Summary
Denne protokol beskriver en effektiv måde at overvåge celle persistens og biodistributionen af menneskers fedt-afledt mesenkymale stamceller (haMSCs) af far-red fluorescens mærkning i en rotte knæet slidgigt (KOA) model via intra-artikulær (IA) injektion.
Abstract
For at støtte den kliniske anvendelse af humane fedt-afledt mesenkymale stamceller (haMSC) terapi til knæet osteoarthritis (KOA), undersøgte vi effekten af celle persistens og biodistributionen af haMSCs i dyremodeller. Vi demonstrerede en metode til at mærke cellemembranen af haMSCs med lipofile fluorescerende farvestof. Efterfølgende, blev intra-artikulær injektion af mærket cellerne i rotter med kirurgisk induceret KOA overvåget dynamisk af en i vivo imaging system. Vi ansat den lipofile carbocyanines gjorde (DilC18 (5)), en far-red fluorescerende Dil (dialkylcarbocyanines) analog, som udnyttede en rød laser for at undgå excitation af den naturlige grønne autofluorescence fra omkringliggende væv. Desuden rød-forskudt emission spektre af tilladt dybe væv imaging med levende dyr og den mærkning procedure forårsagede ingen cytotoksiske virkninger eller funktionelle skader på haMSCs. Denne tilgang har vist sig at være en effektiv sporingsmetode for haMSCs i en rotte KOA model. Anvendelsen af denne metode kan også bruges til at bestemme optimal administration rute og dosering af MSCs fra andre kilder i prækliniske studier.
Introduction
Knæet slidgigt (KOA) er en degenerativ sygdom som følge af tab af ledbrusk og progressiv inflammation, som er blevet en større kroniske sygdom hos ældre omkring verden1. Nuværende behandlinger ved hjælp af anti-inflammatoriske lægemidler, fysiske kosttilskud og kirurgiske procedurer kan imidlertid kun yde midlertidig lindring for symptomatisk smerte2.
Menneskelige fedt-afledt mesenkymale stamceller (haMSCs) er blevet en lovende regenerativ middel mod knæ slidgigt, på grund af deres Multipotente differentiering potentiale for brusk regenerering og immunmodulerende egenskaber3, 4. Sammenlignet med farmakologiske ruter til at undersøge mekanismerne i aktion i vivo, er tracking live haMSCs i små KOA dyremodeller i øjeblikket lærerigt at etablere begrundelsen for og gennemførligheden af haMSC terapi før kliniske anvendelse. For præklinisk afprøvning, destabiliserer mediale meniscectomy (MM) den mekaniske belastning af fælles at fremkalde KOA i rotter, som giver et relativt realistisk model med konsekvent reproducerbarhed5. Udbrud af KOA induceret af MM er tidligere end forreste korsbånd transection alene eller kombineret med delvis mediale meniscectomy6. De langsigtede interaktioner mellem injiceres haMSCs med den patologiske mikromiljø af KOA vurderes derfor ofte i rotter induceret af MM7,8.
Om den terapeutiske virkning af haMSCs har været flittigt rapporteret, relevante viden på er implanteret haMSCs via intra-artikulær (IA) indsprøjtning i vivo persistens knappe9,10. Dermed er forskellige cellulære mærkning metoder blevet udviklet, herunder immunohistology11, luciferase12, grøn fluorescerende protein13 Transfektion, jernoxid mærkning for magnetisk resonans imaging (MR)14 , og talrige fluorescerende celle farvestoffer8,15,16. Sammenlignet med arbejdskrævende histologi analyser, beskæftiger i vivo ikke-invasive billeddannelse optiske enheder til at registrere real-time distribution og dynamikken i celler mærket med fluorescerende signaler10,17. For funktionelle levende celle imaging er cytocompatible fluorescerende mærkning en sofistikeret radioaktivt-fri tracking teknik til at afsløre cellulære aktiviteter efter stamcelle transplantation18. Derudover besidder multicolor fluorescerende lipofile farvestoffer fordele over hydrofile amino-reaktive farvestoffer eller fluorescerende proteiner, herunder deres forbedret celle permeabilitet og forbedret fluorescens quantum udbytter19.
Således protokollerne her udnytter en rød laser til at ophidse celler mærket med lipofile carbocyanines gjorde (DilC18(5)), som er en far-red fluorescerende Dil (dialkylcarbocyanines) analog20. De rød-forskudt excitations- og spektre af undgår autofluorescent indblanding og giver dyb væv imaging over en lang periode i levende dyr8. Denne metode til sporing celler i vivo mærket med gjorde er gyldig for overvågning transplanterede stamceller, såsom haMSCs, i dyremodeller, som er afgørende for at forstå og forbedre nuværende regenerativ stamcelleterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
procedurer, der involverer dyr emner blev godkendt af lokale institutionelle Animal Care og etiske komité, med et forsøg på at Minimer dyrs lidelser. Følgende protokol blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på Shanghai niende folk ’ s Hospital tilknyttet Shanghai JiaoTong University School of Medicine med protokollen nummer [2017] 063.
1. etablering af en Surgically-Induced rotte knæet slidgigt Model
- For denne kirurgiske procedure, brug 8-12 uge gammel mandlige Sprague Dawley (SD) rotter med en vægt mellem 250 og 300 g.
- Bedøver dyr med 40 mg/kg Tiletamin og 40 mg/kg zolazepam via intramuskulær injektion.
- Placere dyret i en venstre sideleje på et opvarmet scenen. Barbere den højre knæ grundigt med en barberkniv. Desinficere det kirurgiske område med 10% providone-jodopløsning efterfulgt af 70% ethanol, Gentag to gange og derefter male med 10% providone-jodopløsning og dækker den ikke-kirurgiske område med en kirurgisk pad.
- Ved hjælp af en kirurgisk skalpel, gøre en 2 cm incision lateralt langs patellar senen til at afsløre jointcapsules.
- Bruge en kirurgisk skalpel til at Transekttællinger den mediale sideledbånd. Afspejle menisk mod lårbenet.
- Dryppe steril 0,9% natriumchlorid løsning på overfladen af ledbrusken under operationen at forhindre brusk fra udtørring.
- Snup den mediale menisk med pincet og skære igennem menisken på sit smalleste punkt fra den tibial vedhæftet fil med en skalpel ( figur 1A). Undgå at beskadige brusken.
- Lukke ledkapsel med en 4-0 resorberbar sutur.
- Overvåge de kirurgiske rotter, indtil de genvinde bevidsthed.
- Indsprøjtes 20 mg/kg gentamicin for at forhindre infektion og 0,05 mg/kg buprenorphin gennem en intramuskulær rute til at lindre smerter efter operationen.
- Vedligehold rats i en temperatur-kontrollerede dyr facilitet under en 12t lys/mørke cyklus for 3-8 uger at debut KOA. Dyr fortsat vil modtage smertestillende medicin, herunder men ikke begrænset til buprenorphin (0,05 mg/kg, i.m.) og Gentamicin (20 mg/kg, i.m.), hvis smerte symptomerne vedvarer.
2. Histologi vurdering af rotte KOA Model
- ofre rotter med overdreven CO 2 inhalation (Tilføj en ordreudførelsesgrad omkring 30% af salen volumen pr. minut med kuldioxid til eksisterende luften i kammeret til at gøre den animalske bevidstløshed inden for 2-3 min. opretholde CO2-strømmen til et minimum på 1 min. efter respiration ophører.) på angivne tidspunkter (repræsentant resultater er vist på 8 uger af KOA induktion spænder fra 3 til 8 uger) efter kirurgi.
- dissekere hud og muskler omkring knæet leddene og afskære knæleddene med en skalpel.
- Løse knæled i 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 3 dage ved stuetemperatur. Bagefter, afkalke prøver i 20% ethylendiamintetra syre (EDTA) for ca 4 uger ved 4 ° C, og ændre EDTA hver 3 dag.
Forsigtig: PARAFORMALDEHYD er giftigt, bære passende personlige værnemidler (PPE), såsom handsker og briller. - Dehydrere prøver ved hjælp af en automatisk væv processor. Angiv menuen til at starte en flush cyklus som følger: 70% ethanol i 1 time; derefter 80% ethanol og 95% ethanol for 1 h henholdsvis; efterfulgt af 2 cykler 100% ethanol for 1 h; efterfølgende, xylen to gange i 1 time hver gang og paraffin 3 gange på 58 ° C i 1 time hver gang.
Forsigtig: Xylen er giftige, så slid passende PPE, såsom handsker og briller.
Bemærk: Du kan eventuelt bruge Coplin krukker for manuel dehydrering med den samme struktur som den automatiske væv processor. - Placere den mediale aspekt af den intakte fælles ansigt ned og integrere det i paraffin blok med væv indlejret i byens.
Bemærk: Vælge at bruge pincet til at integrere prøverne i paraffin blok manuelt. - Begynder at skære 5 µm sagittal sektioner fra den mediale margin af fælles for 30 µm intervaller med 2 serielle sektioner af Rotationsmikrotom.
- Montere sektioner på glas dias og deparaffinize dias i xylen. Mellem afsnittene 2 serielle pletten ét dias med hæmatoxylin & Eosin (H & E) farvning: 0,1% hæmatoxylin i 15 min., 1% eddikesyreopløsning til 10 s og 0,5% Eosin i 10 min. Og plette andre diaset med Safranin O/hurtig grøn farvning: 0,1% hæmatoxylin for 15 min, 0,02% hurtigt grøn i 3 min., 1% eddikesyreopløsning til 10 s og 0,1% Safranin O til 3 min.
Forsigtig: Xylen er giftigt, bære passende PPE, som handsker, briller. - Score de farvede dias ved hjælp af slidgigt Research Society International (OARSI) histopatologisk vurdering System i rotter 6.
3. Mærkning af humane mesenkymale stamceller med fluorescerende farvestof gjorde
- forberede gjorde celle-mærkning løsning i 100% ethanol i en koncentration på 1 mM. Beskytte den celle-mærkning løsning fra lys og opbevar den ved stuetemperatur op til 6 måneder.
- Grow haMSCs med standard celle kultur procedurer i Dulbecco ' s ændret Eagle ' s medium (DMEM) suppleret med 1% penicillin og streptomycin og 10% føtalt kalveserum (FCS) i et 10 cm petriskål.
- Frigør haMSCs med 2 mL 0,25% trypsin med 1 mM EDTA forud for ca. 80% sammenløbet.
- Neutralisere trypsin med 4 mL næringssubstratet og spin celler ved 800 x g i 3 min ved stuetemperatur.
- Suspendere celler med en tæthed på 1 x 10 6 celler/mL i 5 mL serum-fri næringssubstratet.
- Mærke cellerne ved at tilføje 50 µL gjorde celle-mærkning løsning i 5 mL serum-fri dyrkningsmediet ved 37 ° C til 50 min.
- Spin mærket cellerne ved 800 x g i 3 min.
- Cellerne vaskes to gange med 5 mL fosfat buffer saltvand (PBS) ved 800 x g i 3 min.
- Kontrollere den mærkede haMSCs ved hjælp af et mikroskop for fluorescerende med et Cy5 filtersæt.
- Tælle celler med trypan blå farvning og få 2,5 x 10 6 levedygtige celler i 100 µL PBS injektionsvæske.
4. In Vivo Fluorescerende Imaging til spor haMSCs
- otte uger efter kirurgi (trin 1), bedøver KOA rotter ved intramuskulær injektion af 25 mg/kg Tiletamin og 25 mg/kg zolazepam.
- Barbere den højre knæ grundigt med en skraber til at udsætte det fælles område. Desinficere det fælles område med 70% ethanol.
- Ved hjælp af en 26 G sprøjte nål, injicere 2,5 x 10 6 mærket celler suspenderet i 100 µL PBS på midten af Trekantområdet dannet af den mediale side af patella ligament, den mediale femoral kondyl og medial tibial kondyl ( figur 1B).
- Åbne den software til billedbehandling og initialisere i vivo bioluminescens imaging system.
- Position rotter i liggende stilling i den centrale etape af den billedbehandlingssystem og lukke døren til kammeret.
- Tjek den " fluorescerende " afkrydsningsfeltet, og vælg fluorescerende filter indstiller på 640 nm for excitation og 680 nm for emission ( figur 2A).
- Vælg synsfelt til D. sæt pixel binning til medium (8), F/Stop til 2 og eksponering tid til auto. Opretholde den optimale eksponeringstiden konsekvent at opnå sammenlignelige resultater på tværs af hele undersøgelsen ( figur 2A).
- Fjerne dyret fra scenen og skærm til nyttiggørelse fra anæstesi.
Bemærk: Sted dyr på en varmepude dækket med 2-3 lag frotté. - Vælg enheder af strålende effektivitet til måling af fluorescens ( figur 2B). Vælg regioner af interesse (ROI) for analyse og kvantificere fluorescerende signaler fra hvert billede ( fig. 2 c).
- Gentage proceduren for i vivo billeddannelse for hver rotte sekventielt til at studere haMSCs langsgående fastholdelse i leddet.
Bemærk: Vi anbefaler imaging dyrene ' fluorescerende signaler af in vivo billeddannelse system en gang hver to dage for den første uge efter injektion, og en gang hver uge indtil signalet ikke kan påvises.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at fremkalde KOA model, blev MM udført i den rigtige knæleddet af SD rotter (figur 3). Otte uger efter kirurgi, rotter blev ofret og de serielle sektioner af knæled blev vurderet med både H & E og Safranin O/hurtig grøn farvning (figur 4). For H & E farvning, overfladen af ledbrusken udstillet grovere grænser i kirurgi knæ end den normale fælles uden kirurgi. Safranin-O/hurtig grøn farvning, vi observeret nedsat proteoglycan (røde pletter) og øget fibrillated kollagen (grøn farvning) i fælles kirurgi sammenlignet med den normale, som angivet progression af degenerative KOA fænotyper induceret af kirurgi. Til at ligne progression af menneskelige KOA, blev rotter ofret på 3 uger, 6 uger, og 8 uger efter MM at vurdere patogenese og bestemme tidspunktet for terapeutiske indgreb.
Mærket haMSCs blev visualiseret i KOA rotte model af en optisk i vivo imaging system. 1 h efter mærkning, mærket haMSCs udstillet runde figurer i vitro. Den mærkning effektivitet nåede omkring 95%. Efter 24 timer, kulturperler gjorde mærket haMSCs udstillet lang spindel figurer, der angiver gjorde ikke ændre mulighed for overholdelse af haMSCs i vitro (figur 5). Otte uger efter kirurgi, blev 2,5 x 106 gjorde-mærket haMSCs sprøjtet ind i leddene med KOA. Her, mærket haMSCs blev observeret i den lokale fælles fra dag 0 (8 uger efter operationen) indtil dag 70 post injektion (18 uger efter operationen) ved hjælp af en i vivo imaging system (figur 6).
Figur 1: skematisk kirurgiske felt MM kirurgi og injektion areal for celle levering. (A) denne skematisk diagram skildrer den kirurgiske område, der er fremhævet af blå farve. (B) denne skematisk diagram viser injektionsstedet i den røde cirkel område. Akronym definitioner er som følger: MM, mediale menisk; MCL, mediale sideledbånd; LM, lateral menisk; LCL, laterale sideledbånd; PL, patella ligament. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: skærmbilleder af in vivo billedbehandlingsprogrammer. (A) nøglen indstillinger af parametre for fluorescerende billede erhvervelse er fremhævet med røde firkanter. (B) strålende effektivitet er valgt som enhed til måling af fluorescens. (C) i værktøjskassen, regioner af interesse (ROI) er kredsede fluorescens effektivitet målinger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: procedurer for kirurgisk induceret KOA. (A) eksponering af knæ fælles rum. (B) den indre struktur af knæleddet, med en sort pil, der angiver den mediale menisk. (C) den dissekerede mediale menisk. (D) det fælles rum og huden er lukket.
Figur 4: repræsentative histologiske billeder af knæled og statistisk analyse for OARSI score af KOA. (A) otte uger post MM kirurgi i rotter, seriel sektioner af knæled blev vurderet med H & E og Safranin O/hurtig grøn farvning. H & E farvning viste en nedsat tykkelse af brusk i knæet for kirurgi. Safranin O/hurtig grøn farvning viste faldt proteoglycan (røde pletter) og øget fibrillated kollagen (grøn farvning) i kirurgi knæet sammenlignet med normale knæ. Skalalinjen = 500 µm. (B) statistiske analyse for score af slidgigt i normal leddene og KOA led (n = 3). Dataene, der er udtrykt som mean±SEM. * angiver p < 0,05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: morfologi af gjorde-mærket haMSCs. Lysfelt, fluorescerende og flettede billeder af haMSCs på 1 time efter mærkning er vist i det øverste panel. Lysfelt, fluorescentand flettet billeder af haMSCs at24 h efter mærkning er vist i det nederste panel. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: In vivo billeddannelse af gjorde-mærket haMSCs. Efter injektion af 2,5 x 106 gjorde-mærket haMSCs, er repræsentative billeder af KOA rotter vist. Har mærket haMSCs blev opdaget i op til 9 uger lokalt i leddene i KOA rotter. Dette tal er blevet gengivet fra offentliggørelsen af Li M mfl8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sikkerhedsstandarder og biodistributionen undersøgelser af stamcelleterapi er tvingende nødvendigt før vi kan bringe regenerativ stamcelle behandling for KOA fra bænken til sengen. Men den patologiske miljø af sygdom spiller en vigtig rolle i persistens og biodistributionen transplanterede haMSCs10. For nylig, viste vores gruppe, at intra-artikulær injektion af haMSCs varet længere i en patologisk KOA miljø end gjorde injektioner under normale forhold8. Det er muligt, at den inflammatoriske og degenerative mikromiljø kan rekruttere mesenkymale stamceller til reparation og efterfølgende favor opbevaring af injicerede haMSCs1,21. Desuden, sikkerheds- og virkningskriterier profiler af haMSCs kan være påvirket af timingen af celle levering med hensyn til sværhedsgraden af KOA, således at optimering af progressionen af KOA i forsøgsdyr vil give værdifulde data til støtte for kliniske forsøg. Med det formål at ligner mild til moderat sværhedsgrad af menneskelige KOA, er rotter induceret af MM tilladt at udvikle KOA spænder fra 3 til 8 uger. I denne undersøgelse, blev de morfologiske forandringer af brusk vurderet ved histopatologisk scoring 8 uger efter operationen, der tilbyder en relativt realistisk model med en moderat grad af KOA at undersøge effektiviteten og sikkerheden af haMSCs8. Vi viste her en enkel og realistisk metode til label haMSCs med far-red fluorescerende lipofile membran farvestof for langsigtet prækliniske effekten evaluering.
Ulemperne ved denne teknik er det afbildede væv bør være i nærheden af huden og en betydelig mængde af mærket haMSCs kræves til tilstrækkeligt signal erhvervelse på grund af de beskedne quantum udbytter fra gjorde. Selv om en in vivo optiske billeddannelse-system gør det muligt ikke-invasiv longitudinelle studier af haMSCs biodistribution i KOA modeller, tendenser i cell antal og placering kan kun anes i almindelighed. Analyse af stamceller skæbne, i bestemt celleproliferation og differentiering, vil blive behandlet af også udnytte skæbne kortlægning og høj opløsning mikroskopi billeddannelse.
I øjeblikket, en bred vifte af mærkning teknikker er tilgængelige for i vivo stamcelle tracking, herunder radioaktive etiketter, nanopartikler og viral transduktion af reporter gener22,23,24. Dog kan radioaktive mærkning samt viral transduktion af stamceller interferere med de genetiske egenskaber af celler, som efterfølgende kan påvirke stem cell spredning og overlevelse i vivo16. Derudover sporing stamceller ved hjælp af MRI af optagelsen af nanopartikler som kontraktansat kræver forbedret rumlige opløsning via en stærk magnetfelt, som kan øge bekymring over følsomheden i denne teknik25. Fluorescerende celle farvestoffer, såsom PKH26, CM-DiI og CFSE udviser forskellige grader af cytotoksicitet og tilbyde en relativt begrænset varighed (op til 4 uger) mærkning fedtvæv afledt celler15. Derimod udstiller svag fluorescens i vandige opløsninger. Når indarbejdet med en lipid membranen, diffunderer ensartet inden for cellemembranen og udtrykke stabile far-red fluorescens19. Gjorde etiketter levedygtige celler og ikke påvirke deres spredning og fungere18. Endnu vigtigere, overfører farvestofferne ikke fra mærket celler til umærkede celler medmindre der er en direkte membran interaktion mellem disse celler26. Far-red excitation og emission spektre af forhindrer autofluorescent indblanding fra omgivende væv og giver dyb væv imaging med levende dyr. Disse funktioner aktiver gjorde mærkning som en ideel langsigtede tracking teknik til at studere skæbnen af implanteret haMSCs intra-articularly. Derfor, vi har vist en pålidelig metode til at overvåge gjorde mærket haMSCs over en periode på 63 dage i en rotte model8.
I protokollen for gjorde-mærket haMSCs tracking i en KOA rotte model, de kritiske faser at opnå pålidelige og mulige resultater er at sørge for, at: 1) menisken mod lårben er fuldstændig skære igennem i hver rotte model for konsekvent debut af KOA, 2) der er en optimeret forholdet mellem 10 μL farvestof mod 106 haMSC celler for en 50 min farvning, 3) påvisningsgrænse i vivo for gjorde-mærket haMSCs er mellem 104 og 105 celler, mens over 106 celler anbefales i denne protokol.
Når denne teknik er mestret, kan anvendelsen af denne metode bruges til at bestemme den optimale rute eller dosering for administration af MSCs i prækliniske studier. Denne protokol kan tilpasses nemt for langsigtet præklinisk evaluering af i vivo biodistribution af mesenchymale stamceller (msc) fra andre kilder, herunder knoglemarven og navlestrengen blod. I lyset af den potentielle stamceller skæbne i KOA dyremodeller, kan immunohistology undersøgelse af xenogene haMSCs, såsom Ki67 for spredning8 og kollagen II for ledbrusken differentiering27, kombineres med dette teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Meng Li, Ming Hao og Wen Wang er nuværende medarbejdere og aktieoptionsprogram indehavere af cellulære biomedicin gruppe (Nasdaq: CBMG). De andre forfattere erklære nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Den nuværende undersøgelse blev støttet af Shanghai Innovation finansiering (1402H 294300) sponsoreret af videnskab og teknologi Kommissionen for Shanghai kommune (KN) til Dr. Wen Wang. Vi vil gerne takke Dr. Guangdong Zhou (nationale Tissue Engineering Center i Kina) for sin tekniske bistand og videnskabelig rådgivning for dette håndskrift. Vi vil også gerne takke Mr. Huitang Xia (Shanghai niende People's Hospital) for hans hjælp i dyrevelfærd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrx VMR animal anesthesia system | Midmark | VIP3000 | |
| 4-0 suture | Shanghai Jinhuan | KC439 | |
| Razor | Pritech | LD-9987 | |
| Gentamicin | Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd. | None | |
| 0.9% Sodium chloride solution | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. | H43020455 | |
| Penicillin | Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Buprenorphine | Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Dilute to final concentration of 10% in PBS |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Dilute to final concentration of 20% in PBS |
| 0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s | Sigma-Aldrich | MHS16 | |
| 0.5% Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110116 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor | Thermo Fisher | A78400006 | |
| Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center | Thermo Fisher | B64100010 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| DiD | Molecular Probes, Life Technologies |
V-22887 | |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS | GIBCO, Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-114 | |
| 10 cm Petri Dish | Corning | V118877 | |
| Centrifuge | Beckman | Optima MAX-TL | |
| Fluorescent microscope | Olympus | BX53 | |
| 0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Titetamme | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Zolazepam | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Sterile hyposermic syringe for single use 26G | Shanghai Misawa Medical Industry | None | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| Living Imaging 4.0 software | PerkinElmer | None |
References
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis Rheum. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Lane, N. E., Shidara, K., Wise, B. L. Osteoarthritis year in review 2016: clinical. Osteoarthritis Cartilage. 25 (2), 209-215 (2017).
- Wang, W., Cao, W. Treatment of osteoarthritis with mesenchymal stem cells. Sci China Life Sci. 57 (6), 586-595 (2014).
- Burke, J., et al. Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clin Transl Med. 5 (1), 27 (2016).
- Bendele, A. M. Animal models of osteoarthritis. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1 (4), 363-376 (2001).
- Gerwin, N., Bendele, A. M., Glasson, S., Carlson, C. S. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the rat. Osteoarthritis Cartilage. 18, Suppl 3. S24-S34 (2010).
- Janusz, M. J., et al. Induction of osteoarthritis in the rat by surgical tear of the meniscus: Inhibition of joint damage by a matrix metalloproteinase inhibitor. Osteoarthritis Cartilage. 10 (10), 785-791 (2002).
- Li, M., et al. In vivo human adipose-derived mesenchymal stem cell tracking after intra-articular delivery in a rat osteoarthritis model. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 160 (2016).
- Zhou, B., et al. Administering human adipose-derived mesenchymal stem cells to prevent and treat experimental arthritis. Clin Immunol. 141 (3), 328-337 (2011).
- Desando, G., et al. Intra-articular delivery of adipose derived stromal cells attenuates osteoarthritis progression in an experimental rabbit model. Arthritis Res Ther. 15 (1), 22 (2013).
- Riester, S. M., et al. Safety Studies for Use of Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stromal/Stem Cells in a Rabbit Model for Osteoarthritis to Support a Phase I Clinical Trial. Stem Cells Transl Med. 6 (3), 910-922 (2017).
- Bai, X., et al. Tracking long-term survival of intramyocardially delivered human adipose tissue-derived stem cells using bioluminescence imaging. Mol Imaging Biol. 13 (4), 633-645 (2011).
- Wolbank, S., et al. Labelling of human adipose-derived stem cells for non-invasive in vivo cell tracking. Cell Tissue Bank. 8 (3), 163-177 (2007).
- Heymer, A., et al. Iron oxide labelling of human mesenchymal stem cells in collagen hydrogels for articular cartilage repair. Biomaterials. 29 (10), 1473-1483 (2008).
- Hemmrich, K., Meersch, M., von Heimburg, D., Pallua, N. Applicability of the dyes CFSE, CM-DiI and PKH26 for tracking of human preadipocytes to evaluate adipose tissue engineering. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 117-127 (2006).
- Shim, G., et al. Pharmacokinetics and in vivo fate of intra-articularly transplanted human bone marrow-derived clonal mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 24 (9), 1124-1132 (2015).
- Chen, B. K., et al. A safety study on intrathecal delivery of autologous mesenchymal stromal cells in rabbits directly supporting Phase I human trials. Transfusion. 55 (5), 1013-1020 (2015).
- Chan, M. M., Gray, B. D., Pak, K. Y., Fong, D. Non-invasive in vivo imaging of arthritis in a collagen-induced murine model with phosphatidylserine-binding near-infrared (NIR) dye. Arthritis Res Ther. 17, 50 (2015).
- Texier, I., et al. Cyanine-loaded lipid nanoparticles for improved in vivo fluorescence imaging. J Biomed Opt. 14 (5), 054005 (2009).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
- Rahmati, M., Mobasheri, A., Mozafari, M. Inflammatory mediators in osteoarthritis: A critical review of the state-of-the-art, current prospects, and future challenges. Bone. 85, 81-90 (2016).
- Detante, O., et al. Intravenous administration of 99mTc-HMPAO-labeled human mesenchymal stem cells after stroke: in vivo imaging and biodistribution. Cell Transplant. 18 (12), 1369-1379 (2009).
- Hu, S. L., et al. In vivo magnetic resonance imaging tracking of SPIO-labeled human umbilical cord mesenchymal stem cells. J Cell Biochem. 113 (3), 1005-1012 (2012).
- Xia, Q., et al. Intra-articular transplantation of atsttrin-transduced mesenchymal stem cells ameliorate osteoarthritis development. Stem Cells Transl Med. 4 (5), 523-531 (2015).
- Jasmin,, et al. Optimized labeling of bone marrow mesenchymal cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles and in vivo visualization by magnetic resonance imaging. J Nanobiotechnology. 9, 4 (2011).
- Lehmann, T. P., et al. Coculture of human nucleus pulposus cells with multipotent mesenchymal stromal cells from human bone marrow reveals formation of tunnelling nanotubes. Mol Med Rep. 9 (2), 574-582 (2014).
- Wang, W., et al. Human adipose-derived mesenchymal progenitor cells engraft into rabbit articular cartilage. Int J Mol Sci. 16 (6), 12076-12091 (2015).
