Summary
Этот протокол описывает изоляции, культуры и кальцификации крыса производные клапан интерстициальных клеток, модель высокой физиологической в пробирке calcific аортального клапана болезни (CAVD). Эксплуатация этой модели крыса облегчает CAVD исследований в изучении клеток и молекулярные механизмы, которые лежат в основе этого сложного патологического процесса.
Abstract
Заболевание calcific аортального клапана (CAVD) характеризуется прогрессивного утолщение листовки аортального клапана. Это состояние часто встречается в пожилых людей и терминальной стадии почечной болезни (ТПН) пациентов, которые часто страдают от hyperphosphatemia и гиперкальциемии. В настоящее время есть нет лекарства терапии, которые могут остановить его прогрессирования. Механизмы, которые лежат в основе этого патологического процесса остаются неясными. В листовке аортального клапана состоит из тонкого слоя клапан эндотелиальных клеток (VECs) на внешних поверхностях аорты бугров, с клапаном интерстициальных клеток (ВМКС) зажатой между VECs. Использование модели крыс позволяет в vitro исследования эктопической кальцификации основе в vivo выкидышей сыворотки фосфат (Pi) и уровни кальция (Ca) пациентов, которые страдают от hyperphosphatemia и гиперкальциемии. Протокола описаны подробности изоляции чистой крыса Вик населения как показано выражение Вик маркеров: альфа гладких мышц актина (α-SMA) тканей и виментин фактор роста бета (TGFβ) 1 и 2 и отсутствие Кластер дифференцировки (CD) 31, VEC маркер. Расширяя эти Викс, биохимических, генетических и тепловизионные исследования может выполняться для изучения и разгадать ключевых посредников, лежащие в основе CAVD.
Introduction
Здоровые аортальный клапан состоит из три листовки, которые одинаково распределяется распределения механического напряжения во время открытия и закрытия клапана. В листовке клапан имеет определенную структуру трех отдельных слоев: fibrosa, spongiosa и ventricularis, какой дом клапана интерстициальных клеток (ВМКС) как тип преобладает ячейки. Эти три слоя зажатой между двумя кроватями клапан эндотелиальных клеток (VECs)1.
Викс играют решающую роль в прогрессировании из Calcific аортального клапана кальцификации (CAVD), наиболее распространенные заболевания клапанов сердца в западном мире. CAVD описывается как прогрессивный условие, которое активно регулируется клапанной ткани и его окружающие микроокружения. Клеточные изменения первоначально вызывают фиброзных утолщение и в конечном итоге обширные кальцификации клапана аорты листовок. Это затем приводит к значительным аортального клапана стенозом и в конечном счете, левый желудочков отток непроходимость2, оставляя хирургические клапана как единственной жизнеспособной лечения.
Патофизиология CAVD является сложным, но разделяет аналогичные механизмы физиологического кости минерализация3. Хотя ряд исследований продемонстрировали способность Викс пройти Остеогенные транс дифференциация и кальцификации4,5, механизмы, лежащие в основе этого процесса еще не полностью раскрыты, подсветка важнейшее требование для модели осуществимым и соответствующие в vitro CAVD.
Предыдущая работа ряда лабораторий успешно изолированные Викс моделей свинину и говядину и культивировали эти клетки под большеклеточная условия6,,78. Из-за большого размера аортального клапана в этих моделях изоляции клеток путем ферментативного пищеварения был весьма эффективным в деле генерирования чистого популяции клеток. Однако эти модели могут быть ограничительный из-за ограниченного числа молекулярных инструменты для крупных видов животных. В отличие от грызунов модели по-прежнему выгодно из-за относительно низкой цене, потенциал для генетических манипуляций и обширный массив молекулярных инструменты, которые легко доступны. Однако изоляции Викс от мелких животных моделей не используется широко, которая является скорее всего следствием трудностей, возникших при работе с образцами небольших ткани.
Этот подробный протокол сообщает всеобъемлющий метод для прямого изоляции крыса Викс. Путем тщательного вскрытия клапана, последовала серия ферментативного пищеварения Викс могут быть изолированы и заняты в самых разнообразных экспериментальных методов, включая клетки культуры, кальцификации и ген выражение. Эта модель весьма актуальным в vitro CAVD несомненно сделает существенный вклад в расширение наших знаний этого патологического процесса.
Protocol
Все эксперименты на животных были утверждены Комитетом пользователей института Рослина животных, а животные были сохранены в соответствии с домашнего офиса (Великобритания) руководящие принципы для ухода и использования животных. Для протокола, описанные ниже были использованы крысах Sprague-Dawley 5 - неделя старый, мужчина.
1. Реагент рецепты
- Подготовка питательной среды с помощью Дульбекко изменение средних орла (DMEM) и питательной смеси F-12 (DMEM/F12). Добавьте 10% стерилизации тепло инактивированная плода бычьим сывороточным (ФБС) и гентамицин 1%.
- Подготовьте кальцификации среднего с использованием питательной среды и 2,7 мм Ca/2.5 мм Pi.
- Подготовьте 1 M кальция хлорид (2CaCl) путем взвешивания, 555 мг CaCl2 и растворяют в 5 мл дистиллированной воды, чтобы сделать 5 мл CaCl 1 М2. Фильтр решение через фильтр шприц 0,22 мкм для стерилизации решения.
- Подготовьте фосфат натрия 1 М , весом 710 мг безводный двуосновной фосфат натрия (Na2HPO4) и 600 мг безводный монокальций фосфат натрия (NaH2PO4), растворяют отдельно в 5 мл дистиллированной воды. Объединить 3870 мкл Na2HPO4 и 1130 мкл NaH2PO4, и фильтра через фильтр шприц 0,22 мкм для стерилизации решения.
- Подготовьте мыть буфера содержащие Хэнка сбалансированный соли раствора (HBSS) и 1% гентамицина.
2. Подготовка вскрытия капота
- Выполните все вскрытия в вентилируемых капот, ранее вылечить с 70% этанола для обеспечения стерильности проб и реагентов.
- Стерилизация инструментов рассечение автоклавирования, которую их последующим погружением советы инструменты в стакан, содержащие 70% этанол до использования.
- Подготовить мензурки, содержащий буфер мыть и замочить рассечение инструменты в буфере мыть перед нагретые животного или тканей. Держите мыть буфера на льду во все времена.
3. Добыча первичных крыса Викс
Примечание: Для протокола, описанные ниже, были использованы крысах Sprague-Dawley 5 - неделя старый, мужчина.
- Отбирать крысы (~ 100 g), шейки матки дислокации в соответствии с руководящими принципами UK Home Office.
- Для того чтобы рассечь, сердце каждого крыса, поместите животное лежа на доске рассечение стекла и дезинфекции кожи путем распыления с 70% этиловом спирте.
- Сделайте 4 см разрез в срединной крыс с помощью Рассечение ножницами, чтобы разоблачить брюшной полости и тщательно удалить грудной клетки и легких, подвергать сердце.
- Удаление сердце с парой острых, Весна изогнутые ножницы и хранить расчлененных сердце лед холодной мыть буфера до тех пор, пока все грубые Анатомирование крысы являются полными.
- Микро-анализировать каждое сердце, передачи, последний в чашке Петри охваченных мыть буфера. Трим сердечной мышцы с весны прямые ножницы (6 мм лезвие) налево с небольшой окрестности восходящей части аорты и корня аорты.
- Используя тот же Весна прямые ножницы (лезвие 6 мм), тщательно разрезали восходящей части аорты в направлении левого желудочка и разоблачить листовки аортального клапана.
- Передача открытых аорты в свежий, стерильные Петри, наполненный HBSS. Вскрыть листовок аортального клапана, отмечен их уникальная форма «U» на базе аорты, с беззаботными типа Капсулотомия микро-ножницы (лезвие 3 мм).
- Храните все листовки в 1 мл, лед холодной мыть буфера в 1,5 мл microcentrifuge трубку до тех пор, пока все вскрытия полностью.
- После того, как были собраны все листовки, центрифуга их в 100 г x 1 мин на 4 ° C для удаления буфера мытья.
- Последующие действия в капюшоне культуры клеток для стерилизации. Чтобы удалить VECs, дайджест листовки в 100 мкл 425 ед/мл коллагеназы II 5 минут при 37 ° C. Нарушить пищеварение, мягко закупорить вверх и вниз с помощью кончика пипетки 200 мкл.
- Центрифуга на 100 x g 30 s Пелле листовки и тщательно удалить супернатант. Мыть два раза с 500 мкл буфера мыть и повторно Пелле клетки центрифугированием в g 100 x 30 s.
- Урожай Викс из листовки, дайджест с 100 мкл 425 ед/мл коллагеназы II 2 h, а затем отпустите Викс, мягко закупорить вверх и вниз с помощью кончика пипетки 200 мкл.
- Разбавьте коллагеназы II 19 мл питательной среды и центрифуги на 670 x g за 5 мин до Пелле Викс и остальные клапан листовка мусора. Отменить супернатанта и передавать листовки и Викс культуры пластины/колбы соответственно (Таблица 1).
- Культура Викс для 5-7 дней в культурной среде, до тех пор, пока confluency достигается при 37 ° C, в присутствии 5% (двуокись углерода) CO2, изменив носитель после 72 ч. Для последующего использования в экспериментах в пробирке проход до 5 раз после confluency достигает 100%.
4. индукция кальцификации крыса Викс
Примечание: Для всех экспериментов, подсчитать ячейки с Горяева.
- Выполнение всех клеток первичного посева и пассированый в стерилизованные вытяжки для предотвращения загрязнения. Для подготовки первичной крыса Викс в vitro кальцификации экспериментов, семян клетки на плотность 150 000 клеток/хорошо в 6-ну пластины. Сохраняйте в среде культуры до ≥ 90% confluency (обычно 72 ч).
- Лечить Викс с кальцификации против управления среднего и инкубировать при 37 ° C, при наличии 5% CO2, для дополнительного 72 ч.
- Для изучения Кальцифицированный первичной крыса Викс для последующего анализа, ниже по течению, удалите средство кальцификации/управления и мыть монослои с мыть буфер для удаления ионов Ca и Pi не связанный.
5. крыса Вик характеристика
- Для иммуноокрашивания для наблюдения за фенотипические маркеры, такие как виментин и α-SMA, семя крыса Викс на плотности 150000 клеток/хорошо в 6 скважин пластин, содержащих скользит крышка (клетки будут расти на поверхность скользит крышка) и оставить расти до 50% confluency.
- Аспирационная питательной среды и исправить монослои ячейки с параформальдегида 4% (PFA) для 10 мин перед промыванием их в 3 раза-фосфатный буфер (PBS), 5 минут каждый раз.
Предупреждение: PFA токсичных и должны быть тщательно обработаны. - Инкубировать монослое клеток с блокировки и permeabilization буфера (ПБС, 5% от нормальной сыворотки от того же вида, как вторичное антитело, 0,3% Тритон X-100) за 1 ч при комнатной температуре.
- Проинкубируйте монослои ячейки с анти виментин и кролик анти α-SMA антитела мыши разводили буфером для разбавления проб антитела (альбумина bovine сыворотки 1% + 0,3% Тритон X-100 в PBS) на ночь при 4 ° C, аккуратно покачивая рокер.
Примечание: Негативный контроль состоял из кролика IgG, используя же разведениях как образцы и не спрягаются мыши IgG. - На следующий день смыть первичного антитела 3 раза с PBS, 5 минут каждый раз.
- Инкубируйте монослои клеток с Флюорофор конъюгированных вторичные антитела для 1 ч при комнатной температуре, слегка покачивая на рокер.
- Вымойте 3 раза с PBS и осторожно выщипывать из coverslips (которые содержат крыса Викс) с парой щипцы и место на coverslip, 4', 6-diamidino-2-phenylindole содержащих (DAPI). Оставьте слайды для лечения по крайней мере 24 часа при температуре 4 ° C до визуализации с флуоресцентным микроскопом.
- Для Западный анализ помаркой семян крыса Викс на плотность 150 000 клеток/также в 6 скважин пластин и оставить выращивать в питательной среды до 100% вырожденная.
- Используйте 8 мкг белка для запуска западную помарку для измерения выражение CD31 и исключает любое загрязнение VEC.
Примечание: Стандартный иммуноблоттинга протокол последовал как описано ранее9. - Для исследования генов экстракт рибонуклеиновой кислоты (РНК) с использованием коммерческого комплекта после рекомендации производителя.
- Получать cDNA, с помощью обратной транскрипции для измерения выражение генов-мишеней, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и ПЦР в реальном времени (RT-PCR; также известен как ПЦР) с зеленым Флюорофор обнаружения, с помощью Gapdh как ссылка ген, как ранее описал10.
- Используйте следующую программу для анализа ПЦР: 1 цикл 94 ° C на 3 мин, 30 циклов 94 ° C за 30 сек, 63 ° C за 30 s, 72 ° C для 35 s и наконец 1 цикл 72 ° C за 5 мин.
- Используйте следующую программу для анализа ПЦР: 1 цикл 95 ° C за 10 мин, 40 циклов 95 ° C в течение 15 с, 60 ° C за 1 мин и дополнительного цикла 95 ° c за 1 мин, 55 ° C для 30 s и 95 ° C за 30 s.
- Запуск электрофорез геля для анализа продуктов ПЦР с помощью 2% гель агарозы в буфер Tris/Борат/ЭДТА (КЭ).
6. крыса Вик кальцификации исследования
- Ализарин красный S и кальцификации биохимических исследований пожалуйста, следуйте посева и кальцификации руководящие принципы, описанные в разделе 4.
- Пятно клетки монослои раствором 5% S ализарин красный, нежно покачиваясь на шейкер, за 20 мин. Впоследствии мыть 3 раза с дистиллированной водой, 5 минут каждый раз. Получение изображений каждой скважины.
- Чтобы количественно оценить осаждение Ca, используйте биохимических kit пробирного Ca. Лич Ca2 + ионов с помощью 0,6 М соляной кислоты (HCl) за 24 ч при 4 ° C, с нежным агитации.
- Урожай супернатант и измерения концентрации Ca, с помощью ЦС пробирного комплекта (см. Таблицу материалы) после рекомендации производителя.
- Рассчитайте концентрацию кальция как часть общего клеточного белка. Денатурируйте клеточных белков из клеток монослои с 0,1 М гидроокиси натрия (NaOH) + 0.1% натрия Додециловый сульфат (SDS). Определение концентрации общего белка, с использованием моющего средства совместимы (DC) assay протеина после рекомендации производителя.
Representative Results
Цель этого протокола был описать изоляции первичных крыса Викс и культуры их в vitro кальцификации экспериментов. Используя метод, описанный выше, может успешно изолированные и расширена для изучения механизмов, отвечающих за CAVD крыса Викс.
Крыса первичной Викс локализовать совместно с установленным Вик маркеров:
Вик фенотип изолированных клеток была подтверждена через иммунофлюоресценции зондирование для маркеров Вик: виментин и α-SMA (красный и зеленый, соответственно, рис. 1а) и согласна с предыдущих докладов11,12. Представитель негативный контроль с помощью мыши конъюгированных и кролик IgG показаны на рисунке 1B. Кроме того выражение VIC-роста регулятор TGFβ-1 и TGFβ-2 было подтверждено с помощью ПЦР-анализа (рис. 1 c). Для того чтобы подтвердить что изолированные крыса первичной Викс были свободны от эндотелия загрязнения, Западный анализ помаркой была выполнена для проверки что крысы Викс были отрицательными для маркера эндотелиальных клеток, CD31, с помощью собак митрального VECs как положительный контроль ( Рисунок 1 d).
CA и Pi побудить крыса Вик кальцификации:
Повышенные концентрации системных Ca и/или Pi обычно диск кальцификации Викс в пробирке. Чтобы оценить потенциал кальцификации изолированных крысы Викс, клетки подвергаются повышенные уровни Ca и ПРР, которые имитируют патологических состояний гиперкальциемии и hyperphosphatemia в больных ТПН. Лечение Викс с 2,7 мм Ca/2.5 мм Pi индуцированной кальцификации, как определяется ализарин красный S пятная для Ca осаждения (рисунок 2A) и Колориметрическое определение уровней Ca, после HCl, выщелачивание (81 раз; p < 0,05 с помощью студента t-теста; Рисунок 2B).
Изменения выражения гена, связанные с Вик кальцификации:
Кальцификации сосудов клетки в vitro связан с профилем различных молекулярных. В настоящем исследовании, лечение Викс с 2,7 мм Ca/2.5 мм Pi индуцированной значительное увеличение экспрессии мРНК Остеогенные маркеров: Msh гомеобокс 2, Msx2 (2.04 раз изменения; p < 0.01; Рисунок 3А), щелочной фосфатазы, Alpl (1,49 раза изменений; p < 0,001; Рисунок 3B) и фосфоэтаноламина/фосфохолин фосфатаза, Phospho1 (4,7 раза изменений; p < 0.01 с помощью односторонний дисперсионный анализ; Рисунок 3 c). Однако выражение Остеогенные маркер, Runx2и кальцификации ингибитор ectonucleotide pyrophasphatase, Enpp1, оставалась неизменной (рис. 3D–E).
Рисунок 1. Выражение Вик маркеров. (A) иммунофлюоресценции показаны двойной окрашивание и colocalization актина альфа гладких мышц (α-SMA; зеленый) и виментин в клапан интерстициальных клеток (ВМКС). (B) представитель изображение отрицательных элементов управления с помощью мыши и кролик IgG. Ядер окрашенных в синий с помощью 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Шкалы бар = 50 µm. (C) присутствие преобразования бета фактор роста-1 (TGFβ-1) и TGFβ-2 в Викс (дорожки 1 - 3) Как показано на ПЦР анализа. Переулок 4 является контроль воды. Ссылка ген используется был Gapdh. (D) Западный анализ помаркой показаны обильные выражения CD31 в эндотелиальных клетках собак митрального клапана (VECs) по сравнению с не выражение в Викс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. В vitro кальцификации крысы Викс. Осаждение CA в Викс относились с 2,7 мм Ca/2.5 мм Pi определяется: (A) фотографию ализарин красный S окрашивания клеточных монослои в колодец и (B) Колориметрическое определение Ca уровней после HCl выщелачивания. Студента t-тест был проведен для анализа значения между двумя группами. Результаты представлены как средний ± S.E.M. *p < 0,5 по сравнению с контролем; (n = 4).
Рисунок 3. Изменения выражения гена, связанные с Вик кальцификации. Сгиб изменения экспрессии мРНК Остеогенные маркеров Msx2(A), (B) Alpl, (C) Phospho1, (D) Runx2и (E) Enpp1 в Викс относились с 2,7 мм, Ca/2.5 мм Pi для 48 ч. выражение mRNA показано как раз изменение по сравнению с Джин эндогенного ссылку Gadph. Односторонний дисперсионный анализ, с использованием общей линейной модели, включающих попарного сравнения была выполнена для анализа значения между несколькими группами. Результаты представлены как средний ± S.E.M. **p < 0,01; p < 0,001 по сравнению с контролем; (n = 6). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Количество клапанов листовки | Культура пластины/колба |
| 9-15 | 1 в 12-ну пластины |
| 15-30 | 1 в 6-ну пластины |
| 30 + | T25 |
Таблица 1. Общие руководящие принципы для количество листовок, необходимые для начального заполнения.
Discussion
Этот подробный протокол описывает практический метод для приобретения первичных крыса Викс, включение изоляции эти клетки из клапанов сердца крыс путем ферментативного пищеварения. Далее наш метод поддерживает и расширяет использование сообщалось ранее крыса в vitro модель для изучения аортального клапана кальцификации13. Изоляции Викс от аортальный клапан вводит потенциал для загрязнения от соседних VECs. Однако наши иммунофлюоресценции данные подтверждают, что первоначальный пищеварение шаг достаточно, чтобы удалить VECs, рендеринга изолированных клеток негативные для маркера эндотелиальных клеток, CD31. Кроме того α-SMA пятнать подтверждает активированные фенотип Викс, который необходим для кальцификации12.
Вик изоляции ранее сообщалось в крупных животных моделей6,,78. Однако эти виды сдерживаются ограниченным генетические и молекулярные инструменты для вниз по течению исследования, а также их ограничения доступности в лабораториях во всем мире. В отличие от этого хорошо известны такие инструменты в наличии грызунов и, следовательно, способность изолировать крыса производные Викс позволяет емкостью экспериментальный дизайн больше. Использование Викс из молодых крыс также означает, что клетки являются относительно более пролиферативная, чем старых крыс, поэтому требует меньше животных, чтобы принести больше клеток. Хотя мышей были легко доступны, но из-за мышей имея меньше, особенно сердца, изоляции первичных мыши Викс бы гораздо больше времени и значительно больше животных необходимо будет изолировать же выход клеток как крысы модель.
Значительное преимущество этого описанный подход является, что Викс могут быть изолированы височно от дикого типа и трансгенных крыс, а также модели крыса сердечно-сосудистых заболеваний и клапан травмы. Используя модель крыса потребует большего количества животных для больших масштабах экспериментов, поэтому сократить использование животных, первичный крыса Викс может быть преобразован производить линию клеток после того, как оно характеризуется хорошо.
Хотя широко признаются серьезные клинические последствия CAVD, основополагающих причинных механизмов еще предстоит определить. Кроме того эффективное лечение, методы лечения, которые могут предотвратить и вылечить потенциально кальцификации клапана аорты не доступны в настоящее время. Культура Викс под большеклеточная условий таким образом обеспечивает весьма актуальным в vitro модель CAVD. Мы покажем, что повышенные уровни Ca и Pi побудить в vitro кальцификации изолированных крыса Викс с соответствующим увеличением в выражении Остеогенные генетических маркеров Msx2, Alplи Phospho1. Широко, установлено, что эти маркеры, связанные с патологическим процессом сосудистой кальцификации14,,1516. Поэтому наши данные показывают, что культура крыса Викс в большеклеточная среднего является подходящей модели с которым учиться кальцификации клапана аорты в пробирке. Действительно недавние исследования от нашей лаборатории использовали эту модель, чтобы продемонстрировать, что Ca способствует кальцификации клапана аорты через обогащение Annexin VI Вик производные матрица везикулы17.
Несмотря на преимущества использования крыса Викс и их эффективную квалификацию некоторые ограничения все еще существуют. Во-первых численность населения Вик в крыса клапаны очень мала, и поэтому многие животные необходимы для создания достаточного числа клеток для обширной в vitro исследования. Однако это можно преодолеть это ограничение путем проведения предварительных исследований в увековечен клапан интерстициальных клеток линии, как недавно сообщали нам18и впоследствии использования первичных культур для проверки и расширить эти выводы.
В целом описан метод объясняет успешной изоляции, культуры и кальцификации первичных крыса Викс, которых может впоследствии оцениваться с использованием различных анализов, включая биохимические анализы, а также белка и РНК анализов. Эта модель предлагает надежный и удобный система, в которой расследовать CAVD в пробиркеи представляет собой ценный инструмент для Изучение молекулярных механизмов, ответственных за этой разрушительной болезни.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
CD31 антитела, используемые был щедрый подарок от Доктор Карен Тан, Эдинбургский университет. Это исследование было поддержано финансирование биотехнологии и биологических наук исследовательский совет (СИББН) в виде гранта на Институт стратегической программы (BB/J004316/1; BBS/E/D/20221657) (Вэм и CF), Институт карьеры путь стипендий BB/F023928/1 (ВЭМ) и студенчества финансирование через случай СИББН студенчества BB/K011618/1 (LC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave before use. |
| Spring straight (8 mm blade) | World Precision Instruments | 15905 | Autoclave before use. |
| SuperFine Vannas scissors (5 mm blade, 8 cm) | World Precision Instruments | 14003 | Autoclave before use. |
| Dumont #5 tweezers (11 cm) | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave before use. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
| Foetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Filter before adding to culture medium. |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710049 | |
| Absolute ethanol | Thermo Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in distilled water. |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher Scientific | H1150PB17 | Dilute to 0.6M with distilled water. |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | UN1823 | Dilute to 0.1M with distilled water. |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | 1/250 dilution in antibody dilution buffer. |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | 1/250 dilution in antibody dilution buffer. |
| Superscript II kit | Thermo Fisher Scientific | 18064014 | |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | 18427013 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | P/N58875 | |
| Taq Polymerase kit | Thermo Fisher Scientific | 18038026 | |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) | Thermo Fisher Scientific | AM9863 | Dilute to 1x with distlled water, before use. |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500 | 2% in 1x Tris/Borate/EDTA(TBE). |
| Lysis buffer (RIPA) | Thermo Fisher Scientific | 89900 | |
| T75 flask | Thermo Fisher Scientific | 156472 | |
| T175 flask | Thermo Fisher Scientific | 159920 | |
| qPCR plates | Thermo Fisher Scientific | AB0990 | |
| Rat Msx2 primer | Qiagen | QT01084090 | |
| Rat Alpl primer | Qiagen | QT00190680 | |
| Rat Enpp1 primer | Qiagen | QT00181426 | |
| RNeasy minikit | Qiagen | 74104 | |
| 6-well plates | Sigma | CLS3516 | |
| T25 flask | Sigma | CLS430639 | |
| Monobasic phosphate | Sigma | S5011 | |
| Dibasic phosphate | Sigma | S5136 | |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma | 5030 | Dilute to 0.1% with 0.1M NaOH. |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS. |
| Triton X100 | Sigma | X100 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3059 | |
| Alizarin red S | Sigma | A5533 | Make up to 2% with distilled water, and adjust to pH 4.2. |
| TGFβ-1 primer pair: f: GCTACCATGCCAACTTCTGT r: TGTGTTGGTTGTAGAGGGCA | Sigma | Concentration used: 10 μM | |
| TGFβ-2 primer pair: f: GAAGGCAGAGTTCAGGGTCT r: CGCTGGGTTGGAGATGTTAG | Sigma | Concentration used: 10 μM | |
| Monoclonal Anti-β-Actin−Peroxidase antibody produced in mouse | Sigma | A3854 | 1/50000 dilution in 5% BSA in tris-buffered saline + 0.1% Tween (TBS/T). |
| Mouse anti-vimentin antibody | Sigma | v6389 | 1/900 dilution in antibody dilution buffer (1x phosphate buffered saline (PBS), 1% bovine serum albumin (BSA), 0.3% Triton X-100). |
| Mouse IgG | Sigma | I5381 | Diluted to the same stock concentration as mouse anti-vimentin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer. |
| Rabbit IgG | GeneTex | GTX35035 | Diluted to the same stock concentration as rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer. |
| Rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody | Abcam | ab5694 | 1/200 dilution in antibody dilution buffer. |
| Rabbit anti-CD31 | Abcam | ab28364 | 1/50 dilution in 5% BSA inTBS/T. |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Dako | P0448 | 1/3000 dilution in in 5% BSA in TBS/T. |
| Collagenase II | Worthington | 41512862 | Adjust to 425 U/mL with distilled water, and then filter. |
| SYBR green mastermix | Primerdesign | PrecisionPLUS-MX-SY | |
| Calcium assay kit | Randox | CA590 | |
| DC protein assay kit | Bio-Rad | 5000111 | |
| ECL reagent | GE Healthcare | RPN2109 | |
| Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906837 | |
| Nitrocellulose membrane | GE Healthcare | 10600007 | |
| PCR ladder | Bioline | BIO-33057 | |
| Loading dye for gel electrophoresis | New England Biolabs | B7025S | |
| Syringe filters (0.22 μm) | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Coverslips | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3100 | |
| Hematocytometer | Marienfeld Superior | 640030 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera set up for Alizarin red images: | |||
| Camera | Nikon D800 | ||
| Lens | Nikon AF_s Micro, Nikko 105 mm, 1:2.8 GED | ||
| Dissection forceps 10 cm, curved ends | World Precision Instruments | 15915 | Autoclave before use. |
References
- Dweck, M. R., Boon, N. a, Newby, D. E. Calcific aortic stenosis: a disease of the valve and the myocardium. J Am Coll Cardiol. 60 (19), 1854-1863 (2012).
- Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: Pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111, 3316-3326 (2005).
- Mohler, E. R., Gannon, F., Reynolds, C., Zimmerman, R., Keane, M. G., Kaplan, F. S. Bone formation and inflammation in cardiac valves. Circulation. 103 (11), 1522-1528 (2001).
- Monzack, E. L., Masters, K. S. Can valvular interstitial cells become true osteoblasts? A side-by-side comparison. J Heart Valve Dis. 20 (4), 449-463 (2011).
- Osman, L., Yacoub, M. H., Latif, N., Amrani, M., Chester, A. H. Role of human valve interstitial cells in valve calcification and their response to atorvastatin. Circulation. 114 (Suppl 1), (2006).
- Gu, X., Masters, K. S. Role of the Rho pathway in regulating valvular interstitial cell phenotype and nodule formation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 300 (2), H448-H458 (2011).
- Rodriguez, K. J., Masters, K. S. Regulation of valvular interstitial cell calcification by components of the extracellular matrix. J Biomed Mater Res A. 90 (4), 1043-1053 (2009).
- Rattazzi, M., Iop, L., et al. Clones of interstitial cells from bovine aortic valve exhibit different calcifying potential when exposed to endotoxin and phosphate. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (12), 2165-2172 (2008).
- Zhu, D., Hadoke, P. W. F., et al. Ablation of the androgen receptor from vascular smooth muscle cells demonstrates a role for testosterone in vascular calcification. Sci Rep. 6 (April), 24807 (2016).
- Zhu, D., Mackenzie, N. C. W., Millan, J. L., Farquharson, C., Macrae, V. E. Upregulation of IGF2 expression during vascular calcification. J Mol Endocrinol. 52 (2), 77-85 (2014).
- Latif, N., Quillon, A., et al. Modulation of human valve interstitial cell phenotype and function using a fibroblast growth factor 2 formulation. PLoS ONE. 10 (6), (2015).
- Liu, A. C., Joag, V. R., Gotlieb, A. I. The emerging role of valve interstitial cell phenotypes in regulating heart valve pathobiology. Am J Pathol. 171 (5), 1407-1418 (2007).
- Katwa, L. C., Ratajska, A., et al. Angiotensin converting enzyme and kininase-II-like activities in cultured valvular interstitial cells of the rat heart. Cardiovasc Res. 29 (1), 57-64 (1995).
- Shao, J. S., Cheng, S. L., Pingsterhaus, J. M., Charlton-Kachigian, N., Loewy, A. P., Towler, D. A. Msx2 promotes cardiovascular calcification by activating paracrine Wnt signals. J Clin Invest. 115, 1210-1220 (2005).
- Mackenzie, N. C. W., Zhu, D., Longley, L., Patterson, C. S., Kommareddy, S., MacRae, V. E. MOVAS-1 cell line: a new in vitro model of vascular calcification. Int J Mol Med. 27, 663-668 (2011).
- Kiffer-Moreira, T., Yadav, M. C., et al. Pharmacological inhibition of PHOSPHO1 suppresses vascular smooth muscle cell calcification. J Bone Miner Res. 28, 81-91 (2013).
- Cui, L., Rashdan, N. A., et al. End stage renal disease-induced hypercalcemia may promote aortic valve calcification via Annexin VI enrichment of valve interstitial cell derived-matrix vesicles. J Cell Physio. , (2017).
- Tsang, H., et al. Exploiting novel valve interstitial cell lines to study calcific aortic valve disease. Mol Med Rep. , In press (2017).
