 h e depois solte as vítimas pipetando delicadamente acima e para baixo usando a ponta da pipeta 200 µ l.
- Dilua a colagenase II em 19 mL de meio de cultura e centrifugar a 670 x g por 5 min para as vítimas e restantes detritos de folheto da válvula de Pelotas. Descartar o sobrenadante e transferir folhetos e vítimas para placas/frascos de cultura em conformidade (tabela 1).
- Cultura das vítimas por 5-7 dias em meio de cultura, até confluência é alcançada a 37 ° C, na presença de 5% (dióxido de carbono) CO2, alterando o meio após 72 h. Para posterior utilização em experimentos em vitro , passagem até 5 vezes depois de confluencia atinge 100%.
4. indução de calcificação das vítimas de rato
Nota: Para todos os experimentos, conte células com um hemocytometer.
- Execute todas as célula primária de semeação e de passagem em capas esterilizadas para evitar a contaminação. Para preparar rato primário das vítimas em vitro experiências de calcificação, propagar as células em uma densidade de 150.000 células/poço em placas 6-boas. Manter-se em meio de cultura até confluência ≥ 90% (tipicamente 72 h).
- Tratar as vítimas com calcificação versus meio de controle e incubar a 37 ° C, na presença de 5% CO2, para um adicional 72 h.
- Para estudar o rato primário calcificado VICs para posteriores análises a jusante, retire o meio de calcificação/controle e lave as monocamadas com tampão de lavagem para remover íons de Ca e Pi vinculados.
5. rato VIC caracterização
- Para imunocoloração monitorar para marcadores fenotípicos tais como vimentina e α-SMA, o rato vítimas em uma densidade de 150.000 células/poço no poço 6-placas de sementes contendo lamínulas (células vão crescer na superfície das lamínulas) e deixe crescer até a confluência de 50%.
- Aspire o meio de cultura e corrigir as monocamadas de células com paraformaldeído 4% (PFA) durante 10 minutos antes de lavá-los 3 vezes com solução salina tamponada fosfato (PBS), por 5 min cada tempo.
Cuidado: PFA é tóxico e deve ser manuseado com cuidado. - Incubar a monocamada de células com bloqueio e permeabilização de buffer (1X PBS, 5% de soro normal da mesma espécie que o anticorpo secundário, 0,3% Triton X-100) por 1h à temperatura ambiente.
- Incubar as monocamadas de células com anticorpos do rato do anti-α-SMA antivimentina e coelho que diluído em tampão de diluição de anticorpo (albumina de soro bovino 1% + 0,3% Triton X-100 em PBS) durante a noite a 4 ° C, agitando suavemente sobre um roqueiro.
Nota: Controlos negativos consistiam em não conjugada mouse IgG e IgG, usando as mesmas diluições como as amostras de teste de coelho. - No dia seguinte, lave os anticorpos primários 3 vezes com PBS, por 5 min cada tempo.
- Incube as monocamadas de células com anticorpos secundarios conjugados fluoróforo por 1h à temperatura ambiente, agitando suavemente sobre um roqueiro.
- Lavar 3 vezes com PBS e tweeze suavemente para fora as lamelas (que contêm o rato VICs) com um par de pinças e coloque sobre uma lamela contendo 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Deixe os slides para curar pelo menos 24 h a 4 ° C antes de Visualizar com um microscópio de fluorescência.
- Para a análise ocidental do borrão, propagar o rato vítimas em uma densidade de 150.000 células/poço no poço 6-placas e deixar crescer em meio de cultura até 100% confluentes.
- Use 8 µ g de proteína para executar um Western blot para medir a expressão do CD31 e descartar qualquer contaminação de VEC.
Nota: Um protocolo padrão ocidental do borrão foi seguido conforme descrito anteriormente,9. - Para estudos de gene, extrair o ácido ribonucleico (RNA), usando um kit comercial, seguindo as orientações do fabricante.
- Obter o cDNA usando a transcrição reversa para medir a expressão dos genes-alvo utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR) e PCR em tempo real (RT-PCR, também conhecida como qPCR) com detecção de fluoróforo verde, utilizando Gapdh como o gene de referência, como anteriormente descreveu a10.
- Use o seguinte programa para análise PCR: 1 ciclo de 94 ° C por 3 min, 30 ciclos de 94 ° C por 30 s, 63 ° C por 30 s, 72 ° C por 35 s e finalmente 1 ciclo de 72 ° C por 5 min.
- Use o seguinte programa para análise de qPCR: 1 ciclo de 95 ° C por 10 min, 40 ciclos de 95 ° C por 15 s, 60 ° C por 1 min e um ciclo adicional de 95 ° C por 1 min, a 55 ° C por 30 s e 95 ° C por 30 s.
- Execute uma eletroforese em gel para analisar os produtos de PCR usando um gel de agarose 2% em tampão Tris/borato/EDTA (TBE).
6. rato VIC calcificação estudos
- Por alizarina Red S e estudos bioquímicos de calcificação, siga a propagação e a calcificação diretrizes descritas na seção 4.
- Mancha as monocamadas de células com solução a 5% de vermelho de alizarina S, agite-o suavemente em uma coqueteleira, por 20 min. Posteriormente, lave 3 vezes com água destilada, por 5 min cada tempo. Adquira imagens de cada poço.
- Para quantificar a deposição de Ca, utilize um kit de ensaio Ca bioquímico. Lixiviação de íons Ca2 + usando 0,6 M o ácido clorídrico (HCl) por 24 h a 4 ° C, com agitação suave.
- Colher o sobrenadante e medida a concentração de Ca usando um ensaio de Ca kit (veja a Tabela de materiais) seguindo as orientações do fabricante.
- Calcule a concentração de cálcio como uma fração da proteína celular total. Desnature proteínas celulares desde as monocamadas de células com 0,1 M de hidróxido de sódio (NaOH) + 0,1% sulfato dodecyl de sódio (SDS). Determine a concentração de proteína total usando um detergente compatível (DC) proteína ensaio seguindo as orientações do fabricante.
Representative Results
O objectivo do presente protocolo foi descrever o isolamento primário rato vítimas de e cultura-los para em vitro experiências de calcificação. Empregando o método descrito acima, rato vítimas pode ser com êxito isolado e expandiu-se para o estudo dos mecanismos responsáveis pela CAVD.
VICs primário de rato co localizar com marcadores de VIC estabelecida:
O fenótipo de VIC de células isoladas foi confirmado através de imunofluorescência por sondagem para os marcadores de VIC: vimentina e α-SMA (vermelho e verde, respectivamente, figura 1A) e está de acordo com anteriores relatórios11,12. Os representante controles negativos usando mouse não conjugada e IgG de coelho são mostrados na figura 1B. Além disso, a expressão do regulador de crescimento-VIC TGFβ-1 e TGFβ-2 foi confirmada através da análise PCR (Figura 1). A fim de confirmar que o rato isolado primárias vítimas estavam livres de contaminação endotelial, análise ocidental do borrão foi realizada para verificar esse rato vítimas estavam negativas para o marcador de células endoteliais, CD31, usando VECs mitral caninas como um controle positivo ( Figura 1).
CA e Pi induzir rato VIC calcificação:
Concentrações elevadas de Ca e/ou Pi sistêmicas geralmente a unidade a calcificação das vítimas em vitro. Para apreciar o potencial de calcificação do rato isolado das vítimas, as células foram expostas a níveis elevados de Ca e Pi, que imitam condições patológicas de hipercalcemia e hiperfosfatemia em pacientes de DRT. Tratamento das vítimas com 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi induzido calcificação, conforme determinado pela coloração de alizarina Red S para deposição de Ca (Figura 2A) e determinação colorimétrica dos níveis de Ca seguindo HCl lixiviação (81 dobra; p < 0.05 usando o Student t-teste; Figura 2B).
Alterações de expressão de gene associadas com calcificação VIC:
A calcificação de células vasculares em vitro está associada um perfil molecular distinto. No presente estudo, o tratamento das vítimas com 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi induziu um aumento significativo na expressão do mRNA dos marcadores osteogênicas: Msh homeobox 2, Msx2 (2.04 prega mudança; p < 0,01; Figura 3A), fosfatase alcalina, Alpl (1.49 prega mudança; p < 0,001; Figura 3B) e fosfatase phosphoethanolamine/fosfocolina, Phospho1 (4.7 prega mudança; p < 0,01 usando ANOVA One-Way; A Figura 3). No entanto, a expressão do marcador osteogênica, Runx2e calcificação inibidor ectonucleotide pyrophasphatase, Enpp1, permaneceu inalterado (Figura 3D–E).
Figura 1. Expressão de marcadores de VIC. (A) imunofluorescência mostrando coloração dupla e colocalization de actina de músculo liso-alfa (α-SMA; verde) e vimentina em células intersticiais válvula (VICs). (B) imagem representativa dos controles negativos usando o mouse e IgG de coelho. Núcleos são corados em azul usando 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Barra de escala = 50 µm. (C) a presença de transformar o fator de crescimento beta 1 (TGFβ-1) e TGFβ-2 nas vítimas (faixas 1 - 3) Como indicado pela análise PCR. 4 Lane é o controle de água. Gene de referência utilizado foi Gapdh. (D) análise ocidental do borrão mostrando a expressão abundante de CD31 em células endoteliais canino da válvula mitral (VECs) em comparação com nenhuma expressão nas vítimas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Calcificação in vitro de rato VICs. Deposição de CA nas vítimas tratadas com 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi, conforme determinado pela: (A) fotografia mostrando alizarina Red S coloração de monocamadas de células inteiras no poço e (B) determinação colorimétrica dos níveis de Ca após a lixiviação de HCl. T do estudante-teste foi realizado para analisar a significância entre os grupos de dois dados. Os resultados são apresentados como média ± no MEV mostrou *p < 0.5 comparado com controle; (n = 4).
Figura 3. Alterações de expressão do gene associadas a calcificação de VIC. Prega mudança na expressão do mRNA de marcadores osteogênicas (A) Msx2, (B) Alpl, (C) Phospho1, (D) Runx2e (E) Enpp1 nas vítimas tratadas com 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi para a expressão de RNAm de 48 h. é mostrada como uma mudança de dobra em comparação com o gene endógeno referência Gadph. One-Way ANOVA, utilizando o modelo linear geral, incorporando as comparações por pares foi realizada para analisar a significância entre vários grupos. Os resultados são apresentados como média ± no MEV mostrou * *p < 0,01; p < 0,001 em relação ao controle; (n = 6). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Número de folhetos da válvula | Placa de cultura/balão |
| 9 a 15 | 1 bem na placa de 12 |
| 15 a 30 | 1 bem na placa de 6 |
| 30 + | T25 |
Tabela 1. Orientações gerais para o número de folhetos necessários para semeadura inicial.
Discussion
Este protocolo detalhado descreve um método prático para a aquisição de rato primária das vítimas, permitindo que o isolamento destas células de válvulas de coração de rato através de digestão enzimática. Nosso método mais suporta e estende-se o uso de um rato anteriormente relatados em vitro modelo para estudo de calcificação da valva aórtica13. O isolamento das vítimas da válvula aórtica apresenta o potencial de contaminação de VECs vizinhas. No entanto, nossos dados de imunofluorescência confirmam que a etapa de digestão inicial é suficiente para remover os VECs, tornando as células isoladas negativa para o marcador de células endoteliais, CD31. Além disso, α-SMA coloração confirma o fenótipo ativado das vítimas, que é necessário para a calcificação12.
Isolamentos de VIC anteriormente foram relatados em animal grande modelos6,7,8. No entanto, estas espécies são restringidas pelas limitado genéticas e moleculares ferramentas disponíveis para estudo a jusante, bem como sua acessibilidade restrita em laboratórios ao redor do mundo. Em contraste, tais ferramentas estão bem estabelecidas em roedores prontamente disponíveis e, portanto, a capacidade de isolar permite rato-derivado de vítimas uma maior capacidade de delineamento experimental. O uso de vítimas de ratos jovens também significa que as células são relativamente mais proliferativas que ratos mais velhos, exigindo, portanto, menos animais para produzir mais células. Embora os ratos estão prontamente acessíveis, mas devido a ratos tendo nomeadamente pequenas corações, o isolamento do mouse principal vítimas seria mais demoradas e consideravelmente mais animais seriam necessários para isolar o mesmo rendimento de células como o modelo de rato.
Uma vantagem significativa desta abordagem descrita é que as vítimas podem ser isoladas temporalmente do tipo selvagem e ratos transgênicos, bem como modelos do rato de lesão de válvula e doença cardiovascular. Usando o modelo de rato exigiria um maior número de animais para experiências em grande escala, portanto, para reduzir o uso de animais, rato primário das vítimas pode ser transformado para produzir uma linha de celular, uma vez que tem sido bem caracterizada.
Enquanto as graves implicações clínicas de CAVD são amplamente reconhecidas, os mecanismos causais subjacentes ainda precisa ser determinado. Além disso, a medicação eficaz terapias que podem prevenir e curar potencialmente calcificação da válvula aórtica não estão disponíveis no presente. A cultura de vítimas sob condições de calcificação, portanto, fornece um modelo altamente relevantes em vitro de CAVD. Mostramos que os níveis elevados de Ca e Pi induzem a calcificação em vitro de rato isolado vítimas com um concomitante aumento na expressão de marcadores de gene osteogênica Msx2, Alple Phospho1. É amplamente estabelecido que estes marcadores estão associados com o processo patológico de calcificação vascular14,15,16. Portanto, nossos dados mostram que a cultura de rato vítimas em calcificação médio é um modelo adequado com dedicada ao estudo de calcificação da válvula aórtica em vitro. De fato, estudos recentes de nosso laboratório utilizaram este modelo para demonstrar que Ca promove a calcificação da válvula aórtica através de enriquecimento anexina VI de VIC-derivado de matriz vesículas17.
Apesar dos benefícios de usar o rato vítimas e sua caracterização eficiente, existem ainda algumas limitações. Primeiro, o tamanho da população de VIC dentro válvulas do rato é muito pequeno, e, portanto, muitos animais são necessárias para gerar o número de células suficientes para estudos extensos em vitro . No entanto, é possível superar esta limitação por estudos preliminares de empresa em linhas de célula intersticial de válvula imortalizado, como relatado recentemente por nós18e posteriormente empregando culturas primárias para verificar e estendem estas conclusões.
Em resumo, o método descrito explica o sucesso isolamento, cultura e calcificação do rato primária das vítimas, que podem ser posteriormente avaliados usando uma variedade de análises, incluindo ensaios bioquímicos, bem como a proteína e análises de RNA. Este modelo oferece um sistema confiável e conveniente para se investigar CAVD em vitroe fornece uma ferramenta valiosa para investigar os mecanismos moleculares responsáveis por esta doença destrutiva.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
CD31 anticorpo usado foi um presente generoso do Dr. Karen Tan, Universidade de Edimburgo. Este estudo foi suportado pelo financiamento da biotecnologia e biológicos Sciences Research Council (BBSRC), sob a forma de uma subvenção de programa estratégico do Instituto (BB/J004316/1; BBS/E/D/20221657) (VEM e CF), um Instituto carreira caminho Fellowship BB/F023928/1 (VEM) e bolsa de estudo financiamento através de um caso de BBSRC Studentship BB/K011618/1 (LC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave before use. |
| Spring straight (8 mm blade) | World Precision Instruments | 15905 | Autoclave before use. |
| SuperFine Vannas scissors (5 mm blade, 8 cm) | World Precision Instruments | 14003 | Autoclave before use. |
| Dumont #5 tweezers (11 cm) | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave before use. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
| Foetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Filter before adding to culture medium. |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710049 | |
| Absolute ethanol | Thermo Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in distilled water. |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher Scientific | H1150PB17 | Dilute to 0.6M with distilled water. |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | UN1823 | Dilute to 0.1M with distilled water. |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | 1/250 dilution in antibody dilution buffer. |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | 1/250 dilution in antibody dilution buffer. |
| Superscript II kit | Thermo Fisher Scientific | 18064014 | |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | 18427013 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | P/N58875 | |
| Taq Polymerase kit | Thermo Fisher Scientific | 18038026 | |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) | Thermo Fisher Scientific | AM9863 | Dilute to 1x with distlled water, before use. |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500 | 2% in 1x Tris/Borate/EDTA(TBE). |
| Lysis buffer (RIPA) | Thermo Fisher Scientific | 89900 | |
| T75 flask | Thermo Fisher Scientific | 156472 | |
| T175 flask | Thermo Fisher Scientific | 159920 | |
| qPCR plates | Thermo Fisher Scientific | AB0990 | |
| Rat Msx2 primer | Qiagen | QT01084090 | |
| Rat Alpl primer | Qiagen | QT00190680 | |
| Rat Enpp1 primer | Qiagen | QT00181426 | |
| RNeasy minikit | Qiagen | 74104 | |
| 6-well plates | Sigma | CLS3516 | |
| T25 flask | Sigma | CLS430639 | |
| Monobasic phosphate | Sigma | S5011 | |
| Dibasic phosphate | Sigma | S5136 | |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma | 5030 | Dilute to 0.1% with 0.1M NaOH. |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS. |
| Triton X100 | Sigma | X100 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3059 | |
| Alizarin red S | Sigma | A5533 | Make up to 2% with distilled water, and adjust to pH 4.2. |
| TGFβ-1 primer pair: f: GCTACCATGCCAACTTCTGT r: TGTGTTGGTTGTAGAGGGCA | Sigma | Concentration used: 10 μM | |
| TGFβ-2 primer pair: f: GAAGGCAGAGTTCAGGGTCT r: CGCTGGGTTGGAGATGTTAG | Sigma | Concentration used: 10 μM | |
| Monoclonal Anti-β-Actin−Peroxidase antibody produced in mouse | Sigma | A3854 | 1/50000 dilution in 5% BSA in tris-buffered saline + 0.1% Tween (TBS/T). |
| Mouse anti-vimentin antibody | Sigma | v6389 | 1/900 dilution in antibody dilution buffer (1x phosphate buffered saline (PBS), 1% bovine serum albumin (BSA), 0.3% Triton X-100). |
| Mouse IgG | Sigma | I5381 | Diluted to the same stock concentration as mouse anti-vimentin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer. |
| Rabbit IgG | GeneTex | GTX35035 | Diluted to the same stock concentration as rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer. |
| Rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody | Abcam | ab5694 | 1/200 dilution in antibody dilution buffer. |
| Rabbit anti-CD31 | Abcam | ab28364 | 1/50 dilution in 5% BSA inTBS/T. |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Dako | P0448 | 1/3000 dilution in in 5% BSA in TBS/T. |
| Collagenase II | Worthington | 41512862 | Adjust to 425 U/mL with distilled water, and then filter. |
| SYBR green mastermix | Primerdesign | PrecisionPLUS-MX-SY | |
| Calcium assay kit | Randox | CA590 | |
| DC protein assay kit | Bio-Rad | 5000111 | |
| ECL reagent | GE Healthcare | RPN2109 | |
| Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906837 | |
| Nitrocellulose membrane | GE Healthcare | 10600007 | |
| PCR ladder | Bioline | BIO-33057 | |
| Loading dye for gel electrophoresis | New England Biolabs | B7025S | |
| Syringe filters (0.22 μm) | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Coverslips | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3100 | |
| Hematocytometer | Marienfeld Superior | 640030 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera set up for Alizarin red images: | |||
| Camera | Nikon D800 | ||
| Lens | Nikon AF_s Micro, Nikko 105 mm, 1:2.8 GED | ||
| Dissection forceps 10 cm, curved ends | World Precision Instruments | 15915 | Autoclave before use. |
References
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