Summary
Dit protocol beschrijft de isolatie, cultuur en verkalking van de rat-afgeleide ventiel interstitiële cellen, een zeer fysiologische in vitro model van calcific aortaklep ziekte (CAVD). Exploitatie van dit model rat vergemakkelijkt CAVD onderzoek in het verkennen van de cel- en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan dit complexe pathologisch proces.
Abstract
Calcific aortaklep ziekte (CAVD) wordt gekenmerkt door de progressieve verdikking van de folders van de aortaklep. Het is een aandoening die vaak gevonden in de ouderen- en eind-fase nierziekte (ESRD) patiënten, die vaak last van hyperphosphatemia en hypercalciëmie hebben. Op dit moment zijn er geen medicatie therapieën die haar progressie kunnen stoppen. De mechanismen die ten grondslag liggen aan dit pathologische proces blijven onduidelijk. De aortaklep bijsluiter bestaat uit een dun laagje ventiel endotheliale cellen (VECs) op de buitenste oppervlakken van de aorta cusps, met klep interstitiële cellen (VICs) ingeklemd tussen de VECs. Het gebruik van een rat-model in staat stelt de in vitro -studie van ectopische verkalking gebaseerd op de in vivo pathofysiologische serum fosfaat (Pi) en calcium (Ca) niveaus van patiënten die lijden aan hyperphosphatemia en hypercalciëmie. Het protocol beschreven gegevens de isolatie van een zuivere rat VIC bevolking, zoals blijkt uit de expressie van VIC markers: alpha-gladde spier actine (α-SMA) vimentin en weefsel groeifactor beta (TGFβ) 1 en 2, en het ontbreken van cluster van differentiatie (CD) 31, een VEC marker. Door deze VICs uit te vouwen, kunnen beeldvorming, biochemische en genetische studies worden uitgevoerd om te studeren en de belangrijkste bemiddelaars onderbouwing CAVD ontrafelen.
Introduction
De gezonde aortaklep bestaat uit drie folders, waarnaar de verdeling van de mechanische spanning tijdens het openen en sluiten van de klep is eveneens verdeeld. De folder van de klep heeft een gedefinieerde structuur uit drie verschillende lagen: de fibrosa, spongiosa en ventricularis, welke huis valve interstitiële cellen (VICs) als de overheersende celtype. Deze drie lagen zijn ingeklemd tussen twee bedden van ventiel endotheliale cellen (VECs)1.
VICs spelen een cruciale rol in de progressie van Calcific aorta klep verkalking (CAVD), de meest voorkomende hart-ventiel en vaatziekten in de westerse wereld. CAVD wordt beschreven als een progressieve aandoening die actief wordt gereguleerd door het probleem weefsel en haar omringende communicatie. Cellulaire veranderingen veroorzaken in eerste instantie fibrotische verdikking en uiteindelijk een uitgebreide verkalking van de aortaklep folders. Dit vervolgens leidt tot aanzienlijke aortaklep stenose en uiteindelijk verliet ventriculaire uitstroom obstructie2, verlaten van chirurgische klep vervanging als de enige haalbare behandeling.
De pathofysiologie van CAVD is complex, maar soortgelijke mechanismen aan fysiologische bot mineralisatie3deelt. Terwijl een aantal studies is gebleken dat het vermogen van VICs ondergaan osteogenic trans-differentiatie en verkalking4,5, de mechanismen die dit proces nog moeten volledig worden opgehelderd, markeren de cruciale eis voor een haalbaar en relevante in vitro model van CAVD.
Vorige werk van een aantal laboratoria heeft met succes geïsoleerd VICs van varkens en runderen modellen, en gekweekt deze cellen onder voorwaarden6,7,8calcifying. Vanwege de grote omvang van de aortaklep in deze modellen is isolatie van cellen via enzymatische spijsvertering zeer effectief in het genereren van zuiver populaties van cellen. Deze modellen kunnen echter beperkingen als gevolg van de beperkte beschikbaarheid van moleculaire tools voor grote diersoorten. Daarentegen blijven knaagdier modellen voordelig als gevolg van de relatief lagere kosten, potentieel voor genetische manipulatie en de uitgebreide matrix voor moleculaire tools die gemakkelijk beschikbaar zijn. Echter, de isolatie van VICs uit kleine diermodellen is niet wijd in dienst, die is een waarschijnlijk gevolg van de moeilijkheden bij het werken met kleine weefselsteekproeven.
Dit gedetailleerde protocol rapporteert een uitgebreide methode voor de directe isolatie van rat VICs. Door zorgvuldige dissectie van de klep, gevolgd door een reeks van enzymatische spijsvertering, kunnen VICs worden geïsoleerd en werkzaam in een breed scala van experimentele technieken, met inbegrip van cel-cultuur, verkalking en gen-expressie. Dit model zeer relevant in vitro van CAVD zal ongetwijfeld een wezenlijke bijdrage aan het vergroten van onze kennis van dit pathologische proces.
Protocol
Alle dierproeven werden goedgekeurd door het Roslin Instituut het dier gebruikerscomité, en de dieren werden gehandhaafd overeenkomstig thuiskantoor (UK) richtsnoeren voor de verzorging en het gebruik van dieren. Voor de hieronder beschreven protocol werden 5 - week oud, mannelijke Sprague-Dawley ratten gebruikt.
1. reagens recepten
- Bereid het kweekmedium gebruik van Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) en voedende mengsel F-12 (DMEM/F12). Voeg 10% gesteriliseerd warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (FBS) en 1% gentamicine.
- De verkalking medium gebruik kweekmedium en 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi voor te bereiden.
- Bereiden 1 M calciumchloride (CaCl2) door weging uit 555 mg CaCl2 en ontbinding van het in 5 mL gedestilleerd water om 5 mL CaCl, 1 M2. Filtreer de oplossing door een 0,22 µm spuit filter om de oplossing te steriliseren.
- Bereiden van 1 M natriumfosfaat door weging 710 mg watervrij dibasische natriumfosfaat (nb2HPO4) en 600 mg van watervrij monobasisch natriumfosfaat (NaH2PO4), ontbinding van elk afzonderlijk in 5 mL gedistilleerd water. 3870 µL van nb2HPO4 en 1.130 µL van NaH2PO4, en filter combineren door een 0,22 µm spuit filter te steriliseren oplossing.
- Bereiden de buffer wassen met Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS) en 1% gentamicine.
2. voorbereiding van de dissectie-kap
- Alle dissecties in een geventileerde kap, eerder ontsmet met 70% ethanol om de steriliteit van monsters en reagentia uitvoeren.
- Dissectie tools steriliseren in autoclaaf die hen gevolgd door de toppen van de hulpprogramma's in een bekerglas van 70% ethanol vóór gebruik onder te dompelen.
- Bekerglazen met was buffer voor te bereiden, en geniet van de dissectie-hulpmiddelen in was buffer voor komst in contact met het dier of de weefsels. Houd de buffer wassen op ijs te allen tijde.
3. extractie van primaire Rat VICs
Opmerking: Voor de hieronder beschreven protocol 5 - week oud, mannelijke Sprague-Dawley ratten werden gebruikt.
- Ruiming van de ratten (~ 100 g) door cervicale dislocatie overeenkomstig de richtsnoeren van de UK Home Office.
- Plaats het dier liggende op een glas dissectie bord om te ontleden uit het hart van elke rat, en ontsmetting van de huid door te sproeien met 70% ethanol.
- Maak een incisie van 4 cm in de middellijn van de rat met behulp van de dissectie schaar, bloot de buikholte, en verwijder voorzichtig de ribbenkast en de longen, het hart bloot te stellen.
- Verwijderen van het hart met een paar voor sharp, spring gebogen schaar en de ontleed hart in ijs koud was buffer opslaan totdat alle bruto ontledingen van de ratten voltooid zijn.
- Om de micro-ontleden elk hart, bedekt overdracht de laatste in een petrischaal met was buffer. Trim de hartspier met een lente rechte schaar (6 mm mes) worden verlaten met een klein gebied rondom de oplopende aorta en de aorta wortel.
- Met behulp van hetzelfde voorjaar rechte schaar (6 mm mes), zorgvuldig opengesneden de oplopende aorta naar het linkerventrikel en bloot de aortaklep folders.
- Breng het geopende aorta in een frisse, steriele petrischaal gevuld met HBSS. Ontleden uit de aortaklep folders, gekenmerkt door hun unieke vorm van de 'U' aan de voet van de aorta, met een Vannas-type capsulotomy micro-schaar (3 mm mes).
- Alle folders worden opgeslagen in 1 mL ijs koud was buffer, in een 1,5 mL microcentrifuge buis totdat alle dissecties voltooid zijn.
- Zodra alle folders zijn geoogst, centrifugeer ze bij 100 x g voor 1 min bij 4 ° C tot het verwijderen van de was-buffer.
- Opeenvolgende stappen in een cel cultuur kap om sterilisatie uitvoeren. Als u wilt verwijderen van de VECs, verteren de folders in 100 µL 425 U/mL collagenase II gedurende 5 minuten bij 37 ° C. De spijsvertering verstoren door zachtjes op en neer met behulp van een pipet tip van 200 µL pipetteren.
- Centrifugeer bij 100 x g gedurende 30 s tot pellet de folders, en verwijder het supernatant zorgvuldig. Wassen tweemaal met 500 µL was buffer- and -pellet opnieuw de cellen door centrifugeren bij 100 x g gedurende 30 s.
- Om te oogsten de VICs van de brochures, verteren met 100 µL van 425 U/mL collagenase II voor 2 h en laat u vervolgens de VICs door zachtjes op en neer met behulp van een pipet tip van 200 µL pipetteren.
- Verdun de collagenase II in 19 mL gestolde voedingsbodem en centrifuge bij 670 x g gedurende 5 min naar de pellet de VICs en resterende ventiel leaflet puin. Vloeistof wordt weggeworpen en folders en VICs overbrengen naar cultuur platen/kolven dienovereenkomstig (tabel 1).
- Cultuur de VICs voor 5-7 dagen in een cultuurmedium, totdat confluentie bij 37 ° C, in aanwezigheid van 5% (koolstofdioxide) CO2, wijzigen van het medium na 72 uur wordt bereikt. Voor latere gebruik in in vitro experimenten, passage tot 5 keer zodra confluency 100% bedraagt.
4. de inductie van verkalking van de Rat VICs
Opmerking: Voor alle experimenten, cellen met een hemocytometer tellen.
- Het uitvoeren van alle primaire cel zaaien en passaging in gesteriliseerde afzuigkappen om verontreiniging te voorkomen. Beënt primaire rat VICs om voor te bereiden in vitro verkalking experimenten, de cellen bij een dichtheid van 150.000 cellen per putje in 6-Wells-platen. Tot ≥ 90% confluentie (meestal 72 h) in een kweekvloeistof handhaven.
- Behandel de VICs met calcificatie versus controle medium en Incubeer bij 37 ° C, in aanwezigheid van 5% CO2, voor een extra 72 h.
- Studeren de primaire kalkhoudend rat VICs voor latere downstream analyses, verwijder het medium verkalking/controle en wassen de monolayers met was buffer voor het verwijderen van niet-gebonden Ca en Pi ionen.
5. rat VIC karakterisering
- Voor immunokleuring te controleren voor fenotypische markeringen zoals vimentin en α-SMA, zaad de rat VICs bij een dichtheid van 150.000 cellen per putje in 6 goed-platen die bevatten cover slips (cellen zal groeien op het oppervlak van de cover glijdt), en laat hem groeien tot 50% confluentie.
- Het kweekmedium gecombineerd en monteren van de cel monolayers met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 10 minuten vóór het wassen ze 3 keer met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), gedurende 5 minuten elke keer.
Let op: PFA is giftig en moet voorzichtig worden omgegaan. - Incubeer de cel enkelgelaagde met blokkeren en permeabilization buffer (1 x PBS, 5% van de normale serum van dezelfde soort als het secundaire antilichaam, 0.3% Triton X-100) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Incubeer de cel monolayers met muis anti-vimentin en konijn anti-α-SMA antilichamen verdund in antilichaam verdunning buffer (1% bovien serumalbumine + 0,3% Triton X-100 in PBS) 's nachts bij 4 ° C, zachtjes schudden op een rocker.
Opmerking: Negatieve controles bestond uit muis niet-geconjugeerde IgG en konijn IgG, met behulp van de dezelfde verdunningen als de analysemonsters. - Op de volgende dag, afwassen de primaire antilichamen 3 keer met PBS, gedurende 5 minuten elke keer.
- Incubeer de cel monolayers met fluorophore-geconjugeerde secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, zachtjes schudden op een rocker.
- 3 keer wassen met PBS en zachtjes tweeze uit de coverslips (die bevatten rat VICs) met een paar pincet en plaats op een dekglaasje aan met 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Laat de dia's te genezen voor ten minste 24 uur bij 4 ° C vóór visualiseren met een fluorescentie Microscoop.
- Beënt de rat VICs bij een dichtheid van 150.000 cellen per putje in 6 goed-platen en laten groeien in een kweekvloeistof tot 100% confluente voor westelijke vlekkenanalyse.
- Gebruik 8 µg eiwit wilt uitvoeren van een westelijke vlek te meten van de uitdrukking van CD31 en elke VEC-besmetting uitsluiten.
Opmerking: Een standaard westelijke vlek-protocol werd gevolgd zoals eerder beschreven9. - Pak voor gene studies, RNA acid (RNA) met behulp van een commerciële kit volgens de richtlijnen van de fabrikant.
- Verkrijgen van cDNA met behulp van omgekeerde transcriptie voor het meten van de doelgenen expressie met behulp van de polymerase-kettingreactie (PCR) en PCR in real time (RT-PCR; ook bekend als qPCR) met groene fluorophore de detectie, met behulp van Gapdh als het referentie-gen, zoals voorheen 10beschreven.
- Gebruik het volgende programma voor PCR analyse: 1 cyclus van 94 ° C gedurende 3 minuten, 30 cycli van 94 ° C voor 30 s, 63 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 35 s, en tot slot 1 cyclus van 72 ° C gedurende 5 minuten.
- Het volgende programma gebruikt voor qPCR analyse: 1 cyclus van 95 ° C gedurende 10 minuten, 40 cycli van 95 ° C gedurende 15 s, 60 ° C gedurende 1 minuut en een extra cyclus van 95 ° C voor 1 min, 55 ° C voor 30 s, en 95 ° C gedurende 30 s.
- Voer een de Elektroforese van het gel voor het analyseren van PCR producten met behulp van een 2% agarose gel in Tris/boraat/EDTA (FSME) buffer.
6. rat VIC verkalking Studies
- Volg voor Alizarine Red S en verkalking van de biochemische studies, zaaien en verkalking richtsnoeren beschreven in sectie 4.
- Vlek de cel monolayers met 5% Alizarine rode S-oplossing, voorzichtig rocken op een shaker, voor 20 min. Vervolgens wassen 3 keer met gedestilleerd water, gedurende 5 minuten elke keer. Beelden van elk putje te verwerven.
- Om te kwantificeren Ca depositie, een biochemische Ca assay kit gebruiken. Leach Ca2 + ionen met 0,6 M zoutzuur (HCl) gedurende 24 uur bij 4 ° C, met zachte agitatie.
- Oogst de bovendrijvende vloeistof en meet de concentratie van de Ca met behulp van een Ca-assay kit (Zie Tabel van materialen) volgens de richtlijnen van de fabrikant.
- Bereken de concentratie van de calcium als een fractie van de totale cellulaire eiwit. Het denatureren van cellulaire eiwitten uit de cel monolayers met 0,1 M natriumhydroxide (NaOH) + 0,1% natrium dodecyl sulfaat (SDS). Bepaal de concentratie van de totale proteïne met behulp van een wasmiddel compatibel (DC) eiwit bepaling volgens de richtlijnen van de fabrikant.
Representative Results
Het doel van dit protocol was om te beschrijven van het isolement van primaire rat VICs en cultuur ze voor in vitro verkalking experimenten. Door gebruik te maken van de hierboven beschreven methode, kan het rat VICs met succes worden geïsoleerd en uitgebreid voor de studie van de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor CAVD.
Rat primaire VICs lokaliseren samen met gevestigde VIC Markeringen:
Het fenotype van de VIC van geïsoleerde cellen werd bevestigd door immunofluorescentie door het sonderen van de VIC-Markeringen: vimentin en α-SMA (rood en groen, respectievelijk, figuur 1A), en is in overeenstemming met vorige verslagen11,12. De representatieve negatieve controles met behulp van niet-geconjugeerde muis en konijn IgG worden weergegeven in figuur 1B. Bovendien is de uitdrukking van de VIC-groei regulator TGFβ-1 en TGFβ-2 werd bevestigd met behulp van PCR analyse (Figuur 1 c). Om te bevestigen dat de geïsoleerde rat primaire VICs vrij waren van endothelial besmetting, westelijke vlekkenanalyse werd uitgevoerd om te controleren of die rat waren VICs negatief voor de endothelial cel markering, CD31, met behulp van canine mitralisklep VECs als positieve controle ( Figuur 1 d).
CA en Pi induceren Rat VIC verkalking:
Verhoogde systemische Ca en/of Pi concentraties meestal rijden de verkalking van VICs in vitro. Om te genieten van het potentieel van de verkalking van de geïsoleerde rat VICs, werden de cellen blootgesteld aan verhoogde niveaus van Ca en Pi, die pathologische condities van hypercalciëmie en hyperphosphatemia in ESRD patiënten na te bootsen. Behandeling van VICs met 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi geïnduceerde verkalking, zoals bepaald door Alizarine Red S kleuring voor Ca afzetting (figuur 2A) en colorimetrische bepaling van Ca niveaus na HCl uitloging (81 vouwen; p < 0.05 met behulp van de Student t-Test; Figuur 2B).
Gen expressie veranderingen VIC verkalking is gekoppeld:
De verkalking van vasculaire cellen in vitro wordt geassocieerd met een verschillende moleculaire profiel. In de huidige studie, de behandeling van VICs met 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi veroorzaakte een aanzienlijke stijging van de uitdrukking van mRNA van de osteogenic markers: Msh homeobox 2, Msx2 (2,04 vouw wijzigen; p < 0,01; Figuur 3A), alkalische fosfatase, Alpl (1,49 vouw wijzigen; p < 0.001; Figuur 3B), en phosphoethanolamine/fosfocholine fosfatase, Phospho1 (4,7 vouw wijzigen; p < 0.01 met one-way ANOVA; Figuur 3 c). De expressie van de osteogenic marker, Runx2, en verkalking remmer ectonucleotide pyrophasphatase, Enpp1, bleef echter onveranderd (figuur 3D-E).
Figuur 1. Expressie van VIC markeerders. (A) immunofluorescentie dubbele kleuring en colocalization van alpha-gladde spier actine (α-SMA; groene) en vimentin in ventiel interstitiële cellen (VICs) tonen. (B) representatieve afbeelding van negatieve controles met behulp van de muis en konijn IgG. Kernen zijn gekleurd in blauw met 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Schaal bar = 50 µm. (C) de aanwezigheid van de omvorming van de groeifactor bèta 1 (TGFβ-1) en TGFβ-2 in VICs (banen 1 - 3) Zoals blijkt uit de analyse van PCR. Lane 4 is de watercontrole. Gen van de referentie gebruikt werd Gapdh. (D) westelijke vlekkenanalyse de overvloedige uitdrukking van CD31 in canine mitralisklep endotheliale cellen (VECs) in vergelijking met geen uitdrukking in VICs tonen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. In vitro verkalking van rat VICs. CA afzetting in VICs behandeld met 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi zoals bepaald door: (A) foto tonen Alizarine Red S-verkleuring van de hele cel monolayers in de put, en (B) colorimetrische bepaling van Ca niveaus na HCl uitspoeling. Van de student t-test werd uitgevoerd om de betekenis tussen de fracties van twee gegevens te analyseren. Resultaten worden gepresenteerd zoals bedoel ± S.E.M. *p < 0,5 in vergelijking met controle; (n = 4).
Figuur 3. Gen expressie veranderingen geassocieerd met VIC verkalking. Vouw in de uitdrukking van mRNA van osteogenic markeringen wijzigen (A) Msx2(B) Alpl, (C) Phospho1, (D) Runx2en (E) Enpp1 in VICs behandeld met 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi voor 48 h. mRNA uitdrukking wordt weergegeven als een verandering van de vouw in vergelijking met het endogene referentie-gen Gadph. One-way ANOVA met behulp van de algemene lineaire model met paarsgewijse vergelijkingen werd uitgevoerd om de betekenis tussen meerdere groepen te analyseren. Resultaten worden gepresenteerd zoals bedoel ± S.E.M. **p < 0,01; p < 0.001 t.o.v. controle; (n = 6). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Aantal ventiel folders | Cultuur plaat/kolf |
| 9 tot en met 15 | 1 goed in 12-well plaat |
| 15 tot 30 | 1 goed in 6-well plaat |
| 30 + | T25 |
Tabel 1. Algemene richtsnoeren voor het aantal folders vereist voor eerste zaaien.
Discussion
Dit gedetailleerde protocol beschrijft een praktische methode voor de verwerving van primaire rat VICs, waardoor de isolatie van deze cellen rat hartkleppen via enzymatische spijsvertering. Onze methode verder ondersteunt en breidt het gebruik van een eerder gemelde rat in vitro model te bestuderen van de aortaklep verkalking13. De isolatie van VICs uit de aortaklep introduceert het potentieel voor besmetting van naburige VECs. Echter bevestigen onze immunofluorescentie gegevens dat de spijsvertering van de eerste stap voldoende is voor het verwijderen van de VECs, waardoor de geïsoleerde cellen negatief voor de endothelial cel marker, CD31. Bovendien, α-SMA kleuring bevestigt het geactiveerde fenotype van de VICs, die nodig is voor verkalking12.
VIC isolatie zijn eerder gemeld grote diermodellen6,7,8. Deze soorten zijn echter beperkt door de beperkte genetische en moleculaire tools beschikbaar voor downstream onderzoek, evenals beperkte bereikbaarheid in laboratoria over de hele wereld. Dergelijke instrumenten zijn daarentegen goed ingeburgerd in beschikbaar knaagdieren en dus de mogelijkheid om te isoleren rat afkomstige VICs maakt een grotere capaciteit van de proefopzet. Het gebruik van VICs van jonge ratten betekent ook dat de cellen relatief meer proliferatieve dan oudere ratten, dus die minder dieren meer cellen opleveren. Hoewel muizen zijn gemakkelijk toegankelijk, maar als gevolg van muizen gelet met name kleinere harten, het isolement van de primaire muisknop VICs zou meer tijd in beslag en aanzienlijk meer dieren zouden moeten isoleren van de dezelfde opbrengst van cellen als het model van de rat.
Een belangrijk voordeel van deze beschreven aanpak is dat VICs geïsoleerd stoffelijk van wild type en transgene ratten, evenals rat modellen van cardiovasculaire ziekte en ventiel letsel kunnen worden. Met behulp van de rat-model zou vereisen een groter aantal dieren voor grootschalige experimenten, dus om dierlijke gebruik te verminderen, primaire rat VICs kan worden getransformeerd om te produceren een cellijn zodra het goed gekenmerkt.
Terwijl de ernstige klinische gevolgen van CAVD op brede schaal erkend, de oorzakelijke mechanismen moeten nog worden bepaald. Bovendien, effectieve medicatie therapieën die kunnen voorkomen en eventueel genezen van verkalking van de aortaklep zijn niet beschikbaar bij presenteren. De cultuur van VICs onder calcifying voorwaarden biedt daarom een zeer relevant in vitro model van CAVD. We laten zien dat verhoogde Ca en Pi hoge blootstellingsniveaus de verkalking in vitro voor geïsoleerde rat VICs met een daarmee gepaard gaande toename van de expressie van osteogenic gen markers Msx2, Alplen Phospho1. Algemeen wordt vastgesteld dat deze markers gekoppeld aan het pathologisch proces van vasculaire verkalking14,15,16 zijn. Onze gegevens blijkt dus dat de cultuur van rat VICs in calcifying medium een passend model waarmee aortaklep verkalking in vitrostudie. Inderdaad, hebben de recente studies van ons laboratorium dit model om aan te tonen dat Ca verkalking van de aortaklep via Annexine VI verrijking van VIC afkomstige matrix blaasjes17 bevordertgebruikt.
Ondanks de voordelen van het gebruik van rat VICs en hun efficiënte karakterisering, bestaan nog steeds enkele beperkingen. Ten eerste, de grootte van VIC bevolking binnen rat kleppen is zeer klein en daarom veel dieren zijn er nodig om het genereren van voldoende cel nummers voor uitgebreide in vitro studies. Het is echter mogelijk om deze beperking ondervangen door de voorbereidende studies van de onderneming in vereeuwigd ventiel interstitiële cellijnen, zoals onlangs gemeld door ons18, en vervolgens met primaire culturen te controleren en uit te breiden van deze bevindingen.
Kortom verklaart de beschreven methode de succesvolle isolatie, cultuur en verkalking van primaire rat VICs, die vervolgens kunnen worden beoordeeld met behulp van een verscheidenheid van analyses met inbegrip van biochemische tests, evenals eiwitten en RNA analyses. Dit model biedt een betrouwbare en handige systeem waarin om CAVD in vitrote onderzoeken, en biedt een waardevol instrument voor het onderzoeken van de moleculaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor deze verwoestende ziekte.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
CD31 antilichaam gebruikt was een gulle gift van Dr. Karen Tan, Universiteit van Edinburgh. Deze studie werd ondersteund door financiële middelen van de biotechnologie en de biologische wetenschappen onderzoek Raad (BBSRC) in de vorm van een instituut strategische programma subsidie (BB/J004316/1; BBS/E/D/20221657) (VEM en CF), een instituut carrière pad Fellowship BB/F023928/1 (VEM), en studententijd financiering via een BBSRC geval studententijd BB/K011618/1 (LC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave before use. |
| Spring straight (8 mm blade) | World Precision Instruments | 15905 | Autoclave before use. |
| SuperFine Vannas scissors (5 mm blade, 8 cm) | World Precision Instruments | 14003 | Autoclave before use. |
| Dumont #5 tweezers (11 cm) | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave before use. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
| Foetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Filter before adding to culture medium. |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710049 | |
| Absolute ethanol | Thermo Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in distilled water. |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher Scientific | H1150PB17 | Dilute to 0.6M with distilled water. |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | UN1823 | Dilute to 0.1M with distilled water. |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | 1/250 dilution in antibody dilution buffer. |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | 1/250 dilution in antibody dilution buffer. |
| Superscript II kit | Thermo Fisher Scientific | 18064014 | |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | 18427013 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | P/N58875 | |
| Taq Polymerase kit | Thermo Fisher Scientific | 18038026 | |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) | Thermo Fisher Scientific | AM9863 | Dilute to 1x with distlled water, before use. |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500 | 2% in 1x Tris/Borate/EDTA(TBE). |
| Lysis buffer (RIPA) | Thermo Fisher Scientific | 89900 | |
| T75 flask | Thermo Fisher Scientific | 156472 | |
| T175 flask | Thermo Fisher Scientific | 159920 | |
| qPCR plates | Thermo Fisher Scientific | AB0990 | |
| Rat Msx2 primer | Qiagen | QT01084090 | |
| Rat Alpl primer | Qiagen | QT00190680 | |
| Rat Enpp1 primer | Qiagen | QT00181426 | |
| RNeasy minikit | Qiagen | 74104 | |
| 6-well plates | Sigma | CLS3516 | |
| T25 flask | Sigma | CLS430639 | |
| Monobasic phosphate | Sigma | S5011 | |
| Dibasic phosphate | Sigma | S5136 | |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma | 5030 | Dilute to 0.1% with 0.1M NaOH. |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS. |
| Triton X100 | Sigma | X100 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3059 | |
| Alizarin red S | Sigma | A5533 | Make up to 2% with distilled water, and adjust to pH 4.2. |
| TGFβ-1 primer pair: f: GCTACCATGCCAACTTCTGT r: TGTGTTGGTTGTAGAGGGCA | Sigma | Concentration used: 10 μM | |
| TGFβ-2 primer pair: f: GAAGGCAGAGTTCAGGGTCT r: CGCTGGGTTGGAGATGTTAG | Sigma | Concentration used: 10 μM | |
| Monoclonal Anti-β-Actin−Peroxidase antibody produced in mouse | Sigma | A3854 | 1/50000 dilution in 5% BSA in tris-buffered saline + 0.1% Tween (TBS/T). |
| Mouse anti-vimentin antibody | Sigma | v6389 | 1/900 dilution in antibody dilution buffer (1x phosphate buffered saline (PBS), 1% bovine serum albumin (BSA), 0.3% Triton X-100). |
| Mouse IgG | Sigma | I5381 | Diluted to the same stock concentration as mouse anti-vimentin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer. |
| Rabbit IgG | GeneTex | GTX35035 | Diluted to the same stock concentration as rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer. |
| Rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody | Abcam | ab5694 | 1/200 dilution in antibody dilution buffer. |
| Rabbit anti-CD31 | Abcam | ab28364 | 1/50 dilution in 5% BSA inTBS/T. |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Dako | P0448 | 1/3000 dilution in in 5% BSA in TBS/T. |
| Collagenase II | Worthington | 41512862 | Adjust to 425 U/mL with distilled water, and then filter. |
| SYBR green mastermix | Primerdesign | PrecisionPLUS-MX-SY | |
| Calcium assay kit | Randox | CA590 | |
| DC protein assay kit | Bio-Rad | 5000111 | |
| ECL reagent | GE Healthcare | RPN2109 | |
| Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906837 | |
| Nitrocellulose membrane | GE Healthcare | 10600007 | |
| PCR ladder | Bioline | BIO-33057 | |
| Loading dye for gel electrophoresis | New England Biolabs | B7025S | |
| Syringe filters (0.22 μm) | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Coverslips | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3100 | |
| Hematocytometer | Marienfeld Superior | 640030 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera set up for Alizarin red images: | |||
| Camera | Nikon D800 | ||
| Lens | Nikon AF_s Micro, Nikko 105 mm, 1:2.8 GED | ||
| Dissection forceps 10 cm, curved ends | World Precision Instruments | 15915 | Autoclave before use. |
References
- Dweck, M. R., Boon, N. a, Newby, D. E. Calcific aortic stenosis: a disease of the valve and the myocardium. J Am Coll Cardiol. 60 (19), 1854-1863 (2012).
- Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: Pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111, 3316-3326 (2005).
- Mohler, E. R., Gannon, F., Reynolds, C., Zimmerman, R., Keane, M. G., Kaplan, F. S. Bone formation and inflammation in cardiac valves. Circulation. 103 (11), 1522-1528 (2001).
- Monzack, E. L., Masters, K. S. Can valvular interstitial cells become true osteoblasts? A side-by-side comparison. J Heart Valve Dis. 20 (4), 449-463 (2011).
- Osman, L., Yacoub, M. H., Latif, N., Amrani, M., Chester, A. H. Role of human valve interstitial cells in valve calcification and their response to atorvastatin. Circulation. 114 (Suppl 1), (2006).
- Gu, X., Masters, K. S. Role of the Rho pathway in regulating valvular interstitial cell phenotype and nodule formation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 300 (2), H448-H458 (2011).
- Rodriguez, K. J., Masters, K. S. Regulation of valvular interstitial cell calcification by components of the extracellular matrix. J Biomed Mater Res A. 90 (4), 1043-1053 (2009).
- Rattazzi, M., Iop, L., et al. Clones of interstitial cells from bovine aortic valve exhibit different calcifying potential when exposed to endotoxin and phosphate. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (12), 2165-2172 (2008).
- Zhu, D., Hadoke, P. W. F., et al. Ablation of the androgen receptor from vascular smooth muscle cells demonstrates a role for testosterone in vascular calcification. Sci Rep. 6 (April), 24807 (2016).
- Zhu, D., Mackenzie, N. C. W., Millan, J. L., Farquharson, C., Macrae, V. E. Upregulation of IGF2 expression during vascular calcification. J Mol Endocrinol. 52 (2), 77-85 (2014).
- Latif, N., Quillon, A., et al. Modulation of human valve interstitial cell phenotype and function using a fibroblast growth factor 2 formulation. PLoS ONE. 10 (6), (2015).
- Liu, A. C., Joag, V. R., Gotlieb, A. I. The emerging role of valve interstitial cell phenotypes in regulating heart valve pathobiology. Am J Pathol. 171 (5), 1407-1418 (2007).
- Katwa, L. C., Ratajska, A., et al. Angiotensin converting enzyme and kininase-II-like activities in cultured valvular interstitial cells of the rat heart. Cardiovasc Res. 29 (1), 57-64 (1995).
- Shao, J. S., Cheng, S. L., Pingsterhaus, J. M., Charlton-Kachigian, N., Loewy, A. P., Towler, D. A. Msx2 promotes cardiovascular calcification by activating paracrine Wnt signals. J Clin Invest. 115, 1210-1220 (2005).
- Mackenzie, N. C. W., Zhu, D., Longley, L., Patterson, C. S., Kommareddy, S., MacRae, V. E. MOVAS-1 cell line: a new in vitro model of vascular calcification. Int J Mol Med. 27, 663-668 (2011).
- Kiffer-Moreira, T., Yadav, M. C., et al. Pharmacological inhibition of PHOSPHO1 suppresses vascular smooth muscle cell calcification. J Bone Miner Res. 28, 81-91 (2013).
- Cui, L., Rashdan, N. A., et al. End stage renal disease-induced hypercalcemia may promote aortic valve calcification via Annexin VI enrichment of valve interstitial cell derived-matrix vesicles. J Cell Physio. , (2017).
- Tsang, H., et al. Exploiting novel valve interstitial cell lines to study calcific aortic valve disease. Mol Med Rep. , In press (2017).
