Summary
Eine Methode für die massenspektrometrische Analyse von endogenen Peptiden in menschlichen zerebrospinale Flüssigkeit (CSF) wird vorgestellt. Durch den Einsatz von Molekulargewicht Cut-off-Filtration, chromatographische Pre-Fraktionierung, massenspektrometrischen Analyse und eine anschließende Kombination von Peptid-Identifikation-Strategien, war es möglich, die bekannten CSF Peptidome fast um das Zehnfache im Vergleich zu erweitern zu früheren Studien.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode entwickelt, um die endogene Peptide in menschlichen zerebrospinale Flüssigkeit (CSF) zu identifizieren. Zu diesem Zweck eine zuvor entwickelte Methode basierend auf Molekulargewicht Cut-Off (MWCO) Filtration und massenspektrometrische Analyse wurde mit einer offline hohem pH-Wert umgekehrter Phase HPLC Pre Fraktionierung Schritt kombiniert.
Sekretion in Liquor ist der Hauptweg zur Entfernung von Molekülen durch Zellen des zentralen Nervensystems zu vergießen. So spiegeln sich viele Prozesse in das zentrale Nervensystem im Liquor, eine wertvolle diagnostische Flüssigkeit zu rendern. CSF hat eine komplexe Zusammensetzung enthält Proteine, die einen Konzentrationsbereich von 8-9 Größenordnungen umfassen. Neben Proteinen haben frühere Studien auch die Anwesenheit einer großen Anzahl von endogenen Peptiden gezeigt. Während weniger intensiv erforscht als Proteine, können diese auch potentielles Interesse als Biomarker halten.
Endogene Peptide wurden von der CSF Proteingehalt durch MWCO Filtration getrennt. Einen Großteil der Proteingehalt aus der Probe entfernen, ist es möglich, das Probenvolumen studiert und damit auch der Gesamtbetrag der endogene Peptide zu erhöhen. Die Komplexität der Mischung filtriert Peptid wurde behoben, indem unter anderem einen umgekehrten Phase HPLC (RP) Pre-Fraktionierung Schritt bei alkalischen pH-Wert vor der LC-MS-Analyse. Die Fraktionierung wurde kombiniert mit einem einfachen Verkettung Regelung denen 60 Brüche in 12 gebündelt wurden, konnte Analyse Zeitverbrauch dadurch verringert werden, Co Elution noch weitgehend zu vermeiden.
Automatisierte Peptid Identifikation erfolgte durch mit drei verschiedenen Peptid/Protein-Identifikation-Software-Programme und kombinieren anschließend die Ergebnisse. Die verschiedenen Programme wurden ergänzende als vergleichbar mit weniger als 15 % von Identifikationen, die zwischen den drei überlappt.
Introduction
Biomarker im Liquor cerebrospinalis (CSF) sind derzeit verwandelt Forschung in Neurodegenerative Erkrankungen. Bei der Alzheimer-Krankheit die häufigste Neurodegenerative Erkrankung, Auswirkungen auf mehr als 60 Millionen Menschen weltweit1,2, ein Biomarker-Triplett bestehend aus Peptid Amyloid Beta, Mikrotubuli-stabilisierenden Protein Tau, und eine Tau Form phosphoryliert und erkennt die Krankheit mit hoher Sensitivität und Spezifität in der diagnostischen Forschung Kriterien3aufgenommen wurde. In anderen neurodegenerativen Erkrankungen wie Morbus Parkinson und Multiple Sklerose haben Proteomic Studien zahlreiche Biomarker Kandidaten identifiziert einige davon derzeit unter Bewertung klinischer Studien4,5 sind ,6.
Neben Proteinen enthält CSF auch eine Fülle von endogenen Peptiden7,8,9,10,11,12. Spaltprodukte des Gehirns abgeleitet Proteine bilden, stellen diese Peptide auch eine wichtige Quelle der Krankheit Biomarker. Um das Inventar der identifizierten endogene Peptide in menschlichen CSF zu erhöhen und CSF Endopeptidomic Analysen in klinischen Studien zu ermöglichen, wurde eine Methode entwickelt, für die Probenvorbereitung und LC-MS-Analyse (eine kurze Protokollschema ist in Abbildung 1 aufgenommen worden ). Die Anwendung dieser Methode in einer aktuellen Studie wurden fast 16.400 endogenen CSF Peptide in CSF Mischproben aus mehrere Personen der unspezifischen Diagnose, Erweiterung der bekannten CSF Endopeptidome um das Zehnfache13. Die Methode kann optional in Verbindung mit Isobaren Kennzeichnung Ansatz zur Quantifizierung verwendet werden.
Vorbereitung der Probe
Die wichtigste Quelle für Eiweiß Masse in CSF ist Plasma Bestandteile (z.B. Albumin und Immunglobuline) Überfahren der Blut Hirn-Schranke14,15. Ihre hohe Fülle erschwert die Erkennung von niedrig-reichlich, Brain-derived Beispielkomponenten. Endogene Peptide können leicht von der hohen reichlich Proteine, wodurch ein deutlich größeres Volumen von CSF-Peptid-Extrakt für LC-MS-Analyse, damit die Erkennung der unteren reichlich Peptide verwendet werden getrennt werden.
In dem hier vorgestellten Protokoll wurde Molekulargewicht Cut-Off (MWCO) Filtration verwendet die Proteinfraktion CSF Peptide getrennt; eine Methode, die in mehreren früheren verwendet wurde studiert8,9,10,11,12,16. Der Filtrationsschritt folgte ein offline RP HPLC Pre Fraktionierung Schritt über einen Gradienten von hohem pH-Wert mobilen Phase durchgeführt. Durch Schritten zwei RP HPLC im Tandem, mit pH wird der Hauptunterschied, ergibt sich der Unterschied in Selektivität zwischen den zwei Schritten hauptsächlich aus veränderten Peptid Thesaurierung als Folge unterschiedlicher Peptid Ladungszustände. Die Anwendung von hohem pH-Wert Peptid Pre Fraktionierung vor LC-MS unter sauren Bedingungen nachweislich effizient Peptid Identifikation17,18zu erhöhen und zu diesem Zweck in komplexen biologischen überlegen sein Proben im Vergleich zu mehr orthogonal Trennung Modi19, wie starke Katze-Ionenaustausch (SCX) und RP-20. Um die Analyse zu verkürzen, war eine Verkettung Schema verwendet bündeln alle 12th -Fraktion (z.B. Brüche 1, 13, 25, 37 und 49), die durch das hohe Auflösungsvermögen der RP-HPLC Co Elution von Peptiden aus verschiedenen noch weitgehend vermieden, Brüche in der LC-MS Schritt20,21.
Peptid-Identifikation
Peptid-Identifikation in Peptidomic Studien unterscheidet sich von der Proteomik-Studien, dass kein Enzym Spaltung in die Datenbankrecherche angegeben werden kann, und folglich Identifikation Preise in der Regel niedriger11 sind. Eine aktuelle Studie13 zeigte, dass die Identifizierung Preise für endogene Peptide mit Sequest und Maskottchen erhalten wesentlich verbessert wurden, wenn der Standardwert scoring-Algorithmus des jeweiligen Software-Programm mit der adaptive scoring geändert wurde Algorithmus Percolator, darauf hinweist, dass optimale scoring Algorithmen zur endogenen Peptiden unterscheidet sich von der tryptic Peptide13. Studie, Identifikation anhand automatischer Peptid de Novo Sequenzierung mit Hilfe der Software PEAKS (BSI) Ergänzend zu den zwei Fragment Ion fingerprinting-basierten Suchmaschinen gefunden wurde, identifiziert, wodurch eine erheblich größere Anzahl von Peptide.
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Protocol
Die nachfolgend beschriebene Protokoll ist eine verfeinerte Version des einen in einer früheren Studie verwendet, wo eine große Menge von endogenen Peptiden in menschlichen CSF15identifiziert wurden. Updates für das ursprüngliche Protokoll betreffen kleine Änderungen der chemischen Vorbehandlung von CSF sowie Optimierung des Verlaufs für offline hohem pH-Wert RP HPLC Pre Fraktionierung verwendet.
Ethische Überlegungen
Alle Studien von schwedischen Patienten und Kontrolle von ethischen Komitees genehmigt worden: St. Göran (Nr. 2005-554-31/3). CSF aus Amsterdam Demenz Kohorte und Proben im National Hospital für Neurologie und Neurochirurgie, London gesammelt wurden für Forschung mit schriftlicher Zustimmung von allen teilnehmenden Patienten und Genehmigung von regionalen Ethik-Kommissionen eingesetzt. Hier hauptsächlich verwendete Material bestand aus übrig gebliebenen CSF von Proben zum Zweck der Diagnose und anonymisierte vor Aufnahme in unsere Studien. Es gibt keine Möglichkeit der Rückverfolgung der Probe jeden einzelnen Spender oder Gruppe von Gebern.
1. Gewinnung von menschlichen zerebrospinale Flüssigkeit (CSF):
- Extrahieren von CSF durch Lumbalpunktion (muss durch einen ausgebildeten Arzt erfolgen) mit einem standardisierten Protokoll22.
- Zellenrückstand und andere nicht-löslichen Material durch Zentrifugation bei 2.500 x g für 20 min zu entfernen.
- Überprüfen Sie die CSF-Proben für die Verfärbung, die Blut-Kontamination durch Punktion Blutungen hinweisen. Die deutlich höhere Proteinkonzentration im Blut und das Vorhandensein von Proteasen kann großen Einfluss auf die Analyseergebnisse.
(2) vor der Behandlung von CSF (1,5 mL Probenvolumen, keine Quantifizierung):
- Tauen Sie 1,5 mL des CSF Aliquote bei Raumtemperatur (RT), übertragen Sie den Inhalt an 10 mL Polypropylenröhrchen und fügen Sie 80 µL 1 M Triethylammoniumhydrochlorid Bikarbonat (TEAB hinzu) als Pufferung Agent.
- Hinzufügen von 0,65 mL 8 M Guanidinium Hydrochlorid (GdnHCl) (aktive Konzentration GdnHCl: 2,4 M) und Vortex sanft bei RT für 10 Minuten.
Hinweis: Der chaotropen Agent, GdnHCl, sowohl solvent Viskosität beeinflusst und interagiert mit der Polypeptidkette, die Ergebnisse in Protein entfaltet wird energetisch günstigen23. So GdnHCl löst Proteinaggregaten und erhöht die Regeneration von endogenen Peptiden während anschließende Filtration. - Hinzufügen von 60 µL von 200 mM von wässrigen tris(2-carboxyethyl) Phosphin-Hydrochlorid (DÄMMUND) (aktive Konzentration DÄMMUND: 6 mM) und inkubieren Sie bei 55 ° C für 1 h, Cystein Disulphides zu reduzieren.
- Fügen Sie 35 µL 400 mM Iodoacetamide (IAA) (aktive Konzentration IAA: 4 mM) und in der Dunkelheit für 30 min, Cysteine Alkylat bei RT inkubieren. Die Zugabe von einer Alkylgruppe sorgt dafür, dass Cystein Rückstände an jedem beliebigen Punkt während der nachfolgenden Probenvorbereitung neue umgeformt Brücken spontan bilden können.
- Fügen Sie 3,25 mL deionisiertes Wasser und Vortex kurz auf die Probe vor der MWCO Filtration, was zu einer Gesamtstichprobe Volumen von 5,5 mL verdünnen. Dieser Schritt dient dazu, GdnHCl, unterhalb von 1 M zu verdünnen, da eine höhere Konzentration beobachtet wurde, manchmal dazu führen, dass die Auswaschung von Polymeren Substanzen aus der Filter-Geräte.
(3) vor der Behandlung von CSF (10 x 150 µL Probenvolumen, isobare Kennzeichnung-Quantifizierung):
- Tau 150 µL des CSF Aliquote ab 10 Personen bei RT und anschließend den Inhalt auf einzelne 1,5 mL niedrig-Bindung Mikro-Zentrifuge Röhren übertragen und 8 µL 1 m TEAB als Pufferung Agent hinzufügen.
- Fügen Sie 65 µL 8 M GdnHCl (aktive Konzentration GdnHCl: 2,4 M) und Vortex sanft bei RT für 10 Minuten.
- Fügen Sie 6 µL von 200 mM von wässrigen DÄMMUND (aktive Konzentration DÄMMUND: 6 mM) und Inkubation bei 55 ° C für 1 h, Cystein Disulphides zu reduzieren.
- Fügen Sie 3,5 µL 400 mM wässrigen IAA (aktive Konzentration IAA: 6 mM) und inkubieren Sie bei RT und die Finsternis für 30 min Cysteine Alkylat.
- Bereiten Sie das isobare Labeling Kit (zB., Tandem Masse Tag 10plex isobare Kennzeichnung Reagenz). Lassen Sie die Isobaren Kennzeichnung-Reagenz-Fläschchen, RT vor dem Öffnen sie vermeiden unnötige Reagenz Hydratation, 41 µL Acetonitril HPLC-Grade (AcN) hinzufügen und auflösen durch sanfte Bewegung für 5 min zu erreichen.
- 30 µL isobare Kennzeichnung Reagenzlösung auf die entsprechende Probe übertragen und für 1 h bei RT unter schonenden rühren inkubieren. Das isobare Kennzeichnung Reagenz enthält eine NHS-Ester-Gruppe, die mit der primären Amine an Peptid N-Termini sowie mit Lysin Rückstände reagiert.
- Fügen Sie 8 µL 5 % Hydroxylamin (aktive Konzentration Hydroxylamin: 0,16 %) und schütteln Sie sie leicht bei RT für 20 min die Kennzeichnung Reaktion zu stillen. Da die gesondert gekennzeichneten Proben zusammengefasst werden sollen, sicherstellen Sie, dass die Kennzeichnung Reaktion gestillt ist. Durch Zugabe von einer Fülle von Amin Gruppen in Form von Hydroxylamin die verbleibenden isobare Kennzeichnung Reagenz reagieren darf und ist so träge gemacht.
- Kombinieren Sie den Inhalt jeder der 10 individuell beschrifteten Proben in einem einzigen 15 mL Polypropylen Röhrchen.
- Die kombinierte Probe und Wirbel kurz, die AcN-Konzentration von 12 % auf 3 % und die Konzentration der GdnHCl GdnHCl, unter 1 M reduzieren, da eine höhere Konzentration beobachtet wurde, manchmal dazu führen, dass die Auswaschung von Polymere Substanzen fügen Sie 6,4 mL deionisiertes Wasser hinzu der Filter-Geräte.
(4) Molekulargewicht Cut-off-Filtration
- Um Potenziale zu entfernen Verunreinigungen, Zustand der MWCO filtert nach laden 10 mL wässrige 1 M GdnHCl, 25 mM TEAB und Zentrifugieren für 15 min bei 2.500 x g und RT, verwerfen die Durchströmung (FT).
- Die gesamte Probe Ladevolumen auf dem Filter (5 mL nicht radioaktiv markierten CSF (Schritt 2.5) oder 10 mL isobarically etikettiert CSF (Schritt 3,9)) und Zentrifugieren für 30 min bei 2.500 x g und RT, lassen die Durchströmung (FT) in den Auffangbehälter. Das Ergebnis der Filtration ist, dass größere Proteine und Restmüll Zellenrückstand Peptiden und kleine Proteinen getrennt werden. Diesen Schritt kann die Peptidomic entspricht der Verwendung von proteolytische Verdauung von Proteinen als Peptide in Proteomic Experimente zu generieren.
- Laden Sie 5 mL 25 mM TEAB (wässrigen) auf den Filter und Zentrifuge für 15 min bei 2.500 x g und RT, um Wiederherstellung von Peptiden zu erhöhen.
- Wirbel der kombinierten FTs aus den zwei vorherigen Schritten (insgesamt 10 mL nicht gekennzeichnet oder 15 mL isobarically etikettiert Probe), und gehen Sie zum Beispiel Versauerung.
5. de-Salzen und Probe Clean-Up durch Festphasenextraktion
- Ansäuern der gefilterten Probe aus Schritt 4.4 vor Festphasenextraktion (SPE). Die Säuerung wird durchgeführt, um die gelösten (Peptid) Wechselwirkung mit der stationären Phase der SPE-Patrone zu verbessern.
- Für die Stichprobe nicht beschriftet (Volume 10 mL): 550 µL 1 % Trifluoroacetic Säure (TFA) - Gesamtvolumen der Probe hinzufügen: 10,55 mL mit 0,05 % TFA.
- Für das Beispiel Isobaren gekennzeichnet (Volumen 15 mL): Fügen Sie 20 mL 0,1 % TFA ansäuern und AcN-Konzentration von 3 % auf 1 % - Gesamtvolumen der Probe zu senken: 30 mL mit 0.066 % TFA.
Hinweis: TFA ist auch für seine Funktion als ein Ion-Paarung Reagenz hinzugefügt, die Aufbewahrung von Peptiden selbst nicht in der Lage, ausreichend stark hydrophobe Wechselwirkung mit Verpackungsmaterial der SPE Patrone auf Vorrat zu speichernden verbessert. - Wenn pH > 3, Titrieren Probe mit 20 % Phosphorsäure bis Probe pH ist < 3.
- Zustand der SPE Kartuschen durch Zugabe von 1 mL 84 % AcN, 0,1 % Ameisensäure (FA), und entsorgen die FT einmal wiederholen. Konditionierung der Filterpatrone ist erforderlich, um unerwünschte Substanzen zu entfernen, die ansonsten zusammen mit den Peptiden in den nachfolgenden Schritten eluieren würde; Darüber hinaus Klimaanlage erhöht die Durchlässigkeit des Filters.
- Equilibrate die SPE Patrone durch Zugabe von 1 mL 0,1 % TFA, verwerfen FT. Wiederholung einmal. Stellen Sie sicher, dass der Filter nach dem letzten Gleichgewichtherstellung Schritt - nicht trocken läuft immer eine kleine Menge auf den Filter. Gleichgewichtherstellung der Filterpatrone wird durchgeführt, um den Filter, Peptide zu behalten, durch das Entfernen der hydrophoben Substanz (Acetonitril) links von der Klimaanlage Schritt vorzubereiten.
- Laden Sie das gesamte Probenvolumen (10,55 mL für radioaktiv markierten Proben oder 30 mL für isobarically versehenen Proben), in mehreren Portionen bei Bedarf zu, und lassen Sie die FT Abfall stoßen. Stellen Sie sicher, dass die Patrone nicht trocken laufen zwischen Probe laden runden oder nach das letzten Probenvolumen geladen wurde - halten Sie eine kleine Menge auf den Filter.
- Pass 1 mL 0,1 % TFA über den Filter zu entfernen, salzen und Reagenzien und verwerfen die FT-Wiederholung einmal. Stellen Sie sicher, dass die Patrone nach jedem Waschen - nicht trocken läuft immer eine kleine Menge Flüssigkeit auf der Oberseite der Patrone.
- Statt 1,5 mL geringe Bindung Micro Zentrifugieren Rohre unter der Patrone und eluieren Probe indem man 1 mL von 84 % AcN, 0,1 % FA über die Patrone.
- Entfernen Sie das Lösungsmittel aus der de-gesalzene Probe durch Verdunstung in einer Vakuum-Zentrifuge laufen ohne aktive Heizung trocknen, bei-80 ° C lagern oder gehen Sie sofort zu hohem pH-Wert Fraktionierung.
(6) Offline hohem pH-Wert Reverse Phase HPLC Probe Fraktionierung
-
Bereiten Sie wässrigen hohem pH-Wert (HpH) mobilen Phasen:
HpH Puffer A: Reinwasser
HpH-Puffer B: 84 % AcN
HpH-Puffer C: 25 mM NH4OH
HpH laden Puffer: 2,5 mM NH4OH, 2 % AcN
Hinweis: HpH laden Puffer wird als Transport-Lösung und Probe-Puffer verwendet. - Wieder auflösen der Probe in 16 µL HpH laden Puffer durch sanfte Bewegung für 20 min.
- Laden Sie 15 µL der Probe auf einem HPLC-System mit einer internen Fraktionssammler für 96-Deep-Well-Platten konfiguriert nach Batth Et al. 20 mit geringfügigen Änderungen. Fraktionieren bei einem Durchfluss von 100 µL/min über einen pH-stabil-Trennsäule (C18 3,5 µm, 2,1 x 250 mm) und ein Bruchteil / min. über eine lineare 60 min-Gradienten zu sammeln.
- Verwenden Sie die folgende Steigung Zeit-Punkte: t = 0 min, B = 1 %, C = 10 %; t = 4 min, B = 1 %, C = 10 %, Start Fraktionssammlung; t = 76 min, B = 70 %, C = 10 %; Ende Fraktionssammlung; t = 76,5 min, B = 85 %, C = 10 %; t = 80 min, B = 85 %, C = 10 %; t = 80,5 min, B = 1 %, C = 10 % und t = 90 min, B = 1 %, C = 10 %.
- Sammeln Sie Brüche wiederholt in 12 Brunnen in einem kreisförmigen Muster, so verketten Bruchteile von 12 min, was 12 Fraktionen jeweils 6 verkettete Sub Fraktionen verteilt.
- Entfernen Sie des Lösungsmittels aus Proben von Vakuum Zentrifugation bei RT und 3000 u/min bis es trocken, und speichern Sie die Proben bei-80 ° C vor der LC-MS-Analyse.
(7) LC-MS
-
Bereiten Sie wässrige mobile Phasen:
Puffer A: 0,1 % FA
Puffer B: 0,1 % FA, 84 % AcN
Puffer geladen: 0,05 % TFA, 2 % AcN
Hinweis: Ladepuffer dient als Transportlösung, Probenpuffer und mobile Phase für die Beladung Pumpe. - Lösen Sie jedes der 12 Fraktionen erneut durch Zugabe von 6 µL Ladepuffer und schütteln bei RT für 20 min auf
- Last 5 µL Probe auf eine Nano-Flow-HPLC, im Falle Spaltenkonfiguration (Trap-Säule: 75 µm 2 cm, C18100 Å Porengröße, 3 µm Partikelgröße; Trennsäule: C18, 75 µm x 500 mm, 100 Å Porengröße, 2 µm Partikelgröße , und führen Sie Peptid Trennung bei einem Volumenstrom von 150 nL/min mit der folgenden Farbverlauf: t = 0 min, B = 2 %; t = 10 min, B = 2 %; t = 11 min, B = 7 %; t = 100 min, B = 26 %; t = 170 min, B = 45 %; t = 175 min, B = 80 %; t = 181 min, B = 2 % und t = 210 min, B = 2 %.
-
Führen Sie MS auf hochauflösenden Hybrid Massenspektrometer mit der HPLC über eine Nano-ESI-Schnittstelle verbunden. Vollständiger Scan Spektren in MS-Modus in einer Auflösung von 120.000 (2.0e5 AGC Ziel) über den m/Z -Bereich 350-1.400 aufzeichnen.
- Betreiben Sie das Massenspektrometer in datenabhängiges Akquisitionsmodus, wählen Sie MS/MS-Spektren von den obersten zehn intensivsten Gipfeln mit m/Z > 150 und in der Intensität Range 1.0e4-1.0e5 für Fragment Ionenanalytik. Isolieren Sie Vorläufer Ionen mit einem Quadrupol-Isolierung-Fenster von 1 m/Z, maximale Einspritzzeit von 100 ms und die RF-Linse bei 60 %.
- Wenden Sie dynamische Ausgrenzung mit Ausschluss von 15 s und ein m/Z -Toleranz von ±10 ppm. Fragmentierung in der höheren Aufprallenergie Dissoziation (HCD) Zelle führen und MS/MS Übernahmen in der Orbitrap bei einer Auflösung von 50.000 (5.0e4 AGC Zielwert) aufzeichnen.
8. die Peptid-Identifikation
-
Reichen Sie für Peptid-Identifikation die resultierenden Ausgabe-Dateien aus der massenspektrometrischen Analyse einer Proteomics-Suchmaschine, die Anwendung der folgenden Einstellungen ein:
Hinweis: In unserem früheren Studie15, drei Suchmaschinen; Maskottchen v2.4, Sequest HT und Gipfeln 7.5 parallel verwendet wurden und die hier angegebenen Einstellungen wurden für alle drei Suchmaschinen eingesetzt, sofern nicht anders angegeben. Der Großteil der anpassbare Einstellungen sind universell für Peptid/Proteinidentifikation und entsprechende Einstellungen in einer bestimmten Suchmaschine haben sollte.
Spektrum-Selektor:
Min. Vorläufer Masse: 350 Da
Max. Vorläufer Masse: 5.000 Da
Scantyp: voll
Signal-/Rauschverhältnis Schwelle: 1,5
Sequenz-Datenbank-Suche
Datenbank: UniProt_SwissProt [version2015_11]
Taxonomie: Homo sapiens
Enzym: keiner
Max. Spaltungen verpasst: 0
Instrument (nur Maskottchen): ESI-Trap
Min. Peptid Länge (nur SequestHT): 6
Max. Peptid-Länge (nur SequestHT): 144
Vorläufer Masse Toleranz: 15 ppm
Fragmentieren Masse Toleranz: 0,05 Da
Statische Änderungen: Carbamidomethyl (C); [Wenn gekennzeichnet] TMT10plex (N-Bezeichnung)
Dynamische Änderungen: Oxidation (M); [Wenn gekennzeichnet] TMT10plex (K)
Peptid-Spektrum passen (PSM) validator
Kaffeemaschine (Maskottchen und Sequest HT nur) oder Köder Fusion (nur Spitzen)
Ziel der FDR: 0,01
Validierung anhand: Q-Wert
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Representative Results
Die hier beschriebene Methode wurde angewendet und evaluiert in drei Studien vor der Einführung der Probe vor Fraktionierung (Tabelle 1). Die erste Studie offline LC für spotting CSF Fraktionen auf eine MALDI-Zieltafel verwendet und 730 identifizierten endogene Peptide11ergeben. In den beiden folgenden Studien wurde die Isobaren Kennzeichnung eingesetzt. In erster Linie in einem Fall/Dimmer Studie zur Identifizierung und Charakterisierung potenzieller Biomarker in der CSF Endopeptidome und Proteom gleichzeitig24, und in der zweiten Studie isobare Kennzeichnung wurde zur Überwachung der Behandlungseffekte in-vivo ein γ-Sekretase-Inhibitor auf dem Peptid-Ausdruck in CSF über 36 h16. In dem Fall/Kontroll-Studie wurden 437 endogene Peptide identifiziert, 64 davon wesentlich verändert in der Konzentration zwischen Individuen mit AD und gesunden Kontrollpersonen. Die dritte Behandlung Studie identifiziert 1798 endogene Peptide, 11 der überwachten Peptide konnte gezeigt werden, auf die Behandlung reagieren.
In der vierten Studie war das Ziel, die Zahl der identifizierten CSF Peptide, besonders um unteren reichlich Peptide zu identifizieren. Daher Peptid Pre Fraktionierung von HpH-RP-Chromatographie war im Preis inbegriffen und ein 10-divisibel größeren CSF Probenvolumen verwendet wurde, was bei der Identifizierung von 16.395 Peptide. In dieser Studie erfolgte keine isobare Kennzeichnung. Neben Probe Fraktionierung die jüngste Studie beschäftigt eine kombinierte Peptid-Identifizierung nähern, während in den ersten drei Studien nur eine einzelne Datenbanksuche durchgeführt wurde, für einige Maße Konten für die größere Zahl von Peptiden identifiziert. Vergleicht man die Ergebnisse der einzelnen Suchmaschinen (Maskottchen, Sequest HT oder Spitzen) aus der jüngsten Studie zeigt, dass die verwendeten Algorithmen sind in gewisser Weise komplementär seit eine relativ kleine Menge, weniger als 15 % (2440), Peptide sind durch alle drei Suchmaschinen (Abbildung 2) identifiziert. Weiter, die de-Novo-Sequenzierung Motor Gipfel war die Suche effizient identifizieren körpereigene Peptide, aber mehr als 5.400 Peptide nicht identifiziert worden wäre wenn nur Gipfel gewesen wäre verwendet (Abbildung 2). Die Anwendung von mehreren Suchmaschinen auf das gleiche Material hat Potenzial mehrere Testprobleme und richtete sich mit einem Test der Identifikation Richtigkeit13. Die erworbenen MS/MS-Rohdaten sowie alle Ergebnisse aus Proteomic Suchanfragen aus der jüngsten Studie haben in der PRIDE-Daten-Repository über ProteomeXchange mit Kennung PXD004863 verfügbar gemacht.
Abbildung 1: eine Visualisierung der wichtigsten Schritte der Methode Protokollschema. Gewinnung von Liquor cerebrospinalis durch Lumbalpunktion gefolgt durch Zentrifugation nicht löslichen Material, 2 entfernen) Zugabe von GdnHCl zum Beispiel Peptid-Protein-Aggregate, Erhöhung der Erholung von endogenen Peptiden zu distanzieren; Verringerung und Alkylierung von Cystein Disulphides; isobare Kennzeichnung für Peptid Quantifizierung (optional) 3) molekularen Gewicht Filtration schieden die endogene Peptide von den Proteinen, 4) Festphasenextraktion, Salze und andere polare Verunreinigungen, 5 entfernen) RP HPLC Pre-Fraktionierung, alkalisch mobilen Phase Steigung und Verkettung von jeder 12th Bruchteil 6) RP-HPLC-MS/MS, sauren mobilen Phase Farbverlauf, jede verkettete Fraktion laufen nacheinander 7) Peptid Identifizierung durchgeführt durch die Vorlage MS/MS-Daten aus allen 12 Analyse läuft als ein Einzelprobe zu den Suchmaschinen, anschließend Peptid-IDs verglichen wurden und eine Summierung von alle einzigartig Peptid IDs wurde durchgeführt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Studienzusammenfassung | TMT Kennzeichnung (j/n) | HpH-RP Fraktionierung (j/n) | Entsprechenden Volumen des CSF pro MS-Analyse (µl) | Anzahl der identifizierten Peptide | Kommentar | Referenz |
| Explorative Analyse der CSF-peptidome | n | n | 500 | 730 | Offline LC MALDI Ziel Vorbereitung, MALDI-MS; Bewertung von MWCO filtern | 4 |
| Quantitativer Vergleich der CSF Peptide; Proben von 20:00 + 8 Strg | y | n | 200 | 437 | HPLC-ESI-MS; kombinierte Peptidomic und Proteomik-Protokoll | 25 |
| AD Gamma-Sekretase Inhibitor Behandlung Studie | y | n | 300 | 1798 | HPLC-ESI-MS; CSF extrahiert zu sechs Zeitpunkten nach der Behandlung | 17 |
| Ausbau der CSF-peptidome | n | y | 750-1000 | 18.031 | HPLC-ESI-MS; Kombination von Peptid-Identifikation-Software | 15 |
Tabelle 1: Eine Zusammenstellung von aktuellen Studien durchgeführt, die von dieser Gruppe das Molekulargewicht Filtration und massenspektrometrische Analyse zur Identifizierung von endogenen Peptiden in menschlichen CSF gilt.
Abbildung 2: ein Venn-Diagramm vergleicht die Peptid-Identifikation-Ergebnisse aus jeder der drei Suchmaschinen Maskottchen, Sequest HT und Spitzen erhalten. Insgesamt 16.395 endogene Peptide wurden identifiziert. Die de-Novo-Sequenzierung Suche Motor PEAKS identifiziert 10.967 endogene Peptide; Fragment-Ionen fingerprinting-basierten Suchmaschinen Maskottchen und Sequest HT 8118 und 7304 endogene Peptide bzw. identifiziert. Die Identifikation Konsens zwischen allen drei Suchmaschinen belief sich auf 2440 endogene Peptide oder 14,8 %. Es gab eine relativ große Identifikation Überschneidung zwischen Maskottchen und Sequest HT, entspricht 70 % ihrer kombinierten Peptid-Identifikationen. Gipfeln hatte eine vergleichsweise geringe Identifikation überschneiden sich mit Maskottchen und Sequest HT; 20,5 % 18,9 % bzw.. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die Einführung eines hohem pH-Wert RP HPLC Pre Fraktionierung Schritts auf ein zuvor entwickelte Protokoll für die Wiederherstellung von endogenen Peptiden durch Molekulargewicht Ultrafiltration11 relative Probe Komplexität reduziert und dadurch für eine 5-fach größere erlaubt Probenvolumen untersucht werden. Dies wiederum erhöht die Konzentration der Teilmenge von Peptiden in jede Fraktion vertreten und dadurch verbessert die Chancen auf Erkennung von niedrigen reichlich Peptide.
Durch das Ausführen einer Identifikation Strategie für endogene Peptide die drei Proteomic Software parallel eingesetzt, war es möglich, die bekannten CSF Endopeptidome mehr als 10-divisibel zu erweitern. Insgesamt 16.395 endogene Peptide wurden in einer vorläufigen Studie auf eine gepoolte CSF Probenmaterial identifiziert. Unter den Kennzeichnungen wurden eine große Anzahl von endogenen Peptiden abgeleitet Proteine bereits erwähnt im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen. Einige Peptide, die in den oben genannten Studien identifiziert werden derzeit als Biomarker in unserem Labor geprüft. Dieser Prozess umfasst mehrere Schritte, einschließlich der Überprüfung der Peptide Identitäten von Spick CSF mit synthetischen Analoga gekennzeichnet mit schweren Isotopen, Einrichtung von gezielten massenspektrometrische Assays, Bewertung Peptid Stabilität während der Lagerung und Frost-Tau-Zyklen und Analyse verschiedener klinischer Kohorten.
Änderungen wurden vorgenommen, um Einführung von Verunreinigungen (Schritt 2.5 und 3.5) zu vermeiden, das ursprüngliche Protokoll, als Folge einer hohen Konzentration an GdnHCl in der Probe bei der MWCO-Filtration. Ein Update auf den Pre-Fraktionierung Farbverlauf (Schritt 6.3.1) erfolgte, Kapazität verlängert, linearen Farbverlauf verwendet wird.
Die primären Ursachen der Analyten Verluste in dem hier beschriebenen Protokoll können die beiden RP chromatographische Schritte sowie die MWCO Filtration und SPE Probe aufräumen Schritt zugeschrieben werden.
Das Peptid Verluste durch Interaktion mit dem MWCO-Filter oder Proteine beibehalten, während der Filtration sind schwer zu vermeiden und möglicherweise eine Quelle für inter Probe Variation.
Weitere entstehen selektive Verluste wahrscheinlich in den RP-chromatographischen Schritten. Da Peptid Hydrophobie pH-abhängig ist, kann Schritten zwei aufeinanderfolgende RP chromatographische bei Ebbe und pH-Wert, bzw. Verluste der Teilmenge von Peptiden führen, die zu hydrophilen bei pH ≥9 auf die Spalte und ebenso eine zweite aufzubewahren sind Teilmenge zu hydrophilen bei pH ≤3 beibehalten werden.
Im Vergleich zum bisher verwendeten Methoden, die die Beschäftigung von Pre-Fraktionierung zu einer 10-divisibel bei der Identifizierung von endogenen Peptiden geführt hat. Es ermöglichte es für erfolgreiche Erkennung einer Vielzahl von bisher unbekannten Peptiden und ist daher ein wertvolles Instrument für die Untersuchung und Erforschung des CSF Peptidome und möglicherweise anderen komplexen biologischen Proben sowie.
In Kombination mit gemultiplexten isobare Kennzeichnung, die das Protokoll weiter angewendet werden, um Biomarker Kandidaten für die verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen im Liquor, Blut und Gehirn Gewebe zu identifizieren soll.
Unterschiedlichen Erholung in die Probe Vorbereitungsschritte trägt zur analytischen Variation für die Analyse von CSF Proteinen und Peptiden durch Durchführung von LC-MS. isobare Kennzeichnung von Peptiden in einem frühen Stadium in die Probe Vorbereitung verringert den Einfluss solcher Variation stark. Im Vergleich zu bereits gemeldeten Probe Vorbereitung Protokolle, stieg die Umsetzung von hohem pH-Wert-reversed-Phase Peptid Pre Fraktionierung die Zahl der identifizierten Peptide um den Faktor 5. Identifikation von endogenen Peptiden aus MS/MS-Daten wurde deutlich verbessert, wenn Sie verschiedene Peptid Identifikation-Software-Programme mit verschiedenen Such-Algorithmen zu kombinieren.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte, finanziellen oder sonstigen zwischen Autoren sind berichtet worden.
Acknowledgments
Vielen Dank an Tanveer Batth und Kollegen für die Beratung bei der Einrichtung der Pre-Fraktionierung-Methode.
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Mittel vom schwedischen Forschungsrat, der Wallström und Sjöblom Foundation, die Waffe und Bertil Stohne Stiftung Stiftelse, Magnus Bergwall Stiftung, Åhlén Stiftung, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen för Gamla Tjänarinnor, Knut und Alice Wallenberg Foundation, Frimurarestiftelsen und FoU Västra Götalandsregionen.
Die wichtigsten Empfänger von Zuschüssen für dieses Projekt waren Kaj Blennow, Henrik Zetterberg und Johan Gobom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Triethylammonium bicarbonate | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
| 8 M Guanidinium hydrochloride | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Pierce | 20490 | TCEP |
| Iodoacetamide | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hydroxylamine 50% (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
| Formic acid | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
| Triflouroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO-filter |
| Sep-Pak C18, 100 mg | Waters | WAT023590 | SPE-column |
| Resprep 12-port SPE Manifold | Restek | 26077 | Vacuum manifold |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Online sample separation |
| Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Offline high-pH fractionation |
| Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Mass spectrometer for sample analysis |
| Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Proteomics search platform |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Proteomics search engine |
| Sequest HT | Thermo | - | Proteomics search engine |
| PEAKS v7.5 | Bioinformatic Solutions Inc.) | - | Proteomics search engine |
| Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Trap column (nano HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Separation Column (nano HPLC) |
| Savant SpeedVac High Capacity Concentrators | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Vacuum concentrator |
| XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm | Waters | 186003566 | Separation Column (micro HPLC) |
References
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