Summary
שיטה לניתוח spectrometric המוני של פפטידים אנדוגני האנושי נוזל מוחי שדרתי (CSF) מוצג. על ידי העסקת משקל מולקולרי ניתוק סינון, fractionation קדם כרומטוגרפי, המוני spectrometric ניתוח ושילוב עוקבות של פפטיד זיהוי אסטרטגיות, ניתן היה להרחיב את peptidome CSF ידוע כמעט כוחנו לעומת על מחקרים קודמים.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר שיטה שפותחה כדי לזהות פפטידים אנדוגני האנושי נוזל מוחי שדרתי (CSF). למטרה זו, שיטה שפותחה בעבר מבוסס על סינון ניתוק (MWCO) משקל מולקולרי, ניתוח spectrometric המוני היה בשילוב עם שלב טרום fractionation HPLC מנותק גבוהה pH שלב הפוכה.
הפרשת לתוך CSF הוא השביל הראשי הסרה של מולקולות לשפוך על ידי תאים של מערכת העצבים המרכזית. לפיכך, תהליכים רבים במערכת העצבים המרכזית משתקפים CSF, טיוח זה נוזל אבחון יקר. CSF יש קומפוזיציה מורכב, המכיל חלבונים המתפרסים על פני טווח הריכוז של 8-9 סדרי גודל. מלבד חלבונים, מחקרים קודמים הדגימו גם הנוכחות של מספר גדול של פפטידים אנדוגני. בעוד פחות בהרחבה למד מאשר חלבונים, אלה בחובו גם עניין פוטנציאלי כמו סמנים ביולוגיים.
פפטידים אנדוגני הופרדו מן התוכן חלבון נוזל מוחי-שדרתי דרך סינון MWCO. על-ידי הסרת רוב תכולת החלבון של המדגם, זה אפשרי להגדיל את האחסון מדגם למד, ובכך גם את הסכום הכולל של פפטידים אנדוגני. המורכבות של התערובת פפטיד בפילטר קיבל פניות כולל שלב הפוכה (RP) HPLC fractionation שלפני שלב ב- pH בסיסי לפני ניתוח LC-MS. Fractionation היה בשילוב עם ערכת שרשור פשוט שבו היו שברים 60 איחדו לתוך 12, ניתוח זמן הצריכה ובכך יופחת תוך הימנעות עדיין במידה רבה • תנאי שיתוף.
זיהוי אוטומטי פפטיד בוצעה באמצעות שלושה שונים אלקטרופיזיולוגיה זיהוי תוכנות ו לאחר מכן ומשלב את התוצאות. תוכניות השונות היו משלימים ולא דומה עם פחות מ 15% ההזדהויות חפפו בין שלוש.
Introduction
סמנים ביולוגיים בנוזל מוחי שדרתי (CSF) הם בחקר כעת לתוך הפרעות ניווניות. של מחלת האלצהיימר, הפרעה ניווניות הנפוץ ביותר, משפיע על מעל ל-60 מיליון אנשים ברחבי העולם1,2, שלישיה סמן המורכב של פפטיד בטא עמילואיד, ייצוב ליבות microtubule חלבון טאו, ו- a phosphorylated טאו טופס, ניתן לזהות את המחלה עם רגישות גבוהה, כבר נכלל קריטריונים אבחון מחקר3. מחלות ניווניות אחרות, כגון מחלת פרקינסון, טרשת נפוצה, פרוטיאומיה מבנית מחקרים זיהו סמן מועמדים רבים, שחלקם נמצאים כעת תחת הערכה מחקרים קליניים4,5 ,6.
לצד חלבונים, CSF מכיל גם שפע של פפטידים אנדוגני7,8,9,10,11,12. המהוות מוצרים המחשוף של חלבונים רבים נגזר המוח, פפטידים אלה מייצגים גם מקור פוטנציאלי חשוב של סמנים למחלת. כדי להגדיל את המלאי של פפטידים אנדוגני מזוהה ב- CSF אנושי ולאפשר CSF ניתוחים endopeptidomic במחקרים קליניים, פותחה שיטה עבור הכנת הדוגמא וניתוח LC-MS (ערכה פרוטוקול קצר כבר נכלל באיור 1 ). היישום של שיטה זו של מחקר שנערך לאחרונה הביא הזיהוי של פפטידים CSF אנדוגני כמעט 16,400 במאגר דגימות נוזל מוחי-שדרתי מאנשים שונים שאינם ספציפיים אבחון, מרחיבה endopeptidome CSF ידוע ten-fold13. השיטה לחלופין ניתן בשילוב עם הגישה isobaric תוויות על כימות.
הכנת הדוגמא
המקור העיקרי של מסת חלבון ב- CSF הוא המרכיבים פלזמה (למשל אלבומין ו- immunoglobulins) שהעביר את הדם במוח מכשול14,15. שפע גבוהה שלהם הסלים זיהוי הדגימה נמוך-בשפע, המוח-derived רכיבים. פפטידים אנדוגני ניתן להפריד בקלות מן החלבונים גבוהה-בשפע, ובכך לאפשר נפח גדול יותר באופן משמעותי של CSF תמצית פפטיד שישמש עבור ניתוח LC-MS, ובכך מאפשר זיהוי של פפטידים התחתונה-בשפע.
פרוטוקול המובאת כאן, משקל מולקולרי סינון ניתוק (MWCO) שימשה להפריד את פפטידים CSF השבר חלבון; שיטה בה נעשה שימוש בכמה הקודם מחקרים8,9,10,11,12,16. השלב הסינון בעקבות שלב טרום fractionation RP HPLC מנותק לבצע מעבר הדרגתי שלב ניידות גבוהה pH. על ידי ביצוע שני צעדים RP HPLC, במשולב עם pH להיות ההבחנה העיקרית, ההבדל סלקטיביות בין שני השלבים נובעת בעיקר השמירה פפטיד שינו בעקבות הברית תשלום פפטיד שונים. היישום של פפטיד גבוהה pH fractionation מראש לפני LC-MS בתנאים חומציים הוכח יעיל בהגדלת פפטיד זיהוי17,18, ולהיות אפילו מעולה למטרה זו בביולוגיים מורכבים לעומת יותר ההפרדה אורתוגונלית מצבי19, כגון חתול חזק-ion exchange (SCX) ו- RP20דוגמאות. כדי לקצר את זמן הניתוח, שימש ערכת שרשור, צירוף כל 12th שבר (למשל, שברים 1, 13, 25, 37 ו- 49), אשר בשל הכוח פתרון גבוהה של RP HPLC עדיין במידה רבה להימנע שיתוף • תנאי של פפטידים מ שונה שברים ב- LC-MS שלב20,21.
זיהוי פפטיד
זיהוי פפטיד במחקרים peptidomic שונה מזו של מחקרים פרוטיאומיה מבנית בכך בלי מחשוף אנזים ניתן לציין את חיפוש מסד הנתונים, כתוצאה מכך, זיהוי המחירים הם בדרך כלל נמוך11. מחקר האחרונות13 הראה כי ביותר במחירים זיהוי פפטידים אנדוגני שהושג עם Sequest, הקמע שופרו באופן משמעותי כאשר ברירת המחדל הבקיע אלגוריתם של התוכנה המתאימים שונתה באמצעות החריצים מסתגלת אלגוריתם תאמינו, המציין כי אלגוריתמים הבקיע אופטימלית אנדוגני פפטידים שונים של פפטידים tryptic13. באותו מחקר, זיהוי מבוסס על רצף דה נובו פפטיד אוטומטית באמצעות תוכנה פסגות (BSI) נמצאה להיות משלים מנועי חיפוש מבוססי טביעת אצבע של יון קטע שני, וכתוצאה מכך ערכה גדול יותר באופן משמעותי של מזוהה פפטידים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול המתואר להלן הוא גרסה מעודנת של שימוש במחקר הקודם שבו כמות גדולה של פפטידים אנדוגני אותרו ב- CSF האנושי15. עדכונים הפרוטוקול המקורי לערב שינוי קטן לטיפול כימי קדם CSF, כמו גם אופטימיזציה של המילוי ההדרגתי המשמש עבור fractionation קדם RP HPLC גבוהה pH במצב לא מקוון.
שיקולים אתיים
מחקרים כל החומרים החולה ושליטה שבדי אושרו על ידי ועדות אתיות: רח' גוראן (הפניה למעורר 2005-554-31/3). CSF דגימות עוקבה דמנציה אמסטרדם ודוגמאות שנאספו בבית החולים הלאומי נוירולוגיה, נוירוכירורגיה, לונדון שימשו למחקר עם הסכמה בכתב של כל המטופלים המשתתפים ואישור של ועדות אתיקה אזוריים. החומר כאן מנוצל בעיקר בג'אז שאריות CSF מן דגימות שנלקחו לצורך אבחון וזה היה מבטל את שזוהה בעבר להיכלל בלימודים. אין שום אפשרות של איתור בחזרה את הדגימה לכל התורמים או קבוצה של תורמים.
1. חילוץ של האדם נוזל מוחי שדרתי (CSF):
- תמצית נוזל מוחי-שדרתי דרך מותני (חייב להתבצע על ידי רופא מיומן) באמצעות פרוטוקול מתוקננת22.
- להסיר שאריות תאים וחומרים בלתי מסיסים אחרים על ידי צנטריפוגה-2,500 g x עבור 20 דקות.
- לבדוק חזותית שדרתי עבור שינוי צבע זה עשוי להצביע על זיהום בדם הנובע לנקב דימום. ריכוז חלבון גבוה משמעותית של הדם ואת נוכחותם של פרוטאזות עשוי להשפיע באופן משמעותי את תוצאות אנליטיות.
2. קדם טיפול של CSF (אמצעי אחסון מדגם 1.5 mL, אין כימות):
- הפשרת 1.5 מ של CSF aliquots בטמפרטורת החדר (RT), להעביר את התוכן צינורות פוליפרופילן 10 מ"ל ולהוסיף 80 µL של 1 מ' Triethylammonium ביקרבונט (TEAB) כסוכן חציצה.
- להוסיף 0.65 mL 8 M guanidinium הידרוכלוריד (GdnHCl) (active ריכוז GdnHCl: 2.4 מטר) ו מערבולת בעדינות-RT למשך 10 דקות.
הערה: הסוכן chaotropic, GdnHCl, שני משפיעה על צמיגות הממס, אינטראקציה עם פוליפפטיד, אשר תוצאות חלבון התגלגלות להיות אנרגטית חיובית23. לפיכך, GdnHCl מתמוסס אגרגטים חלבון ומגביר שחזור של פפטידים אנדוגני במהלך סינון עוקבות. - להוסיף 60 µL של 200 מ מ של מימית tris(2-carboxyethyl) הידרוכלוריד פוספין (TCEP) (active ריכוז TCEP: 6 מ מ) דגירה ב 55 ° C עבור h 1 כדי להפחית ציסטאין disulphides.
- להוסיף µL 35 של 400 מ iodoacetamide (רשות העתיקות) (active ריכוז רשות העתיקות: 4 מ מ) דגירה -RT באפלה במשך 30 דקות alkylate cysteines. התוספת של קבוצת אלקיל מבטיחה כי שאריות ציסטאין לא יכול באופן ספונטני טופס גשרים disulphide חדשים בשלב כלשהו במהלך הכנת הדוגמא עוקבות.
- הוסף 3.25 מ של מים מיוננים, מערבולת בקצרה כדי לדלל את הדגימה לפני סינון MWCO, וכתוצאה מכך נפח המדגם של 5.5 mL. שלב זה משמש כדי לדלל את GdnHCl אל מתחת 1 מ' כמו ריכוז גבוה יותר נצפתה לעתים לגרום שטיפת של חומרים פולימריים מן המכשירים מסנן.
3. קדם טיפול של CSF (10 x 150 µL מדגם נפח, כימות Labelling Isobaric):
- להפשיר µL 150 של CSF aliquots מאנשים 10-RT, לאחר מכן להעביר את התוכן בודדים mL 1.5 צנטריפוגה מיקרו נמוך מחייב צינורות ולהוסיף 8 µL של 1 מ' TEAB כסוכן חציצה.
- להוסיף µL 65 של 8 מ' GdnHCl (פעיל ריכוז GdnHCl: 2.4 מטר) ו מערבולת בעדינות-RT למשך 10 דקות.
- להוסיף 6 µL של 200 מ מ של TCEP מימית (ריכוז פעיל TCEP: 6 מ מ), דגירה ב 55 ° C עבור h 1 כדי להפחית ציסטאין disulphides.
- להוסיף 3.5 µL 400 מ רשות העתיקות מימית (ריכוז פעילות רשות העתיקות: 6 מ מ) דגירה -RT וחושך למשך 30 דקות כדי alkylate cysteines.
- הכנת ערכת labelling isobaric (למשל., 10plex טנדם מסה תג isobaric ריאגנט labelling). לאפשר את הבקבוקונים labelling-ריאגנט isobaric להגיע RT לפני פתיחתם כדי להימנע הידרציה ריאגנט מיותרים, להוסיף µL 41 של כיתה HPLC acetonitrile (לחצן מצוקה), לפזר על ידי עצבנות עדין במשך 5 דקות.
- 30 µL של פתרון labelling-ריאגנט isobaric להעביר הדגימה המתאימה, תקופת דגירה של h 1 ב RT תחת עצבנות עדין. Labelling הכימית isobaric כולל קבוצת NHS-אסתר אשר מגיב עם בנוכחות פפטיד N-טרמיני (termini) הראשית אמינים, כמו גם עם משקעים ליזין.
- הוסף 8 µL של 5% hydroxylamine (ריכוז פעיל hydroxylamine: 0.16%) ומנערים בעדינות-RT במשך 20 דקות כדי להרוות את התגובה labelling. מאחר הדגימות שכותרתה בנפרד כדי להיות משולב, להבטיח את תוויות התגובה הוא מתרצה. על ידי תוספת של שפע של קבוצות אמין בצורה של hydroxylamine, הכימית labelling isobaric הנותרים מותר להגיב, ובכך מעובד אינרטי.
- לשלב את התוכן של כל הדגימות ו־7000 10 צינור פוליפרופילן יחידה 15 מ"ל.
- להוסיף 6.4 מ ל מים מיוננים משולב מדגם של מערבולת בקצרה כדי להפחית את ריכוז לחצן מצוקה מ 12% ל-3%, לריכוז GdnHCl GdnHCl אל מתחת 1 מ' כמו ריכוז גבוה יותר נצפתה לעתים לגרום שטיפת של חומרים פולימריים מן המכשירים מסנן.
4. משקל מולקולרי ניתוק סינון
- כדי להסיר את הפוטנציאל מזהמים, בתנאי MWCO מסנן על-ידי טעינת 10 מ"ל של מים 1 מ' GdnHCl 25 מ מ TEAB, צריך שתוציאו למשך 15 דקות ב- 2,500-g ו- RT, למחוק את הזרימה דרך (FT).
- לטעון את אמצעי האחסון מדגם כל מסנן (5 מ ל שאינו מתויג CSF (שלב 2.5) או 10 מ"ל מתויג isobarically CSF (שלב 3.9)), צנטריפוגה במשך 30 דקות-2,500-g ו- RT, להשאיר את הזרימה דרך (FT) בגורם המכיל אוסף. התוצאה של הסינון היא כי פפטידים וחלבונים קטן מופרדים מן שאריות תאים גדול יותר של חלבונים, ממסר. שלב זה ניתן לראות את peptidomic בדומה לשימוש הפרוטאוליטי עיכול חלבונים ליצירת פפטידים בניסויים פרוטיאומיה מבנית.
- לטעון 5 מ של 25 מ מ TEAB (מימית) מסננים, צנטריפוגה למשך 15 דקות ב 2500 x g ו- RT, על מנת להגביר את השחזור של פפטידים.
- מערבולת FTs המשולב מ שני השלבים הקודמים (סה כ 10 מ"ל של שאינו מתויג או מדגם מתויג isobarically 15 mL), והמשך מדגם acidification.
5. דה-המלחה, דוגמה לנקות על ידי מיצוי מעבדתי
- Acidify המדגם מסוננים מהשלב 4.4 לפני מיצוי מעבדתי (SPE). Acidification מבוצע על מנת לשפר את האינטראקציה ממס (פפטיד) עם השלב נייח של SPE-המחסנית.
- עבור המדגם שאינו מתויג (כרך 10 מ ל): להוסיף µL 550 של 1% חומצה Trifluoroacetic (TFA) - הנפח הכולל של המדגם: mL 10.55% 0.05 TFA.
- עבור הדגימה isobaric מתויג (כרך 15 מ"ל): להוסיף 20 מ ל 0.1% TFA acidify, להוריד את ריכוז לחצן מצוקה מ-3% ל 1% - הנפח הכולל של המדגם: 30 מ עם 0.066% TFA.
הערה: TFA מתווספת גם עבור תפקידה בתור ריאגנט בשיוך יון, אשר משפר את השמירה של פפטידים לא עצמם מסוגלים חזק מספיק הידרופובי אינטראקציה עם חומרי האריזה של מיכל הדיו SPE יישמרו. - אם ה-pH > 3, titrate את הדגימה עם 20% חומצה זרחתית עד מדגם ה-ph < 3.
- תנאי מכלי SPE על ידי תוספת של 1 מ"ל של 84% לחצן מצוקה, 0.1% חומצה formic (FA) להשליך רגל חוזר פעם אחת. מיזוג של המסנן מחסנית נדרש להסיר חומרים לא רצויים אשר elute אחרת יחד עם פפטידים בצעדים העוקבים; יתרה מזאת, מיזוג מגביר חדירות של המסנן.
- Equilibrate הדיו SPE על ידי תוספת של 1 מ"ל של 0.1% TFA, למחוק חזור על רגל אחת. להבטיח כי המסנן לא להתייבש לאחר השלב האחרון equilibration - לשמור על נפח קטן מעל המסנן. Equilibration של המסנן מחסנית מבוצע על מנת להכין את המסנן כדי לשמור על פפטידים על-ידי הסרת חומר הידרופובי (acetonitrile) עזב מהשלב מיזוג.
- לטעון מדגם כל אמצעי האחסון (10.55 mL עבור דגימות שאינו מתויג או 30 מ לדוגמאות מתויג isobarically), מספר חלקים במידת הצורך, והנח את רגל לרוץ לתוך. פסולת. ודא כי הדיו לא להתייבש בין מדגם טעינת סיבובים או לאחר האחסון מדגם האחרון נטען - לשמור על נפח קטן מעל המסנן.
- להעביר 1 מ"ל של 0.1% TFA על המסננים כדי להסיר מלחי, ריאגנטים ולמחוק חזור רגל פעם אחת. להבטיח כי המחסנית אינה פועלת יבש לאחר כל שלב כביסה - לשמור על נפח קטן של נוזל על הדיו.
- המקום 1.5 של איגוד נמוך מ ל מיקרו צנטריפוגה צינורות תחת הדיו, elute המדגם על-ידי העברת 1 מ"ל של 84% לחצן מצוקה, 0.1% הפא על הדיו.
- הסר ממיסים את המדגם מלוח מבטל את אידוי ומפרידה ואקום לרוץ ללא חימום פעיל עד יבש, לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס או להמשיך מיד fractionation גבוהה pH.
6. מנותק גבוהה pH להפוך פאזה HPLC מדגם Fractionation
-
להכין שלבים ניידים מימית גבוהה pH (HpH):
HpH מאגר ת מים טהורים
מאגר HpH ב': 84% לחצן מצוקה
מאגר HpH c: 25 מ מ NH4הו
מאגר HpH טעינה: 2.5 מ"מ NH4או 2% לחצן מצוקה
הערה: HpH טעינת מאגר משמש מאגר פתרון ודגימת תחבורה - מחדש להמיס את הדגימה 16 µL HpH טעינת מאגר על ידי עצבנות עדין במשך 20 דקות
- לטעון µL 15 המדגם על מערכת HPLC עם אספן שבר פנימי עבור לוחות 96-עמוק-ובכן מוגדר בהתאם Batth. et al. 20 עם שינוי קטן. Fractionate-זרם של µL 100/דקה מעל עמודה ההפרדה pH-יציב (3.5 סי18 מיקרומטר, 2.1 מ"מ x 250 מ"מ) ולאסוף שבר אחד לכל מין מעבר הדרגתי ליניארי 60 דקות.
- להשתמש את מעבר הזמן-הנקודות הבאות: t = 0 דקות, B = 1%, C = 10%; t = 4 דקות, B = 1%, C = 10%, התחל אוסף שבר; t = 76 דקות, B = 70%, C = 10%; קצה שבר אוסף; t = מין 76.5, B = 85%, C = 10%; t = 80 דקות, B = 85%, C = 10%; t = מין 80.5, B = 1%, C = 10% ו- t = 90 דקות, B = 1%, C = 10%.
- לאסוף את השברים שוב ושוב בבארות 12 בתבנית מעגלית, ובכך שרשור שברים במרווחים קבועים על ידי 12 דקות, וכתוצאה מכך שברים 12, שכל אחד מהם מכיל 6 שברים תת משורשרת.
- להסיר את הממס מדגימות על ידי צנטריפוגה ואקום-RT ו- 3000 סל ד עד יבש, ולאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס לפני ניתוח LC-MS.
7. LC-MS
-
הכן מימית שלבים ניידים:
מאגר ת: 0.1% פא
מאגר ב': 0.1% פא, 84% לחצן מצוקה
טעינת מאגר: 0.05% TFA, 2% לחצן מצוקה
הערה: טעינת מאגר זה משמש פתרון תחבורה, דוגמת המאגר, שלב ניידים עבור המשאבה טעינה. - מחדש להמיס כל אחד השברים 12 על ידי תוספת של 6 µL טעינת מאגר ורעדתי ב RT במשך 20 דקות
- עומס 5 מדגם µL ב- hplc, קורס ננו-flow, הפעלה בתצורת המלכודת עמודה (עמודה מלכודת: 75 ס מ מיקרומטר x 2, C18, 100 Å גודל הנקבוביות, גודל החלקיקים מיקרומטר 3; טור ההפרדה: סי18 מיקרומטר 75 x 500 מ מ, 100 Å גודל הנקבוביות, גודל החלקיקים מיקרומטר 2 , ולבצע הפרדה פפטיד בספיקה של 150 לדקה nL באמצעות מעבר הצבע הבאים: t = 0 דקות, B = 2%; t = 10 דקות, B = 2%; t = 11 דקות, B = 7%; t = 100 דקות, B = 26%; t = 170 דקות, B = 45%; t = 175 דקות, B = 80%; t = מין 181, B = 2%, ו- t = 210 דקות, B = 2%.
-
מבצע MS ספקטרומטר מסה היברידית ברזולוציה גבוהה מחובר על HPLC באמצעות ממשק ננו-ESI. רישום סריקה מלאה ספקטרה במצב MS בקביעה ברזולוציה של 120,000 (2.0e5 AGC יעד) על פני הטווח מ/z 350-1400.
- לנתח את ספקטרומטר מסה במצב רכישת נתונים תלויי, בחר MS/MS ספקטרום של העליון 10 האינטנסיבי ביותר הפסגות עם m/z > 150 ובתוך את עוצמת טווח 1.0e4-1.0e5 לניתוח שבר יון. לבודד קודמן יונים באמצעות חלון בידוד פאול של 1 מ/z, זמן הזרקת מרבי של 100 ms ו- RF העדשה של 60%.
- החלת הדרה דינמי עם תקופה אי-הכללה של 15 s וסובלנות מ/z של ±10 עמודים לדקה. לבצע פיצול התא דיסוציאציה (HCD) גבוה יותר-התנגשות אנרגיה ולהקליט MS/MS רכישות ב- orbitrap-הגדרה ברזולוציה של 50,000 (ערך היעד של אילנה 5.0e4).
8. פפטיד זיהוי
-
עבור זיהוי פפטיד לשלוח .raw-הקבצים שנוצרים מניתוח המוני spectrometric כדי מנוע חיפוש פרוטאומיקס, החלת ההגדרות הבאות:
הערה: קודמות שלנו לומדים15, שלושה מנועי חיפוש; הקמע v 2.4 Sequest HT, פסגות v7.5 שימשו במקביל, להגדרות שצוינו כאן היו מועסקים עבור כל מנועי החיפוש שלושה, אלא אם צוין אחרת. רוב ההגדרות מתכווננת הם אוניברסליים לזיהוי/אלקטרופיזיולוגיה ויש לו הגדרות המתאימות במנוע חיפוש נתון כלשהו.
ספקטרום בורר:
קודמן מינימלית המונים: 350 Da
. מקס. קודמן המונים: 5,000 Da
סוג סריקה: מלא
אות/רעש הסף: 1.5
חיפוש במאגרי רצף
מסד נתונים: UniProt_SwissProt [version2015_11]
טקסונומיה: הומו ספיינס
אנזים: אף אחד
. מקס. התגעגעתי אדמירל: 0
כלי נגינה (הקמע בלבד): מלכודת ESI
אורך פפטיד מינימלית (SequestHT בלבד): 6
. מקס. פפטיד באורך (SequestHT בלבד): 144
רגישות מסה קודמן: 15 עמודים לדקה
קטע רגישות מסה: 0.05 Da
שינויים סטטי: Carbamidomethyl (C); [אם מתויג] TMT10plex (N-כינוי)
שינויים דינאמיים: חמצון (ז); [אם מתויג] TMT10plex (K)
ספקטרום פפטיד להתאים המאמת (PSM)
תאמינו (הקמע ו Sequest HT בלבד) או דמה פיוז'ן (פסגות בלבד)
המטרה רוזוולט: 0.01
אימות מבוסס על: q-ערך
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השיטה המתוארת כאן חלה והיא מחושבת שלושה מחקרים לפני כניסתה של מדגם fractionation קדם (טבלה 1). המחקר הראשון משמש LC מנותק אכון CSF שברים על צלחת היעד MALDI וכתוצאה 730 פפטידים אנדוגני מזוהה11. במחקרים הבאים שני, תוויות isobaric הועסק. בעיקר בתוך פקד/תיק לבחינה וזיהוי הטזה של סמנים ביולוגיים פוטנציאליים ב CSF endopeptidome ו פרוטאום בו זמנית24, בתווית השני המחקר isobaric שימש כדי ניטור הטיפול אפקטים ויוו של מעכב γ-secretase על הביטוי פפטיד ב- CSF מעל 36 h16. חקר מקרה/בקרה אותרו 437 פפטידים אנדוגני, 64 אשר שינו באופן משמעותי בריכוז בין אנשים עם AD ופקדים בריא. השלישי, טיפול המחקר, לזהות פפטידים אנדוגני 1798, 11 של פפטידים תחת פיקוח יכולים יוצג להגיב לטיפול.
במסגרת המחקר הרביעית, המטרה הייתה להגדיל את מספר מזוהה פפטידים CSF, במיוחד כדי לזהות פפטידים התחתונה-בשפע. לכן, פפטיד fractionation מראש על-ידי HpH-RP כרומטוגרפיה נכללה, שימש נפח דגימה CSF 10-fold גדול יותר, והתוצאה היא זיהוי של פפטידים 16,395. במחקר זה, תוויות isobaric לא בוצעה. בנוסף מדגם fractionation, המחקר האחרונה המועסקים מזהה פפטיד משולב מתקרב, ואילו במחקרים שלושת בוצעה רק חיפוש מסד נתונים יחיד, שבו יש כמה חשבונות במידה עבור מספר גדול יותר של פפטידים מזוהה. השוואת התוצאות המתקבלות על ידי מנועי החיפוש בודדים (הקמע, Sequest HT או פיקס) מן המחקר האחרונה מציינת כי האלגוריתמים בשימוש הם במידה מסוימת משלימים מאז סכום קטן יחסית, פחות מ 15% (2440), של פפטידים הם מזוהה על ידי כל מנועי החיפוש שלוש (איור 2). עוד יותר, דה נובו-רצף חיפוש מנוע פיקס היתה הכי יעיל בזיהוי פפטידים אנדוגני, אבל יותר מאשר פפטידים 5,400 לא זוהו רק אם פסגות היה בשימוש (איור 2). היישום של מנועי החיפוש מספר על אותו חומר יש פוטנציאל בבעיות בדיקות מרובות, זה היה מיועד עם בדיקה של נכונות הזיהוי13. הנתונים MS/MS הגולמיים נרכש, כמו גם כל התוצאות המתקבלות פרוטיאומיה מבנית חיפושים מן המשפט האחרונה נעשו זמינים במאגר הנתונים גאווה באמצעות ProteomeXchange עם מזהה PXD004863.
איור 1: ערכה פרוטוקול להמחיש את השלבים העיקריים של שיטת. מיצוי של נוזל על ידי ניקור מותני ואחריו צנטריפוגה כדי להסיר חומר בלתי מסיסים, 2) תוספת של GdnHCl לדגימת מביצועם אגרגטים אלקטרופיזיולוגיה, הגדלת את ההתאוששות של פפטידים אנדוגני; הפחתת ו אלקילציה של ציסטאין disulphides; isobaric תוויות על כימות פפטיד 3 (אופציונלי)) סינון משקל מולקולרי של פפטידים אנדוגני להפריד החלבונים, 4) מיצוי מעבדתי להסיר מלחים אחרים מזהמים קוטבי, 5) RP HPLC fractionation מראש, אלקליין שלב ניידים שיפוע ו שרשור של כל שברה 12, 6) שלב ניידים RP HPLC-MS/MS, חומצי הדרגתי, כל שבר משורשרת לרוץ ברציפות, 7) זיהוי פפטיד שבוצעה על-ידי שליחת נתונים MS/MS כל הרצפים ניתוח 12 כמו דגימה בודדת למנועי החיפוש, לאחר מכן פפטיד מזהי הושוו וסיכומים של כולם ייחודיים פפטיד מזהי בוצעה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| סיכום מחקר | תורה מציון labelling (y/n) | Fractionation HpH-RP (y/n) | נפח המתאימים של CSF לכל MS-אנליזה (µl) | המספר של פפטידים מזוהה | תגובה | הפניה |
| ניתוח peptidome לקטעים של CSF | n | n | 500 | 730 | הכנה היעד LC MALDI מנותק, MALDI-MS; הערכה של מסנני MWCO | 4 |
| השוואה כמותית של פפטידים CSF; דוגמאות 8 לספירה + 8 Ctrl | y | n | 200 | 437 | HPLC-ESI MS; peptidomic משולב ופרוטוקול פרוטיאומיה מבנית | 25 |
| המודעה גמא secretase מעכב טיפול המחקר | y | n | 300 | 1798 | HPLC-ESI MS; CSF מופק בנקודות זמן שש לאחר טיפול | 17 |
| מרחיבה את peptidome CSF | n | y | 750-1000 | 18.031 | HPLC-ESI MS; שילוב של תוכנות זיהוי פפטיד | 15 |
טבלה 1: אוסף של מחקרים שנעשו לאחרונה שבוצעה על-ידי קבוצה זו אשר חל משקל מולקולרי סינון וניתוח spectrometric המוני עבור זיהוי של פפטידים אנדוגני ב- CSF אנושי.
איור 2: דיאגרמת חיתוך קבוצות השוואה בין התוצאות זיהוי פפטיד המתקבל בכל אחד ממנועי החיפוש שלושה קמע, Sequest HT ופסגות- סך של פפטידים אנדוגני 16,395 זוהו. דה נובו-רצף פסגות מנוע חיפוש לזהות פפטידים אנדוגני 10,967; ממנועי החיפוש מבוססי טביעת אצבע שבר-יון הקמע וזיהה Sequest HT פפטידים אנדוגני 8118 ו 7304 בהתאמה. הקונצנזוס זיהוי בין כל מנועי החיפוש שלושה הסתכם 2440 פפטידים אנדוגני, או 14.8%. היה זיהוי גדולה יחסית חפיפה בין הקמע Sequest HT, המקביל ל-70% מכל ההזדהויות פפטיד המשולב שלהם. פסגות היה מזהה קטן יחסית חפיפה עם הקמע והן Sequest HT; 20.5% ל- 18.9% בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המבוא של גבוהה pH RP HPLC fractionation שלפני שלב לפרוטוקול בעבר מפותח עבור שחזור של פפטידים אנדוגני לפי משקל מולקולרי אולטראפילטרציה11 מדגם היחסי מורכבות מופחתת, ובכך למעשה איפשר עבור גדול 5 פי נפח דגימה שילמדו. זה, בתורו, גדל הריכוז של המשנה של פפטידים נוכח כל שבר, ובכך לשפר את הסיכויים של גילוי פפטידים בשפע נמוך.
על ידי ביצוע אסטרטגיית זיהוי עבור אנדוגני פפטידים אשר מועסקים שלושה פרוטיאומיה מבנית תוכנות במקביל, ניתן היה להרחיב את endopeptidome CSF הידוע יותר 10-fold. סך של פפטידים אנדוגני 16,395 אותרו במשפט ראשוני על חומר מדגם CSF במאגר. בין ההזדהויות היו מספר רב של אנדוגני פפטידים שמקורם חלבונים כאמור בהקשר של הפרעות ניווניות. כמה פפטידים שזוהו במחקרים לעיל הם שמחושב כעת כמו סמנים ביולוגיים במעבדה שלנו. תהליך זה כרוך במספר שלבים, כולל אימות זהויות של פפטידים על ידי spiking CSF עם מקבילים סינתטי עם איזוטופים כבדים, הקמת יישוב מבחני המוני spectrometric, הערכת יציבות פפטיד במהלך האחסון, ההקפאה-הפשרה מחזורים ולאחר ניתוח גדודים קליניים שונים.
השינויים בוצעו הפרוטוקול המקורי על מנת למנוע כניסת מזהמים (שלבים 2.5 ו- 3.5) בשל ריכוז גבוה של GdnHCl במדגם במהלך MWCO-סינון. עדכון על מעבר הצבע fractionation קדם (שלב 6.3.1) נעשתה, קיבולת ממושך, ליניארי מעבר צבע משמש.
הגורמים העיקריים של analyte הפסדים בפרוטוקול המתוארים כאן ניתן לייחס את שני השלבים כרומטוגרפי RP וכן סינון MWCO ודגימת SPE תנקה את שלב.
פפטיד הפסדים עקב אינטראקציה עם MWCO-מסנן או חלבונים נשמר עליו, במהלך סינון קשה להימנע, עשוי להיות מקור של אינטר מדגם וריאציה.
יותר סביר סלקטיבי הפסדים עולות המדרגות RP-כרומטוגרפי. מאז hydrophobicity פפטיד הוא תלוי-pH, ביצוע שני ברציפות RP כרומטוגרפי גרם מדרגות גבוהות ונמוכות pH, בהתאמה, עלול להוביל הפסדים קבוצת המשנה של פפטידים שנמצאים גם הידרופילית ב pH ≥9 יישמרו על עמודה, בדומה שנייה משנה גם הידרופילית ב pH ≤3 יישמרו.
לעומת שיטות השתמשו בעבר העסקתם של טרום fractionation הוביל עלייה 10-fold זיהוי של פפטידים אנדוגני. הוא התיר גילוי מוצלחת של מספר גדול של פפטידים מזוהה בעבר, ולכן הוא כלי רב ערך מחקר, חקר את peptidome CSF, ואולי גם אחרים דגימות ביולוגיות מורכבות כמו גם.
בשילוב עם תוויות isobaric מרובבת שהפרוטוקול נועד להיות מיושם עוד יותר לזיהוי סמן מועמדים הפרעות ניווניות שונות ברקמות CSF, הדם והמוח.
שחזור שונות בשלבי הכנה מדגם תורמת הווריאציה אנליטי לניתוח של חלבונים CSF, פפטידים מאת LC-גב' ביצוע isobaric תוויות של פפטידים בשלב מוקדם של ירידות הכנה הדגימה השפעת כזה וריאציה במידה רבה. לעומת דגימה שדווחה בעבר הכנת פרוטוקולים, מימוש שלב הפוכה גבוהה pH פפטיד טרום fractionation גדל המספר של פפטידים מזוהה בפקטור 5. זיהוי של פפטידים אנדוגני של MS/MS-נתונים היה שיפור משמעותי כאשר שילוב של פפטיד שונים זיהוי תוכנות, העסקת אלגוריתמים של חיפוש שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין אינטרסים מתחרים, כספי או אחר, בין הסופרים דווחו.
Acknowledgments
תודות Tanveer Batth ועמיתיו לקבלת ייעוץ בנושא קביעת שיטת fractionation מראש.
עבודה זו נתמכה על ידי מימון של המועצה למחקר השבדי, את Wallström ואת Sjöblom קרן, את האקדח, ברטיל Stohne קרן Stiftelse, קרן Bergwall מגנוס, קרן Åhlén, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen לפרטים שלך Tjänarinnor גמלא, קנוט, אליס ולנברג קרן, Frimurarestiftelsen ו ג ינג-Västra Götalandsregionen.
הנמענים העיקרי של המימון לפרויקט זה היו מנהלים Blennow, הנריק Zetterberg, יוהן Gobom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Triethylammonium bicarbonate | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
| 8 M Guanidinium hydrochloride | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Pierce | 20490 | TCEP |
| Iodoacetamide | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hydroxylamine 50% (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
| Formic acid | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
| Triflouroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO-filter |
| Sep-Pak C18, 100 mg | Waters | WAT023590 | SPE-column |
| Resprep 12-port SPE Manifold | Restek | 26077 | Vacuum manifold |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Online sample separation |
| Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Offline high-pH fractionation |
| Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Mass spectrometer for sample analysis |
| Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Proteomics search platform |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Proteomics search engine |
| Sequest HT | Thermo | - | Proteomics search engine |
| PEAKS v7.5 | Bioinformatic Solutions Inc.) | - | Proteomics search engine |
| Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Trap column (nano HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Separation Column (nano HPLC) |
| Savant SpeedVac High Capacity Concentrators | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Vacuum concentrator |
| XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm | Waters | 186003566 | Separation Column (micro HPLC) |
References
- Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
- Scheltens, P., et al.
- Dubois, B., et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease: the IWG-2 criteria. Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).
- Olsson, B., et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 15 (7), 673-684 (2016).
- Spellman, D. S., et al. Development and evaluation of a multiplexed mass spectrometry based assay for measuring candidate peptide biomarkers in Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) CSF. Proteomics Clin Appl. 9 (7-8), 715-731 (2015).
- Höglund, K., et al. Alzheimer's disease—Recent biomarker developments in relation to updated diagnostic criteria. Clin Chim Acta. 449, 3-8 (2015).
- Stark, M., Danielsson, O., Griffiths, W. J., Jornvall, H., Johansson, J. Peptide repertoire of human cerebrospinal fluid: novel proteolytic fragments of neuroendocrine proteins. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 754 (2), 357-367 (2001).
- Yuan, X., Desiderio, D. M.
- Berven, F. S., et al. Pre-analytical influence on the low molecular weight cerebrospinal fluid proteome. Proteomics Clin Appl. 1 (7), 699-711 (2007).
- Zougman, A., et al. Integrated analysis of the cerebrospinal fluid peptidome and proteome. J Proteome Res. 7 (1), 386-399 (2008).
- Holtta, M., et al. Peptidome analysis of cerebrospinal fluid by LC-MALDI MS. PLoS One. 7 (8), e42555 (2012).
- Holtta, M., et al. An integrated workflow for multiplex CSF proteomics and peptidomics-identification of candidate cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer's disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2015).
- Hansson, K. T., et al.
- Guldbrandsen, A., et al. In-depth characterization of the cerebrospinal fluid (CSF) proteome displayed through the CSF proteome resource (CSF-PR). Mol Cell Proteomics. 13 (11), 3152-3163 (2014).
- Kroksveen, A. C., Opsahl, J. A., Aye, T. T., Ulvik, R. J., Berven, F. S. Proteomics of human cerebrospinal fluid: discovery and verification of biomarker candidates in neurodegenerative diseases using quantitative proteomics. J Proteomics. 74 (4), 371-388 (2011).
- Hölttä, M., et al. A single dose of the γ-secretase inhibitor semagacestat alters the cerebrospinal fluid peptidome in humans. Alzheimers Res Ther. 8 (1), 11 (2016).
- Cao, Z., Tang, H. Y., Wang, H., Liu, Q., Speicher, D. W. Systematic Comparison of Fractionation Methods for In-depth Analysis of Plasma Proteomes. J Proteome Res. 11 (6), 3090-3100 (2012).
- Chiu, C. W., Chang, C. L., Chen, S. F. Evaluation of peptide fractionation strategies used in proteome analysis. J Sep Sci. 35 (23), 3293-3301 (2012).
- Gilar, M., Olivova, P., Daly, A. E., Gebler, J. C. Orthogonality of separation in two-dimensional liquid chromatography. Anal Chem. 77 (19), 6426-6434 (2005).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Moglich, A., Krieger, F., Kiefhaber, T. Molecular basis for the effect of urea and guanidinium chloride on the dynamics of unfolded polypeptide chains. J Mol Biol. 345 (1), 153-162 (2005).
- Hölttä, M., et al. An Integrated Workflow for Multiplex CSF Proteomics and Peptidomics Identification of Candidate Cerebrospinal Fluid Biomarkers of Alzheimer’s Disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2014).
