चूहा प्रत्यारोपण भ्रूण से स्टेम सेल लाइनों के व्युत्पत्ति
Summary
यह आलेख वर्णन करता है कि एक प्रोटोकॉल कुशलता से प्राप्त करने के लिए और संस्कृति pluripotent ब्लास्टोसिस्ट मंच पर माउस भ्रूण से स्टेम सेल लाइनों ।
Abstract
माउस भ्रूण स्टेम सेल (mESC) व्युत्पत्ति प्रक्रिया है जिसके द्वारा pluripotent कोशिका लाइनों आरोपण भ्रूण से स्थापित कर रहे हैं । इन पंक्तियों को या तो स्वयं को नवीनीकृत करने या विशिष्ट परिस्थितियों के तहत अंतर करने की क्षमता को बनाए रखने । इन गुणों के कारण, mESC अपक्षयी चिकित्सा, रोग मॉडलिंग, और ऊतक इंजीनियरिंग की पढ़ाई में एक उपयोगी उपकरण हैं । यह आलेख उच्च व्युत्पत्ति क्षमता (60-80%) के साथ mESC लाइनों को प्राप्त करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन करता है संवर्धन blastocysts द्वारा फीडर कोशिकाओं पर स्वतंत्र माउस उपभेदों से निर्धारित माध्यम ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक के साथ पूरक । प्रोटोकॉल भी कुशलतापूर्वक गैर स्वतंत्र माउस उपभेदों से mESC लाइनों प्राप्त करने के लिए लागू किया जा सकता है, व्युत्पत्ति मध्यम (2i माध्यम) के लिए दो छोटे-अणु अवरोधकों के एक कॉकटेल के सरल अलावा द्वारा । तैयारी और फीडर कोशिकाओं, संग्रह और माउस भ्रूण की संस्कृति, और व्युत्पत्ति और mESC लाइनों की संस्कृति की संस्कृति पर विस्तृत प्रक्रियाओं प्रदान की जाती हैं । इस प्रोटोकॉल विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है और बुनियादी स्तनधारी सेल संस्कृति विशेषज्ञता के साथ किसी भी प्रयोगशाला में किया जा सकता है ।
Introduction
भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESC) pluripotent भ्रूण, जो या तो स्व-नवीनीकरण या विशिष्ट शर्तों के तहत अंतर करने की क्षमता को बनाए रखने से व्युत्पंन है1। इन गुणों के आधार पर, ESC अपक्षयी चिकित्सा, रोग मॉडलिंग, और ऊतक इंजीनियरिंग अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण बन गए हैं2.
ESC पहली बार आरोपण माउस भ्रूण से व्युत्पंन किए गए थे, कम सफलता3,4के साथ माउस ESC (mESC) लाइनों उद्भव । साल के लिए, व्युत्पत्ति क्षमता कम बने रहे इन विट्रो मेंpluripotency बनाए रखने की कठिनाई के कारण । फीडर कोशिकाओं की उपस्थिति के अलावा5, जो व्युत्पत्ति दक्षता में सुधार, कॉलोनी लगाव को बढ़ावा देने, और karyotypic स्थिरता को बढ़ाने6, प्रोटोकॉल के कई संशोधनों pluripotency रखरखाव में एक सुधार करने के लिए सीसा । सबसे महत्वपूर्ण लेकिमिया निरोधात्मक फैक्टर (लिफ) के अलावा mESC संस्कृति मध्यम7,8, 129S2 स्वतंत्र पृष्ठभूमि9 से भ्रूण के उपयोग और माध्यम से पूरक के साथ mESC की संस्कृति थे परिभाषित सीरम, संभावित भेदभाव कारकों से मुक्त10। हाल ही में, सम्मोहक सबूत दिखाया गया है कि mESC संस्कृति माध्यम (2i के रूप में जाना जाता है) के लिए संकेत रास्ते के दो छोटे-अणु मॉडुलन के एक कॉकटेल के अलावा pluripotency बनाए रखने के लिए सबसे अच्छा है. 2i कॉकटेल खल्क अवरोध करनेवाला PD0325901 का एक संयोजन के होते हैं, जो mitogen-सक्रिय प्रोटीन कळेनासे (MAPK) मार्ग, और GSK3β अवरोधक CHIR99021, जो कम घनत्व पर सेल अस्तित्व को बढ़ाता है को बाधित करके भेदभाव संकेतों को कम कर देता है Wnt मार्ग को सक्रिय करके11.
वर्तमान आलेख में, हम कुशलता से माउस blastocysts से mESC रेखाओं को प्राप्त करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन है । हम मानक प्रक्रियाओं, व्युत्पत्ति माध्यम में फीडर कोशिकाओं पर स्वतंत्र उपभेदों से संवर्धन भ्रूण लिफ और एक सीरम प्रतिस्थापन12के साथ पूरक का पालन करें । इस प्रोटोकॉल के बाद, mESC लाइनों 2i माध्यम में प्राप्त उन लोगों के बराबर क्षमता के साथ प्राप्त किया जा सकता है । इसके बावजूद, 2i pluripotency रखरखाव या गैर स्वतंत्र उपभेदों के साथ काम करने के साथ संभावित समस्याओं से बचने के लिए जोड़ा जा सकता है ।
Protocol
नीचे दिए गए अनुभागों में वर्णित पशुओं के उपयोग को Universitat औत & #242 के पशु और मानव अनुसंधान पर आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है; noma de बार्सिलोना और Departament d & #39; Agricultura, रामदेरिया, पेसका i Generalitat de Catalunya (प्रोटोकाल #8741) क?…
Representative Results
Discussion
हालांकि mESC लाइन व्युत्पत्ति एक अच्छी तरह से ज्ञात प्रक्रिया नियमित रूप से कई प्रयोगशालाओं में प्रयोग किया जाता है, अपनी क्षमता के रूप में उच्च नहीं है हमेशा के रूप में कई कारकों है कि pluripotency रखरखाव परेशान…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम जोनाटन लुकास फ़ीड सेल संस्कृति, Servei Estabulari de la UAB के लिए पशु देखभाल और Domènec मार्टिन वीडियो रिकॉर्डिंग के लिए के साथ अपने तकनीकी सहायता के लिए धंयवाद । इस काम Ministerio de Economia y Competitividad AGL2014-52408-R और Generalitat de Catalunya २०१४ SGR-५२४ द्वारा समर्थित किया गया है । MVC एक PIF-UAB फैलोशिप के लाभार्थी है ।
Materials
| 1 mL sryringe | BD | 309628 | |
| 2-β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350-010 | |
| 4-well plate | Thermo Scientific Nunc | 176740 | |
| Acidic Tyrode's solution | Home-made | See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4ºC. Alternatively, for long-term storage keep it at -20ºC. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M. | |
| BSA | Sigma | A3311 | |
| Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488 | Molecular Probes – Invitrogen | A-21200 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, αSMA and AFP mouse antibodies. |
| CHIR990212 | Axon Medchem | 1386 | Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
| CryoTube | Thermo Scientific Nunc | 3754518 | |
| DMSO | Sigma | 41640 | |
| DMEM | BioWest | L0107 | |
| FBS | BioWest | S1810 | Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56ºC. Aliquot and store at -20ºC |
| Flushing needle | BD | 304000 | Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone |
| Gelatin from porcine skin | Fluka | 48724 | Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month. |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594 | Molecular Probes – Invitrogen | A-11037 | 1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody. |
| HBSS | BioWest | L0611 | |
| Hepes-buffered CZB | Home-made | See composition in Chatot et al, 1989 | |
| Human chorionic gonadotropin | Divasa-Farmavic | Veterin-Corion 3000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
| Human foreskin fibroblasts | ATCC | ATCCSCRC-1041 | For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen. |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20ºC (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles. |
| KSOMaag Evolve | Zenith Biotech | ZEKS-050 | Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37ºC and 5% CO2 a day prior to use. |
| Leukemia Inhibitory Factor | Merk Millipore | ESG1106 | |
| Mice | Charles River/Harlan | It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor. | |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | Embryo tested. Photosensitive. |
| Mitomycin C | Serva | 2980501 | Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4ºC protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer. |
| Mouse anti-tubulin β III (Tuj1) | Biolegend | MMS-435P | 1:500 dilution |
| Mouse monoclonal anti-αSMA | Sigma | A5228 | 1:200 dilution |
| Mouse monoclonal anti-AFP | R&D Systems | MAB1368 | 1:50 dilution |
| Mouse monoclonal anti Oct3/4 | Santa cruz | Sc-5279 | 1:50 dilution |
| Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-035 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | 1408 | Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20ºC. Avoid freeze and thaw cycles. |
| Petri dish (35mm) | Thermo Scientific Nunc | 153066 | |
| Petri dish (60mm) | Thermo Scientific Nunc | 150288 | |
| Pregnant mare's serum gonadotropin | Foligon | Foligon-1000 UI | Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20ºC for up to two months. Once thawed do not freeze again. |
| Rabbit policlonal anti-Sox2 | Merck Millipore | AB5603 | 1:200 dilution |
| T75 falcon | Thermo Scientific | 130190 | |
| Trypsin-EDTA 10x | BioWest | X0930 | Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution |
References
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