Summary
Se presenta un método para el análisis de espectrometría de masa de péptidos endógenos en humanos del líquido cerebroespinal (CFS). Por medio de filtración de corte de peso molecular, fraccionamiento la cromatografía, análisis de espectrometría de masa y una posterior combinación de estrategias de identificación de péptidos, fue posible ampliar la peptidome CSF conocido casi diez veces en comparación con a estudios previos.
Abstract
Este protocolo describe un método para identificar péptidos endógenos en humanos del líquido cerebroespinal (CFS). Para ello, un método previamente desarrollado basado en la filtración de peso molecular (MWCO) de corte y análisis de espectrometría de masa fue combinado con un paso de fraccionamiento la HPLC fase inversa de alto pH fuera de línea.
Secreción en LCR es la principal vía para la eliminación de moléculas de arrojar por las células del sistema nervioso central. Así, muchos procesos en el sistema nervioso central se reflejan en el LCR, haciéndola un líquido valioso de diagnóstico. CSF tiene una composición compleja, que contiene proteínas que abarcan un rango de concentración de 8-9 órdenes de magnitud. Además de proteínas, estudios anteriores han demostrado también la presencia de un gran número de péptidos endógenos. Mientras menos estudiado que las proteínas, estas también pueden tener interés potencial como biomarcadores.
Péptidos endógenos se separaron del contenido de proteína del CSF a través de filtración MWCO. Quitando la mayoría del contenido proteínico de la muestra, es posible aumentar el volumen de la muestra estudiada y así también el importe total de los péptidos endógenos. La complejidad de la mezcla filtrada péptido fue abordada mediante la inclusión de una fase inversa paso de fraccionamiento antes de HPLC (RP) a un pH alcalino antes el análisis por LC-MS. El fraccionamiento fue combinado con un esquema simple concatenación donde 60 fracciones se agruparon en 12, consumo de tiempo de análisis así podría reducirse evitando en gran parte la elución.
Identificación de péptidos automatizada fue realizada usando programas de software de identificación de tres diferentes péptidos/proteínas y posteriormente combinar los resultados. Los diferentes programas fueron complementarios más que comparable con menos del 15% de las identificaciones comprometidos entre los tres.
Introduction
Biomarcadores en líquido cefalorraquídeo (LCR) están transformando actualmente investigación en enfermedades neurodegenerativas. En la enfermedad de Alzheimer, el trastorno neurodegenerativo más común, afectando a más 60 millones de personas en todo el mundo1,2, un trío de biomarcadores de la beta amiloide péptido, estabilización de microtúbulos de proteína tau y un fosforilados forma de tau, puede detectar la enfermedad con alta sensibilidad y especificidad y ha sido incluido en los criterios de investigación diagnóstica3. En otras enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson y esclerosis múltiple, estudios proteómicos han identificado a numerosos candidatos de biomarcadores, algunas de las cuales actualmente están siendo evaluados en estudios clínicos4,5 ,6.
Junto a las proteínas, CSF también contiene una gran cantidad de péptidos endógenos7,8,9,10,11,12. Que constituyen productos de escote de muchas proteínas derivado del cerebro, estos péptidos también representan una fuente potencialmente importante de biomarcadores de la enfermedad. Para aumentar el inventario de péptidos endógenos identificados en LCR humana y permiten análisis de endopeptidomic de la CFS en estudios clínicos, se desarrolló un método para la preparación de la muestra y el análisis por LC-MS (un esquema breve protocolo ha sido incluido en la figura 1 ). La aplicación de este método en un estudio reciente resultó en la identificación de péptidos endógenos casi 16.400 del CSF en muestras de CSF combinadas de varios individuos de diagnósticos no específicos, ampliando el conocido endopeptidome de CSF diez veces13. El método puede utilizarse opcionalmente junto con enfoque etiquetado isobárica para la cuantificación.
Preparación de la muestra
La fuente principal de la masa de proteína en LCR es los componentes del plasma (albúmina e inmunoglobulinas) pasar por encima de la sangre cerebral barrera14,15. Su abundancia alta dificulta la detección de componentes de la muestra bajo abundante, derivado del cerebro. Péptidos endógenos pueden ser fácilmente separados de las proteínas alto abundante, lo que permite un mayor volumen de extracto de péptido CSF a utilizarse para el análisis de LC-MS, lo que permite la detección de péptidos inferior abundante.
En el protocolo presentado aquí, filtración de peso molecular (MWCO) de corte sirvió para separar los péptidos de la CSF de la fracción de proteína; un método que se ha utilizado en varios anteriores estudios8,9,10,11,12,16. El paso de filtración fue seguido por un paso de fraccionamiento anterior RP HPLC offline realizado sobre un gradiente de fase móvil de alto pH. Realizando dos pasos RP HPLC en tándem, con el pH siendo la principal distinción, la diferencia en selectividad entre los dos pasos resulta principalmente de la retención de péptidos alterados como consecuencia de Estados de carga distintos péptidos. La solicitud de fraccionamiento antes de péptidos de alto pH antes de LC-MS en condiciones ácidas ha demostrado ser eficaz en el aumento de péptidos identificación17,18e incluso a ser superior para este fin en complejo biológico muestras en comparación con más separación orthogonal modos19, como fuerte gato-ion exchange (SCX) y RP20. Para acortar el tiempo de análisis, se utilizó un esquema de concatenación, puesta en común cada fracción 12th (p. ej., fracciones 1, 13, 25, 37 y 49), que debido a la alta energía de RP HPLC todavía en gran medida evita la elución de péptidos de diferente fracciones en el LC-MS paso20,21.
Identificación de péptidos
Identificación del péptido en peptidomic estudios difiere de estudios proteómicos en que ninguna hendidura de la enzima se puede especificar en la búsqueda de la base de datos, y como consecuencia, las tasas de identificación son generalmente más bajo11. Un reciente estudio13 demostró que las tasas de identificación de péptidos endógenos obtenidos con Sequest y mascota mejoraron sustancialmente cuando el valor por defecto que el algoritmo del programa respectivo se modificó mediante la puntuación de adaptación algoritmo de percolador, indicando que algoritmos de puntuación óptima para péptidos endógenos se diferencian de la de péptidos trípticos13. En ese estudio, identificación basada en la secuenciación de novo de péptidos automático utilizando el software de picos (BSI) fue encontrado para ser complementario a los motores de búsqueda basada en huellas digitales dos fragmento iones, resultando en un conjunto mayor de identificados péptidos.
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Protocol
El protocolo que se describe a continuación es una versión refinada de la utilizada en un estudio previo donde se identificaron una gran cantidad de péptidos endógenos en CSF humana15. Versiones del protocolo original implican alteraciones menores en el tratamiento previo químico del LCR, así como optimización de degradado que se utiliza para el fraccionamiento previo fuera de línea de alto pH RP HPLC.
Consideraciones éticas
Todos los estudios de sueco paciente y control de los materiales han sido aprobados por comités de ética: St Göran (Ref. 2005-554-31/3). Muestras de la CSF de la cohorte de demencia de Amsterdam y recogidos en el Hospital Nacional para Neurología y Neurocirugía, Londres fueron utilizados para investigación con consentimiento de todos los pacientes participantes y la aprobación de los comités de ética regional. El material aquí utilizado principalmente consistió en CSF sobrantes de las muestras tomadas con el fin de diagnosis y era anónima antes de ser incluido en nuestros estudios. No hay posibilidad de remontar nuevamente la muestra a cualquier donante individual o grupo de donantes.
1. extracción de humanos del líquido cerebroespinal (CFS):
- Extracto de la CSF a través de una punción lumbar (debe realizarse por un médico entrenado) utilizando un protocolo estandarizado de22.
- Eliminar restos celulares y otros materiales no solubles por centrifugación a 2.500 x g durante 20 min.
- Inspeccione visualmente las muestras CSF de decoloración que puede indicar contaminación de sangre por punción hemorragia. La significativamente mayor concentración de proteína en la sangre y la presencia de proteasas puede afectar enormemente los resultados analíticos.
2. tratamiento previo de la CFS (volumen de muestra de 1,5 mL, no hay cuantificación):
- Descongelar los 1,5 mL de alícuotas de la CSF a temperatura ambiente (RT), transferir el contenido a tubos de polipropileno de 10 mL y añadir 80 μl de 1 M bicarbonato de Trietilamonio (TEAB) como un neutralizante.
- Agregar clorhidrato de guanidinio 0,65 mL de 8 M (GdnHCl) (concentración activo GdnHCl: 2,4 M) y agitar suavemente a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Nota: El agente caotrópico, GdnHCl, afecta a la viscosidad del solvente tanto interactúa con la cadena polipeptídica, que se traduce en proteína despliegue ser enérgio favorable23. Así, GdnHCl disuelve agregados de proteína y aumenta la recuperación de péptidos endógenos durante la filtración posterior. - Añadir 60 μL de 200 mM de acuosa tris(2-carboxyethyl) clorhidrato de fosfina (TCEP) (concentración active TCEP: 6 mM) e incubar a 55 ° C por 1 h para reducir disulfuros de cisteína.
- Añadir 35 μl de 400 mM Yodoacetamida (IAA) (concentración activa IAA: 4 mM) e incubar a temperatura ambiente en oscuridad durante 30 minutos a alkylate cisteínas. La adición de un grupo alquilo se asegura de que residuos de cisteína espontáneamente no pueden formar puentes disulfuro en cualquier momento durante la preparación de la muestra posteriores.
- Añadir 3,25 mL de agua desionizada y agitar brevemente para diluir la muestra antes de la filtración MWCO, dando por resultado un volumen total de la muestra de 5,5 mL. Este paso sirve para diluir GdnHCl a por debajo de 1 M como se ha observado una mayor concentración a veces causar lixiviación de sustancias poliméricas de los dispositivos de filtro.
3. tratamiento previo de la CFS (volumen de muestra 10 x 150 μL, cuantificación etiquetado isobárica):
- Descongelar 150 μL de alícuotas de la CSF de 10 individuos en RT y posteriormente transferir el contenido a tubos de centrífuga micro baja unión individual 1.5 mL y añadir 8 μl de 1 M TEAB como un neutralizante.
- Añadir 65 μl de 8 M GdnHCl (concentración activo GdnHCl: 2,4 M) y agitar suavemente a temperatura ambiente durante 10 minutos.
- Añadir 6 μl de 200 mM de TCEP acuosa (concentración active TCEP: 6 mM) e incubación a 55 ° C por 1 h para reducir disulfuros de cisteína.
- Añadir 3,5 μl 400 mM IAA acuosa (concentración activa IAA: 6 mM) e incubar a la RT y la oscuridad durante 30 minutos para alkylate cisteínas.
- Preparar el kit de etiquetado isobárico (e.g., reactivo de etiquetado isobárico de etiqueta de masa tándem 10plex). Deje que los frascos de reactivo etiquetado isobáricos a RT antes de abrirlos para evitar hidratación innecesario reactivo, añadir 41 μl de grado HPLC acetonitrilo (AcN) y disolver por agitación suave durante 5 minutos.
- 30 μl de solución de reactivo de etiquetado isobárica de transferencia a la muestra correspondiente e incubar 1 h a temperatura ambiente en agitación suave. El reactivo etiquetado isobárico comprende un grupo de NHS-éster que reacciona con las aminas primarias presentes en el péptido N-termini, así como con residuos de lisina.
- Añadir 8 μl de 5% hidroxilamina (hidroxilamina concentración activa: 0,16%) y agitar suavemente a temperatura ambiente por 20 min para calmar la reacción de etiquetado. Puesto que las muestras por separado con combinar, asegurar que el etiquetado reacción se apaga. Por adición de una abundancia de grupos amino en forma de hidroxilamina, reactivo etiquetado isobárico restantes se permite reaccionar y así es inertizado.
- Combinar el contenido de cada una de las 10 muestras etiquetadas individualmente en un tubo de polipropileno solo 15 mL.
- Añadir 6,4 mL de agua desionizada para la muestra combinada y vortex brevemente para reducir la concentración de AcN del 12% al 3% y a la concentración de GdnHCl GdnHCl a por debajo de 1 M como se ha observado una mayor concentración a veces causar lixiviación de sustancias poliméricas de los dispositivos de filtro.
4. el peso Molecular de corte filtrado
- Para eliminar el potencial de contaminantes, afección el MWCO filtros cargando 10 mL acuosa 1 M GdnHCl, 25 mM TEAB y centrifugar 15 min a 2.500 x g y RT, descartar el paso (FT).
- El volumen de toda la muestra en el filtro de la carga (CSF no etiquetados de 5 mL (paso 2.5) o 10 mL con etiqueta isobarically CSF (paso 3.9)) y centrifugar por 30 min a 2.500 x g y RT, dejo el flujo a través (FT) en el recipiente. El resultado de la filtración es que péptidos y proteínas de pequeño tamaño se separan de más proteínas y residual de restos celulares. Este paso puede verse como el equivalente al uso de la digestión proteolítica de las proteínas peptidomic para generar péptidos en experimentos de la proteómica.
- Coloque 5 mL de 25 mM TEAB (acuosa) en los filtros y centrifugar 15 min a 2.500 x g y RT, para aumentar la recuperación de péptidos.
- Vórtice de la FTs combinada de los dos pasos anteriores (total 10 mL de no etiquetar o 15 mL de muestra de isobarically etiquetados) y proceder a la acidificación de la muestra.
5. el salado y muestra limpiar por extracción en fase sólida
- Acidificar la muestra filtrada de paso 4.4 antes de la extracción en fase sólida (SPE). La acidificación se realiza con el fin de mejorar la interacción de soluto (péptido) con la fase estacionaria del cartucho de SPE.
- Para la muestra no etiquetada (volumen 10 mL): Añadir 550 μl de 1% de ácido trifluoroacético (TFA) - volumen total de la muestra: mL 10,55 con 0.05% TFA.
- Para la muestra etiquetada isobárico (volumen 15 mL): agregue 20 mL 0.1% TFA a acidificar y baja concentración de AcN del 3% al 1% - volumen total de la muestra: 30 mL con 0.066% TFA.
Nota: TFA se agrega también para su función como un reactivo de emparejamiento iónico, que mejora la retención de los péptidos no se capaz de interacción hidrofóbica suficientemente fuerte con el material de embalaje del cartucho SPE a conservarse. - Si pH > 3, valorar la muestra con ácido fosfórico al 20% hasta pH de la muestra es < 3.
- Condición de los cartuchos SPE por la adición de 1 mL de 84% AcN, 0,1% de ácido fórmico (FA) y desechar los pies repetir una vez. Acondicionado del cartucho filtro es necesaria para eliminar sustancias no deseadas que lo contrario se procederá a la elución junto con los péptidos en los pasos posteriores; acondicionado, aumenta la permeabilidad del filtro.
- Equilibre el cartucho SPE por la adición de 1 mL de 0.1% TFA, descartar FT. repetir una vez. Asegurar que el filtro no funcione en seco después de la última etapa de equilibrado - mantener un pequeño volumen en la parte superior del filtro. Equilibrado del filtro de cartucho se realiza con el fin de preparar el filtro para retener péptidos mediante la eliminación de la sustancia hidrófoba (acetonitrilo) a la izquierda de la etapa de acondicionado.
- Cargar el volumen de toda la muestra (mL 10,55 para muestras no etiquetadas o 30 mL para muestras isobarically etiquetados), en varias partes si es necesario y deje los pies en residuos. Asegúrese de que el cartucho no funcione en seco entre rondas de carga de la muestra o después de que se haya cargado el último volumen de la muestra - mantener un pequeño volumen en la parte superior del filtro.
- Pasar 1 mL de 0.1% TFA sobre los filtros para eliminar sales y reactivos y descartar la repetición de pies de una vez. Asegúrese de que el cartucho no funcione en seco después de cada paso de lavado - mantener un volumen pequeño de líquido en la parte superior del cartucho.
- 1.5 lugar de micro enlace bajo mL centrifugar tubos bajo el cartucho y eluir la muestra al pasar 1 mL de 84% AcN, 0.1% FA sobre el cartucho.
- Eliminar los solventes de la muestra de sal por evaporación en una centrífuga de vacío ejecute sin calefacción activa hasta que se seque, almacenar a-80 ° C o proceder de inmediato a fraccionamiento de alto pH.
6. fase de reversa de offline alto pH HPLC muestra fraccionamiento
-
Preparación de fases móviles acuosas de alto pH (HpH):
HpH tampón A: Agua pura
HpH Buffer B: 84% AcN
Buffer de HpH C: 25 mM NH4OH
Tampón de carga de HpH: 2,5 mM NH4OH, 2% AcN
Nota: Carga de HpH tampón se utiliza como buffer de muestra y la solución de transporte - Volver a disolver la muestra en 16 μl de tampón de carga de HpH por agitación suave durante 20 min.
- Carga 15 μl de la muestra en un sistema HPLC con un colector de fracciones internas para placas de 96 pozos profundos configurado según baño et al. 20 con alteraciones menores. Fraccionar en un flujo de 100 μl/min sobre una columna de separación pH-estable (μm 3.5 C18, 2,1 x 250 mm) y recoger una fracción por minuto sobre un gradiente lineal de 60 min.
- Use gradiente tiempo-lo siguiente: t = 0 min, B = 1%, C = 10%; t = 4 min, B = 1%, C = 10%, iniciar colección de fracciones; t = 76 min, B = 70%, C = 10%; colección de fracciones de final; t = 76,5 min, B = 85%, C = 10%; t = 80 min, B = 85%, C = 10%; t = 80,5 min, B = 1%, C = 10% y t = 90 min, B = 1%, C = 10%.
- Recoger fracciones repetitivamente en 12 pozos en un patrón circular, concatenando así fracciones separadas por 12 minutos, resultando en 12 fracciones, cada una con 6 fracciones sub concatenados.
- Eliminar el disolvente de muestras por centrifugación vacío a RT y 3000 rpm hasta que se seque y almacenar las muestras a-80 ° C antes del análisis por LC-MS.
7. LC-MS
-
Preparación de fases móviles acuosas:
Tampón A: 0.1% FA
Tampón B: FA 0.1%, 84% de AcN
Tampón de carga: 0,05% TFA, 2% AcN
Nota: Carga del buffer se usa como solución de transporte, tampón y fase móvil para la bomba de carga. - Volver a disolver cada una de las 12 fracciones por la adición de 6 μl de tampón de carga y agitación a temperatura ambiente por 20 min
- Muestra de carga 5 μL en un HPLC flujo nano, en configuración de columna de trampa (columna de la trampa: 75 μm x 2 cm, C18, 100 Å tamaño de los poros, tamaño de partícula de 3 μm; columna de separación: C18, 75 μm x 500 m m, 100 Å tamaño de los poros, tamaño de partícula de 2 μm y realizar la separación del péptido con un caudal de 150 nL/min usando el siguiente gradiente: t = 0 min, B = 2%; t = 10 min, B = 2%; t = 11 min, B = 7%; t = 100 min, B = 26%; t = 170 min, B = 45%; t = 175 min, B = 80%; t = min 181, B = 2% y t = 210 min, B = 2%.
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Realizar MS en el espectrómetro de masas de alta resolución híbrido conectado a la HPLC mediante una interfaz de nano-ESI. Registrar espectros de análisis completo en modo de MS en una configuración de resolución de 120.000 (2.0e5 destino AGC) sobre la gama de m/z 350-1.400.
- Operar el espectrómetro de masas en el modo de adquisición de datos dependientes, seleccione espectros MS/MS de los picos más intensos diez superior con m/z > 150 y en la intensidad gama 1.0e4-1.0e5 para análisis de iones fragmento. Aislar los iones precursores usando una ventana de aislamiento de cuadrupolo de 1 m/z, tiempo de inyección máxima de 100 ms y la lente de RF en el 60%.
- Aplicar exclusión dinámico con un tiempo de exclusión de 15 s y una tolerancia de ±10 ppm de m/z . Realizar la fragmentación de la energía de la colisión mayor disociación (HCD) de la célula y registrar adquisiciones MS/MS en el orbitrap en una configuración de resolución de 50.000 (valor del objetivo AGC de 5.0e4).
8. péptido identificación
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Para la identificación de péptidos enviar los archivos .raw resultantes de los análisis de espectrometría de masa para un motor de búsqueda de proteómica aplicando los siguientes valores:
Nota: En nuestro anterior estudio15, tres motores de búsqueda; Mascota v2.4, Sequest HT y picos v7.5 fueron utilizados en paralelo y la configuración especificada aquí trabajaban los tres motores de búsqueda, a menos que se especifique lo contrario. La mayoría de los ajustes es universal para la identificación de péptidos/proteínas y debe tener valores correspondientes en cualquier motor de búsqueda determinado.
Selector de espectro:
Precursor de mínima masa: 350 Da
Max. precursor de masa: Da 5.000
Tipo de exploración: completo
Umbral de señal/ruido: 1,5
Búsqueda de base de datos de secuencia
Base de datos: UniProt_SwissProt [version2015_11]
Taxonomía: Homo sapiens
Enzima: ninguno
Max. faltaron las divisiones: 0
Instrumento (mascota solamente): ESI-trampa
Longitud mín. de péptido (SequestHT solamente): 6
Max. longitud del péptido (SequestHT solamente): 144
Tolerancia total de precursor: 15 ppm
Fragmento de la tolerancia de masa: Da 0.05
Modificaciones estáticas: Carbamidomethyl (C); [Si la identificación] TMT10plex (N-Term)
Modificaciones dinámicas: oxidación (M); [Si la identificación] TMT10plex (K)
Péptido-espectro coincide con validador (PSM)
Percolador (mascota y Sequest HT sólo) o fusión de señuelo (solo los picos)
Objetivo FDR: 0.01
Validación basada en: valor de q
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Representative Results
El método aquí descrito ha sido aplicado y evaluado en tres estudios antes de la introducción de fraccionamiento de la muestra (tabla 1). El primer estudio utilizado LC offline para detectar fracciones de CSF en una placa de destino de MALDI y dio lugar a péptidos endógenos identificados 73011. En los dos estudios siguientes, etiquetado isobárica se empleó. Principalmente en un control de caso de estudio para la identificación y caracterización de potenciales biomarcadores en el CSF endopeptidome y proteoma simultáneamente24y en el segundo estudio isobárico etiquetado fue utilizado para el monitoreo de los efectos del tratamiento en vivo de un inhibidor de la γ-secretasa sobre la expresión de péptidos en el LCR durante 36 h16. En el estudio de caso y control se identificaron péptidos endógenos 437, 64 de los cuales alterado en concentración entre individuos con EA y controles sanos. El tercero, el estudio del tratamiento, había identificado péptidos endógenos 1798, 11 de los péptidos supervisados podría ser demostrado que responden al tratamiento.
En el cuarto estudio, el objetivo fue aumentar el número de péptidos identificados de CSF, particularmente para identificar péptidos inferior abundante. Por lo tanto, fraccionamiento la péptido por cromatografía de HpH-RP fue incluido y un 10 veces mayor volumen muestra de la CFS fue utilizado, dando por resultado la identificación de 16.395 péptidos. En este estudio, no se realizó etiquetado isobárico. Además el fraccionamiento de la muestra, el más reciente estudio empleó una identificación del péptido combinado enfoque, mientras que en los primeros tres estudios se realizó sólo una búsqueda de base de datos única, que a algunas cuentas de medida para el mayor número de péptidos identificado. Comparando los resultados obtenidos por los motores de búsqueda individual (mascota, Sequest HT o picos) del más reciente estudio indica que los algoritmos utilizados son hasta cierto punto complementario desde una cantidad relativamente pequeña, menos del 15% (2440), péptidos identificados los tres motores de búsqueda (figura 2). Además, la de novo-secuencia la búsqueda de picos de motor fue la más eficiente en la identificación de péptidos endógenos, pero más de 5.400 péptidos no habría sido identificados si sólo picos habían sido utilizado (figura 2). La aplicación de varios motores de búsqueda en el mismo material tiene el potencial de múltiples problemas prueba y esto fue tratado con una prueba de identificación corrección13. Los datos adquiridos de la MS/MS crudos, así como todos los resultados obtenidos en las búsquedas de Proteómica del juicio más reciente se han hecho disponibles en el repositorio de datos de orgullo via ProteomeXchange con el identificador PXD004863.
Figura 1: un esquema de protocolo visualizar los pasos principales del método. Además de la extracción de líquido cefalorraquídeo por punción lumbar seguida de centrifugación para eliminar material no soluble, 2) de GdnHCl a la muestra a disociar agregados péptido-proteína, aumentando la recuperación de péptidos endógenos; reducción y alquilación de disulfuros de cisteína; etiquetado isobárica para la cuantificación del péptido (opcional) 3) filtración de peso molecular para separar péptidos endógenos de las proteínas, 4) extracción en fase sólida para eliminar sales y otros contaminantes polares, 5) fraccionamiento previo RP HPLC, alcalina gradiente de fase móvil y la concatenación de cada 12 fracciónXVIII , 6) gradiente de fase móvil RP HPLC-MS/MS, ácida, cada fracción concatenado consecutivamente, ejecutar 7) identificación de péptidos realizada mediante la presentación de datos de MS/MS de análisis 12 todas las ejecuciones como un se realizó muestra solo para los motores de búsqueda, posteriormente se compararon los péptidos IDs y un resumen de todo único péptido IDs. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Resumen de estudio | TMT etiquetado (s/n) | Fraccionamiento de HpH-RP (s/n) | Correspondiente volumen de LCR por MS-análisis (μL) | Número de péptidos identificados | Comentario | Referencia |
| Análisis exploratorio de la peptidome de la CFS | n | n | 500 | 730 | Preparación de blanco de LC MALDI offline, MALDI-MS; evaluación de filtros MWCO | 4 |
| Comparación cuantitativa de los péptidos del CSF; muestras de 20:00 + Ctrl 8 | y | n | 200 | 437 | HPLC-ESI MS; combinado peptidomic y Protocolo de la proteómica | 25 |
| Estudio del tratamiento de inhibidor de AD gamma secretasa | y | n | 300 | 1798 | HPLC-ESI MS; CSF extraído en seis puntos del tiempo después del tratamiento | 17 |
| Expansión de la peptidome de CSF | n | y | 750-1000 | 18.031 | HPLC-ESI MS; combinación de software de identificación de péptidos | 15 |
Tabla 1: Una recopilación de estudios recientes realizados por este grupo que se aplica la filtración de peso molecular y análisis de espectrometría de masas para la identificación de péptidos endógenos en LCR humano.
Figura 2: un diagrama de Venn comparando los resultados de la identificación de péptidos obtenidos de cada uno de los tres buscadores mascota, picos y Sequest HT. Se identificaron un total de 16.395 péptidos endógenos. De novo-picos de motor de búsqueda la secuencia identificado péptidos endógenos 10.967; iones fragmento basado en huellas digitales buscadores mascota y Sequest HT identificado péptidos endógenos 8118 y 7304 respectivamente. El consenso de identificación entre todos los buscadores tres ascendió a péptidos endógenos 2440 o 14,8%. Había un traslapo de identificación relativamente grande entre mascota y Sequest HT, correspondiente al 70% de sus identificaciones de péptido combinado. PICOS tenían una identificación comparativamente pequeña traslapo con mascota y Sequest HT; 20.5% y 18,9% respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La introducción de un alto pH RP HPLC fraccionamiento previo paso a un protocolo previamente desarrollado para la recuperación de péptidos endógenos de ultrafiltración de peso molecular11 reducción de la complejidad relativa de la muestra y lo permitido para una 5 veces mayor volumen de muestra a ser estudiada. Esto, a su vez, incrementó la concentración del subconjunto de péptidos presentes en cada fracción y así mejora las posibilidades de detectar péptidos abundantes bajas.
Mediante la realización de una estrategia de identificación de péptidos endógenos que empleó tres softwares proteómicos en paralelo, fue posible ampliar el conocido endopeptidome de CSF más de 10 veces. Se identificó un total de 16.395 péptidos endógenos en un juicio preliminar sobre un material de muestra de CSF combinado. Entre las identificaciones fueron un gran número de péptidos endógenos derivados de proteínas había observadas anteriormente en el contexto de trastornos neurodegenerativos. Varios péptidos identificados en los estudios mencionados están evaluando actualmente como biomarcadores en nuestro laboratorio. Este proceso implica varios pasos, incluyendo la verificación de las identidades de los péptidos por clavar CSF con sintéticos análogos marcados con isótopos pesados, establecimiento de ensayos espectrometría de masa específicos, evaluar la estabilidad del péptido durante el almacenamiento y hielo-deshielo ciclos y analizar diferentes cohortes clínicas.
Se hicieron modificaciones en el protocolo original para evitar la introducción de contaminantes (pasos de 2.5 y 3.5), como consecuencia de una alta concentración de GdnHCl en la muestra durante la filtración MWCO. Se realizó una actualización de la gradiente de pre-fraccionamiento (paso 6.3.1), capacidad prolongada, lineal gradiente se utiliza.
Las principales causas de pérdidas de analito en el protocolo aquí descrito pueden atribuirse a los dos pasos cromatográficos de RP, así como la filtración MWCO y muestra SPE limpiar paso.
El péptido pérdidas debido a la interacción con el filtro de MWCO, o conservar, durante la filtración de proteínas son difíciles de evitar y pueden ser una fuente de entre la variación de la muestra.
Más probables selectivo pérdidas ocurren en los pasos de cromatografía RP. Hidrofobicidad del péptido es dependiente del pH, realizar dos pasos cromatográficos del RP consecutivos en alta y baja pH, respectivamente, puede llevar a pérdidas del subconjunto de péptidos que son demasiado hidrofílicas en pH ≥9 a ser retenidos en la columna y del mismo modo un segundo subconjunto demasiado hidrofílico a pH ≤ 3 a conservarse.
En comparación con los métodos anteriormente usados el empleo de fraccionamiento anterior ha conducido a un aumento de 10 veces en la identificación de péptidos endógenos. Ha permitido la detección exitosa de un gran número de péptidos previamente no identificadas y por lo tanto es una herramienta valiosa en el estudio y exploración de la peptidome de la CSF y posiblemente otras muestras biológicas complejas.
Combinado con etiquetado isobárico multiplexado que protocolo pretende aplicarse más para identificar a candidatos de biomarcadores para varios trastornos neurodegenerativos en LCR, sangre y cerebro tejido fino.
Variable recuperación en los pasos de preparación de la muestra contribuye a la variación analítica para el análisis de péptidos y proteínas de CSF por LC-MS. realizar isobárico etiquetado de péptidos en una etapa temprana de la muestra preparación disminuye la influencia de tales variación mucho. En comparación a los protocolos de preparación de muestra previamente divulgados, la aplicación de pre-fraccionamiento de fase reversa de alto pH péptido aumentado el número de péptidos identificados por un factor de 5. Identificación de péptidos endógenos de MS/MS-datos mejoró significativamente cuando se combina programas de software de identificación de péptidos diferentes, empleando algoritmos de búsqueda.
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Disclosures
No hay intereses contrapuestos, financieros o de otros, entre los autores se han divulgado.
Acknowledgments
Muchas gracias a Tanveer Batth y colegas para asesoría en establecer el método de fraccionamiento anterior.
Este trabajo contó con financiamiento del Consejo de investigación sueco, la Wallström y Fundación Sjöblom, la pistola y Bertil Stohne Fundación Stiftelse, la Fundación de Bergwall de Magnus, Åhlén Fundación, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen för Gamla Tjänarinnor, Knut y Alice Wallenberg Foundation, Frimurarestiftelsen y FoU-Västra Götalandsregionen.
Los principales destinatarios de la financiación de este proyecto fueron Kaj Blennow, Henrik Zetterberg y Johan Gobom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Triethylammonium bicarbonate | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
| 8 M Guanidinium hydrochloride | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Pierce | 20490 | TCEP |
| Iodoacetamide | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hydroxylamine 50% (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
| Formic acid | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
| Triflouroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO-filter |
| Sep-Pak C18, 100 mg | Waters | WAT023590 | SPE-column |
| Resprep 12-port SPE Manifold | Restek | 26077 | Vacuum manifold |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Online sample separation |
| Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Offline high-pH fractionation |
| Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Mass spectrometer for sample analysis |
| Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Proteomics search platform |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Proteomics search engine |
| Sequest HT | Thermo | - | Proteomics search engine |
| PEAKS v7.5 | Bioinformatic Solutions Inc.) | - | Proteomics search engine |
| Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Trap column (nano HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Separation Column (nano HPLC) |
| Savant SpeedVac High Capacity Concentrators | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Vacuum concentrator |
| XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm | Waters | 186003566 | Separation Column (micro HPLC) |
References
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