Summary
Bu iletişim kuralı tarafından far-red floresan intra artiküler (IA) enjeksiyon yoluyla bir sıçan diz osteoartrit (KOA) modelinde etiketleme hücre sebat ve biodistribution insan yağ elde edilen Mezenkimal kök hücrelerin (haMSCs) izlemek için etkili bir yöntem açıklanır.
Abstract
İnsan yağ elde edilen Mezenkimal Kök hücre (haMSC) tedavisinin klinik uygulama diz osteoartrit (KOA) desteklemek için hücre sebat etkinliği ve haMSCs hayvan modellerinde biodistribution inceledi. Lipofilik floresan boya ile haMSCs hücre membran etiketlemek için bir yöntem gösterdi. Daha sonra intra artiküler enjeksiyon cerrahi müdahale ile indüklenen KOA fareler etiketli hücre dinamik olarak görüntüleme sistemi bir vivo içinde tarafından izlenen. Lipofilik istihdam carbocyanines yaptım (DilC18 (5)), hangi üzerinden dokuları çevreleyen doğal yeşil autofluorescence uyarma önlemek için kırmızı bir lazer kullanmak bir far-red floresan Dil (dialkylcarbocyanines) analog,. Ayrıca, kırmızı kaymıştır emisyon spectra ile izin derin doku görüntüleme içinde canlı hayvan ve etiketleme işlemi sitotoksik efekt veya haMSCs fonksiyonel hasar yok neden. Bu yaklaşım bir verimli izleme yöntemini haMSCs bir sıçan KOA modeli için olmak gösterilmiştir. Bu yöntemin uygulama da en uygun yönetim rota ve MSCs önceden klinik çalışmalarda diğer kaynaklardan doz belirlemek için kullanılabilir.
Introduction
Diz Osteoartriti (KOA) eklem kıkırdak kaybı ve dünya1çevresinde Yaşlılarda büyük kronik bir hastalık haline gelmiştir ilerici iltihap kaynaklanan bir dejeneratif hastalığıdır. Ancak, geçerli terapiler anti-inflamatuar ilaçlar, fiziksel takviyeleri ve cerrahi işlemler kullanarak yalnızca semptomatik ağrı2için geçici bir rahatlama sağlayabilir.
İnsan yağ elde edilen Mezenkimal Kök hücre (haMSCs) onların multipotent farklılaşma kıkırdak rejenerasyon ve immunomodulatory özellikleri3için potansiyel sayesinde diz osteoartrit için umut verici bir rejeneratif ilaç haline gelmiştir, 4. Eylem içinde vivomekanizmaları araştırmak için farmakolojik yolları ile karşılaştırıldığında, küçük KOA hayvan modellerinde canlı haMSCs izleme için gerekçe ve fizibilite haMSC terapi klinik uygulamadan önce kurmak için şu anda öğreticidir. Preklinik test etmek için medial Menisektomi (MM) ile tutarlı tekrarlanabilirlik5nispeten uygun bir model sağlayan KOA de, fareler, ikna etmek için eklem mekanik yük oynattığını. MM tarafından indüklenen KOA başlangıcı ön çapraz bağ transeksiyon tek başına veya kombine ile kısmi medial Menisektomi6daha öncedir. Bu nedenle, enjekte haMSCs KOA patolojik microenvironment ile uzun vadeli Hofstede kez MM7,8tarafından indüklenen Sıçanlarda değerlendirilir.
HaMSCs tedavi edici etkinliği yaygın olarak bildirilen, ilgili bilgi üzerinde olmasına rağmen intra artiküler (IA) enjeksiyon yolu ile implante haMSCs in vivo sebat kıt9,10' dur. Bu nedenle, çeşitli hücresel etiketleme yöntemleri, immunohistology11, luciferase12, yeşil flüoresan protein13 transfection, demir oksit manyetik rezonans görüntüleme (MRG)14 etiketleme de dahil olmak üzere geliştirilmiştir. ve çok sayıda hücre floresan boyalar8,15,16. Emek yoğun Histoloji analizleri ile karşılaştırıldığında, vivo non-invaziv görüntüleme bulmak belgili tanımlık gerçek zamanlı dağıtım ve floresan sinyallerini10ile,17etiketli hücre dinamiği için Optik aygıtları kullanır. Fonksiyonel canlı hücre görüntüleme için cytocompatible floresan etiketlemeyi hücresel aktiviteler kök hücre nakli18sonra ortaya çıkarmak için bir gelişmiş izleme radyoaktif ücretsiz bir tekniktir. Ayrıca, çok renkli floresan lipofilik boyalar hidrofilik amino-reaktif boyalar veya floresan proteinler, onların gelişmiş hücre geçirgenliği ve gelişmiş Floresans kuantum sayıları19gibi avantajlara sahip.
Böylece, bir kırmızı burada dahil iletişim kurallarını kullanmak lazer ile lipofilik carbocyanines etiketli hücreleri heyecanlandırmak için mi (DilC18(5)), hangi bir far-red floresan Dil (dialkylcarbocyanines) analog20' dir. Bir kırmızı kaymıştır uyarma ve emisyon spectra autofluorescent girişim önler ve derin doku canlı hayvan8uzun bir süre görüntüleme sağlar. Bu yöntem izleme ile etiketli vivo içinde hücreleri mi anlamak ve geçerli kök hücre Yenileyici tedavisi geliştirmek için gerekli olduğu gibi haMSCs, hayvan modellerinde transplante kök hücre izlemek için geçerlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
hayvan konular içeren yordamlar onaylanan yerel kurumsal hayvan bakım ve Etik Komitesi, tarafından hayvan acı en aza indirmek için bir çaba ile. Aşağıdaki iletişim kuralı kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Shanghai dokuzuncu insanlar tarafından kabul edildi ’ hastane bağlı Shanghai JiaoTong Üniversitesi Tıp Fakültesi için iletişim kuralı ile s sayı [2017] 063.
1. Surgically-Induced fare diz osteoartrit manken kurulması
- için bu cerrahi işlem, kullanım 8-12 hafta yaşlı erkek Sprague Dawley (SD) rats vücut ağırlığı 250 ve 300 g arasında
- 40 mg/kg tiletamine ve kas içi enjeksiyon yolu ile 40 mg/kg zolazepam hayvanlarla anestezi.
- Hayvan sol yan pozisyonda bir ısıtmalı sahne alanı üzerine yerleştirin. Sağ diz iyice bir ustura ile tıraş. Cerrahi alan % 70 etanol tarafından takip % 10 providone-iyot solüsyonu ile dezenfekte, iki kez daha tekrarlayın ve sonra % 10 providone-iyot çözüm ile boyayın ve cerrahi bir yastık ile ameliyatsız alanı kapsayacak.
- Cerrahi bir neşter kullanmadan 2 cm kesi jointcapsules ortaya çıkarmak için yanal patellar tendon boyunca olun.
- Cerrahi neşter medial Kollateral bağ transect için kullanın. Menisküs femur doğru yansıtır.
- Steril % 0,9 Sodyum Klorür çözüm eklem kıkırdak yüzeyinde kıkırdak kurumasını önlemek için işlem sırasında damla.
- Medial Menisküs Forseps ile kapmak ve tibial ek bir neşter ( şekil 1A) ile dar noktasında Menisküs ile kesti. Kıkırdak yaralanmasına kaçının.
- 4-0 absorbe dikiş ile ek kapsül kapatın.
- Kendine gelmek kadar cerrahi fareler izlemek.
- 20 mg/kg gentamisin enfeksiyon ve ameliyat sonrası ağrı gidermek için kas içi bir rota üzerinden 0,05 mg/kg buprenorfin önlemek için enjekte.
- Fareler bir 12 h ışık/karanlık döngüsüne 3-8 hafta boyunca başlangıçlı KOA altında ısı kontrollü hayvan tesiste korumak. Hayvanlar devam ağrısı belirtileri devam ederse buprenorfin (0,05 mg/kg, sohbet) ve gentamisin (20 mg/kg, sohbet), bilhassa ağrı kesici almak.
2. Histoloji değerlendirme sıçan KOA Model
- kurban aşırı CO 2 inhalasyon (hayvan bilinçsizlik yapmak için Ekle Varolan yayına odasında karbon dioksit ile dakikada odası hacmi yaklaşık % 30 bir dolgu oranı ile rats içinde 2-3 dk. korumak CO2 akışı için en az 1 dk sonra solunum durur.) zaman puan (temsilcisi-den sonuçlanmak göstermek--dan 3-8 hafta arasında değişen KOA indüksiyon 8 hafta) sonra ameliyat. belirtilen
- deri ve kas diz eklemleri etrafında incelemek ve bir neşter ile diz eklemleri kesti.
- 3 gün oda sıcaklığında %4 paraformaldehyde (PFA) diz eklem tamir. Daha sonra yaklaşık 4 hafta 4 ° C'de % 20 ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) örneklerinde decalcify ve 3 günde EDTA değiştirin.
Dikkat: Paraformaldehyde zehirlidir, uygun kişisel koruyucu donanımları (PPE), eldiven ve gözlük gibi. - Bir otomatik doku işlemci kullanarak örnekleri kurutmak. Set menü floş bir döngü aşağıdaki gibi başlatın: % 70 etanol için 1 h; o zaman % 80 etanol ve % 95 etanol 1 h için sırasıyla; %2 100 etanol devredir 1s ardından; daha sonra Ksilen 1 h için iki kez her zaman ve her zaman alkol 3 kez 58 ° C'de 1 h için.
Dikkat: Ksilen toksik, çok uygun KKE, eldiven ve gözlük gibi giymek.
Not: İsteğe bağlı olarak, Coplin kavanozlar için otomatik doku işlemci olarak aynı kurulum ile el ile su kaybı kullanın. - Olduğu gibi eklem yüzü medial yönünü yerleştirin ve merkezi gömülü dokusuyla parafin blok içine embed.
Not: İsterseniz, forseps parafin blok içine el ile örnekleri katıştır kullanın. - Döner microtome tarafından 30 µm aralıkları ile 2 seri bölümler için 5 µm sagittal bölümleri medial kenar boşluğundan eklem kesmeye başlayın.
- Bölümleri cam slaytlarda dağ ve Ksilen içindeki slaytları deparaffinize. 2 seri bölümler arasındaki bir slayt Hematoksilen ile leke & Eozin (H & E) Boyama: % 0,1 Hematoksilen 15 dakika, % 1 Asetik asit çözüm için 10 s ve % 0,5 Eozin 10 dk için. Ve Safranin O/hızlı yeşil boyama ile diğer slayt leke: % 0,1 Hematoksilen 15 dk, %0.02 için hızlı yeşil 3 dk, % 1 Asetik asit çözüm 10 s ve %0,1 Safranin O 3 dakika süreyle
Dikkat: Ksilen toksik, eldiven, gözlük gibi uygun KKE giymek. - Fareler 6 ' osteoartrit Araştırma Derneği International (OARSI) histopatoloji değerlendirme sistemi kullanarak lekeli slaytlar Puan edinildi.
3. Bir insan Mezenkimal Kök hücreleri floresan boya yaptım ile etiketleme
- hücre etiketleme çözüm % 100 etanol, 1 mM bir konsantrasyon hazırlamak yaptı. Hücre etiketleme çözüm ışıktan korumak ve 6 ay için oda sıcaklığında saklayın.
- HaMSCs Dulbecco Standart hücre kültür yordamlarda ile büyümek ' s modifiye kartal ' % 1 penisilin ve streptomisin ve %10 10 cm petri kabına içinde fetal buzağı serum (FCS) ile takıma s orta (DMEM).
- HaMSCs 2 mL % 0.25 tripsin ile 1 mM EDTA öncesinde yaklaşık %80 izdiham ile ayırmak.
- Tripsin 4 mL kültür orta ile etkisiz hale getirmek ve hücreleri 3 dakika oda sıcaklığında 800 x g de spin.
- Hücreleri 1 x 10 6 hücre/mL 5 mL serum serbest kültür Orta yoğunluk itibariyle askıya alma.
- Hücreleri 50 ekleyerek etiket µL yaptım 5 mL serum serbest kültür orta 50 dk. 37 ° C'de çözümde hücre etiketleme
- 3 dakika süreyle 800 x g de etiketli hücreleri spin
- Hücreleri iki kez daha 5 mL fosfat tampon serum (PBS) vasıl 800 x g 3 dakika yıkayın.
- Cy5 filtre seti ile floresan mikroskop kullanarak etiketli haMSCs kontrol edin.
- Trypan mavi boyama ile hücreleri saymak ve hücrelerin içinde 100 µL PBS enjeksiyon için 10 6 x 2,5 elde.
4. Vivo Floresan parça haMSCs için Imaging
- sekiz hafta sonra ameliyat (Adım 1), anestezi KOA fareler tarafından kas içi enjeksiyon-25 mg/kg tiletamine ve 25 mg/kg zolazepam.
- Sağ diz iyice ortak alan ortaya çıkarmak için bir ustura ile tıraş. % 70 etanol ile ortak alanı dezenfekte.
- 26 G şırınga iğne kullanarak enjekte 2.5 x 10 100 µL PBS üçgen alanının merkezinde askıya hücreleri etiketli 6 oluşan medial patellar bağ, medial femoral düzgün ve medial tibial düzgün (kenarında şekil 1B).
- Görüntüleme yazılımını açın ve görüntüleme sistemi içinde vivo bioluminescence başlatılamıyor.
- Pozisyon Rat sırtüstü pozisyon görüntüleme sistemi Merkezi aşamasında ve odasının kapısını kapatın.
- Kontrol " floresan " onay kutusunu ve Seç floresan filtre ayarlar 640 nm için uyarma ve 680 nm için emisyon ( şekil 2A).
- Select alan ö ayarla piksel binning orta (8), görüş, durdurmak F/2 ve pozlama zaman otomatik olarak. Optimum korumak Pozlama süresi tüm çalışma ( şekil 2A) arasında karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için tutarlı.
- Anestezi kurtarma için monitör ve aşamada hayvan kaldırmak.
Not: Yer hayvan bir Isıtma yastığı üzerinde 2-3 sarılma katmanlarla kaplı. - Floresan ( şekil 2B) ölçümü için radyant verimliliğini birimleri seçin. Faiz (ROI) analiz için bölgeleri seçin ve her resim ( şekil 2C) floresan sinyallerini ölçmek.
- İn vivo içinde düşsel sırayla haMSCs boyuna saklama eklemde çalışmaya her fare için yordamı yineleyin.
Not: Biz hayvanlar görüntüleme öneririz ' floresan sinyalleri tarafından içinde vivo görüntüleme sistemi her iki günde enjeksiyon sonra ilk hafta ve bir kez her hafta kadar sinyali tespit edilemez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
KOA modeli ikna etmek için MM SD fareler (şekil 3) sağ diz eklemi gerçekleştirildi. Sekiz hafta sonra ameliyat fareler kurban ve diz eklemleri seri bölümlerini her iki H ile değerlendirildi & E ve Safranin O/hızlı yeşil boyama (şekil 4). H için & E boyama, eklem kıkırdak yüzeyinde daha ameliyat olmadan normal eklem cerrahisi diz kaba sınırları sergiledi. Safranin-O/hızlı yeşil, boyama için gözlenen azalma proteoglikan (kırmızı boyama) ve dejeneratif KOA fenotipleri ilerlemesini belirtilen normal olanla karşılaştırıldığında (yeşil boyama) kaplama kollajen eklem cerrahisinde arttı cerrahi ile indüklenen. İnsan KOA ilerlemesini benzemeye, fareler, 3 hafta, 6 hafta ve 8 hafta sonra MM Patogenez değerlendirmek ve tedavi müdahaleler zamanını belirlemek için kurban edildi.
Etiketli haMSCs görüntüleme sistemi bir optik vivo içinde tarafından KOA sıçan modelinde görselleştirildiği. etiketleme sonra 1s şekiller vitrosergilenen haMSCs etiketli. Etiketleme verimliliği yaklaşık % 95 ulaştı. Sonra 24 s, kültürlü mi etiketli haMSCs sergilenen uzun iğ şekilleri, değil mi gösteren haMSCs vitro (şekil 5) yapışma yeteneği değiştirmek değil. Sekiz hafta sonra ameliyat, 2. 5 x 106 mi etiketli haMSCs KOA ile eklem içine enjekte edildi. Buraya, etiketli haMSCs gözlendi günden 0 (ameliyattan sonra 8 hafta) yerel hapiste gün 70 mesaj enjeksiyon (ameliyattan sonra 18 hafta) kadar bir vivo içinde görüntüleme sistemi (şekil 6) kullanarak.
Şekil 1: şematik cerrahi alan hücre teslim MM cerrahi ve enjeksiyon alanı için. (A) , mavi renkle vurgulanır cerrahi alan bu şematik çizimde gösterilmektedir. (B) bu şematik diyagramı kırmızı daire içinde alanı içinde enjeksiyon yeri gösterir. Kısaltma tanımları şöyledir: MM, medial Menisküs; MCL, medial Kollateral bağ; LM, lateral Menisküs; LCL, lateral Kollateral bağ; PL, Patella bağ. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: ekran çekim içinde vivo görüntüleme yazılım. (A) floresan resim alma için parametre anahtar ayarlarını kırmızı kareler ile vurgulanır. (B) radyant verimliliğini Floresans ölçme birimi olarak seçilir. (C) içinde araç paleti, faiz (ROI) bölgelerinde Floresans verimlilik ölçümleri için çember. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: cerrahi müdahale ile indüklenen KOA prosedürleri. Diz eklem alanı (A) maruz kalma. (B) diz eklem medial Menisküs gösteren siyah bir ok ile iç yapısı. (C) disseke medial Menisküs. (D) ortak alan ve cilt kapalı.
Şekil 4: diz eklemleri ve istatistiksel analiz KOA OARSI puan için temsilcisi histolojik resimlerini. (A) sekiz hafta Sıçanlarda MM ameliyat sonrası, diz eklemleri seri bölümlerini H ile değerlendirilmiştir & E ve Safranin O/hızlı yeşil boyama. H & E boyama gösterdi ameliyatı diz kıkırdak kalınlığı düşürüldü. Safranin O/hızlı yeşil gösterdi boyama (kırmızı boyama) proteoglikan azalmış ve kaplama kollajen (yeşil boyama) normal diz ile karşılaştırıldığında cerrahi dizine de arttı. Ölçek çubuğu 500 µm. (B) istatistiksel analiz için normal eklem ve KOA eklem osteoartriti puan = (n = 3). Verileri mean±SEM. ifade edilir * p belirtir < 0,05. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Morfoloji mi etiketli haMSCs. Parlak alan, haMSCs etiketleme sonra 1 h, floresan ve birleştirilen görüntülerin üst paneldeki gösterilir. Etiketleme gösterilir sonra alt panelinde parlak alan, fluorescentand haMSCs at24 s görüntülerini birleştirilir. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: In vivo görüntüleme mi etiketli haMSCs. Sonra enjeksiyon 2, 5 x 106 mi etiketli haMSCs KOA sıçan temsilcisi görüntüleri gösterilir. Mi etiketli haMSCs algılandı 9 haftaya kadar yerel olarak KOA fareler eklemlerde. Bu rakam Li M ve ark8yayından yeniden oluşturulmuştur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Başucu için tezgah KOA rejeneratif kök hücre tedavisinde getirebiliriz önce güvenlik standartları ve kök hücre tedavisi biodistribution çalışmaları acilen ihtiyaç vardır. Ancak, hastalığın patolojik ortam sebat ve Transplante haMSCs10biodistribution önemli bir rol oynar. Son zamanlarda, bizim grup enjeksiyonları8normal şartlar altında daha haMSCs intra artiküler enjeksiyon artık patolojik bir KOA ortamında kalıcı gösterdi. Enflamatuar ve dejeneratif microenvironment Mezenkimal Kök hücre tamir için recruit ve daha sonra eklenen haMSCs1,21tutma lehine mümkündür. Ayrıca, böylece optimizasyonu KOA ilerleme laboratuvar hayvanlarda klinik desteklemek için değerli verilerinizi sağlayacaktır haMSCs etkinliği ve güvenliği profilleri KOA, şiddeti ile ilgili hücre teslim zamanlaması tarafından etkilenebilir. Benzeyen amacı ile insan KOA orta önem için hafif, MM tarafından indüklenen fareler--dan 3-8 hafta arasında değişen KOA geliştirmek için izin verilir. Bu çalışmada, kıkırdak morfolojik değişiklik ile KOA etkinliğini araştırmak için ılımlı bir ölçüde ve güven haMSCs8nispeten uygun bir model sunuyor ameliyat sonrası histopatolojik puanlama 8 hafta tarafından değerlendirildi. Biz burada bir etiket haMSCs far-red floresan lipofilik membran boya ile basit ve uygun yönteme uzun vadeli önceden klinik etkinliğinin değerlendirilmesi için gösterdi.
Görüntülü doku deri olmalıdır ve etiketli haMSCs önemli bir miktar mütevazı kuantum sayıları nedeniyle yeterli sinyal Alım için gereklidir bu teknik dezavantajları vardır yaptı. Non-invaziv uzunlamasına çalışmalar bir vivo içinde optik görüntüleme sistemi sağlar, ancak haMSCs biodistribution içinde KOA modelleri, cep numarası eğilimler ve konum sadece genel olarak ayırt edilebilir. Kök hücre kadere, belirli hücre çoğalması ve farklılaşma, analizini de kader haritalama ve yüksek çözünürlüklü mikroskobu görüntüleme kullanarak ele alınacaktır.
Şu anda, etiketleme teknikleri çok çeşitli radyoaktif Etiketler, nano tanecikleri ve reporter genler22,23,24viral iletim de dahil olmak üzere vivo içinde kök hücre izleme için kullanılabilir. Ancak, radyoaktif kök hücreler viral iletim yanı sıra etiketleme daha sonra kök hücre çoğalması ve hayatta kalma vivo içinde16etkileyebilir hücrelerin genetik özellikleri ile girişime neden olabilir. Ayrıca, kök hücre olarak Kontrat ajanı güçlü bir manyetik alan ile geliştirilmiş Uzaysal çözünürlük gerektirir MRI nano tanecikleri alımını tarafından kullanarak izleme, hangi bu tekniği25duyarlılığını kaygıları artırabilir. Floresan hücre boya, öyle aynı derecede PKH26, CM-dıı ve CFSE sitotoksisite değişen derecelerde sergi ve yağ dokusu etiketleme ve göreceli olarak sınırlı bir süre (4 hafta) hücreleri15türetilmiş sunuyoruz. Buna ek olarak, sulu çözümler içinde zayıf Floresans sergiler. Bir kez bir lipid membran ile dahil, dağılır düzgün hücre zarı ve ifade istikrarlı far-red Floresan19içinde. Etiketleri hücrelerin yaptım ve değil onların yayılması etkileyen ve18işlev. Daha da önemlisi, boyalar olmadığı sürece bu hücreleri26arasında bir doğrudan membran etkileşim etiketlenmemiş hücrelere etiketli hücreleri aktarılmaz. Far-red uyarma ve emisyon spectra ile çevre dokular müdahalelerden autofluorescent önler ve canlı hayvan derin doku görüntüleme sağlar. Bu özellikleri etkinleştir implante haMSCs kaderi intra articularly eğitim için bir ideal uzun vadeli izleme tekniği etiketleme yaptı. Bu nedenle, biz güvenilir bir göstermiştir metodoloji izlemek için bir fare modeli863 gün belirli bir süre etiketli haMSCs yaptım.
İçin mi etiketli haMSCs iz KOA sıçan modelinde protokolde, emin olmak için güvenilir ve uygun sonuçlar elde etmek için kritik adımlar şunlardır: 1) doğru femur Menisküs tamamen aracılığıyla tutarlı KOA başlangıcı için her sıçan modelinde kesilir, 2) 10 μL en iyi duruma getirilmiş bir oranı 50 Boyama, 3 dk 106 haMSC hücrelere karşı boyadın) mi etiketli haMSCs için in vivo algılama eşiği 10 arasında olduğunu4 ve 105 hücreleri, 106 hücre tavsiye edilir iken Bu protokol için.
Bu teknik hakim sonra bu yöntemin uygulama en uygun rota veya doz MSCs yönetim önceden klinik çalışmalarda için belirlemek için kullanılabilir. Bu iletişim kuralı, in vivo biodistribution Mezenkimal Kök hücre (MSCs) kemik iliği ve göbek kordon kanı da dahil olmak üzere diğer kaynaklardan uzun vadeli önceden klinik değerlendirilmesi için kolayca uyarlanabilir. Potansiyel ışığında kök hücre kaderi için içine KOA hayvan modelleri, nükleer silahların yayılmasına karşı8 ve kollajen II eklem kıkırdak farklılaşma27, Ki67 gibi xenogeneic haMSCs incelenmesi immunohistology bu ile kombine edilebilir tekniği.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Meng Li, Ming Hao ve Wen Wang geçerli çalışanları ve hücresel Biyomedikal grup hisse senedi opsiyonu sahipleri vardır (Nasdaq: CBMG). Diğer yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.
Acknowledgments
Çalışmada Shanghai yenilik (1402 H 294300) finansman bilim ve teknoloji Komisyonu, Shanghai Belediyesi (CN) Dr Wen Wang tarafından sponsor tarafından desteklenmiştir. Dr Guangdong Çu (Ulusal doku Mühendisliği merkezi Çin) onun teknik yardım ve bu el yazması için bilimsel tavsiyeler için teşekkür etmek istiyorum. Biz de Bay Huitang Xia (Shanghai dokuzuncu insanların hastane) teşekkür etmek için hayvan refah içinde onun yardım etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrx VMR animal anesthesia system | Midmark | VIP3000 | |
| 4-0 suture | Shanghai Jinhuan | KC439 | |
| Razor | Pritech | LD-9987 | |
| Gentamicin | Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd. | None | |
| 0.9% Sodium chloride solution | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. | H43020455 | |
| Penicillin | Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Buprenorphine | Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Dilute to final concentration of 10% in PBS |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Dilute to final concentration of 20% in PBS |
| 0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s | Sigma-Aldrich | MHS16 | |
| 0.5% Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110116 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor | Thermo Fisher | A78400006 | |
| Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center | Thermo Fisher | B64100010 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| DiD | Molecular Probes, Life Technologies |
V-22887 | |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS | GIBCO, Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-114 | |
| 10 cm Petri Dish | Corning | V118877 | |
| Centrifuge | Beckman | Optima MAX-TL | |
| Fluorescent microscope | Olympus | BX53 | |
| 0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Titetamme | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Zolazepam | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Sterile hyposermic syringe for single use 26G | Shanghai Misawa Medical Industry | None | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| Living Imaging 4.0 software | PerkinElmer | None |
References
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis Rheum. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Lane, N. E., Shidara, K., Wise, B. L. Osteoarthritis year in review 2016: clinical. Osteoarthritis Cartilage. 25 (2), 209-215 (2017).
- Wang, W., Cao, W. Treatment of osteoarthritis with mesenchymal stem cells. Sci China Life Sci. 57 (6), 586-595 (2014).
- Burke, J., et al. Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clin Transl Med. 5 (1), 27 (2016).
- Bendele, A. M. Animal models of osteoarthritis. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1 (4), 363-376 (2001).
- Gerwin, N., Bendele, A. M., Glasson, S., Carlson, C. S. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the rat. Osteoarthritis Cartilage. 18, Suppl 3. S24-S34 (2010).
- Janusz, M. J., et al. Induction of osteoarthritis in the rat by surgical tear of the meniscus: Inhibition of joint damage by a matrix metalloproteinase inhibitor. Osteoarthritis Cartilage. 10 (10), 785-791 (2002).
- Li, M., et al. In vivo human adipose-derived mesenchymal stem cell tracking after intra-articular delivery in a rat osteoarthritis model. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 160 (2016).
- Zhou, B., et al. Administering human adipose-derived mesenchymal stem cells to prevent and treat experimental arthritis. Clin Immunol. 141 (3), 328-337 (2011).
- Desando, G., et al. Intra-articular delivery of adipose derived stromal cells attenuates osteoarthritis progression in an experimental rabbit model. Arthritis Res Ther. 15 (1), 22 (2013).
- Riester, S. M., et al. Safety Studies for Use of Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stromal/Stem Cells in a Rabbit Model for Osteoarthritis to Support a Phase I Clinical Trial. Stem Cells Transl Med. 6 (3), 910-922 (2017).
- Bai, X., et al. Tracking long-term survival of intramyocardially delivered human adipose tissue-derived stem cells using bioluminescence imaging. Mol Imaging Biol. 13 (4), 633-645 (2011).
- Wolbank, S., et al. Labelling of human adipose-derived stem cells for non-invasive in vivo cell tracking. Cell Tissue Bank. 8 (3), 163-177 (2007).
- Heymer, A., et al. Iron oxide labelling of human mesenchymal stem cells in collagen hydrogels for articular cartilage repair. Biomaterials. 29 (10), 1473-1483 (2008).
- Hemmrich, K., Meersch, M., von Heimburg, D., Pallua, N. Applicability of the dyes CFSE, CM-DiI and PKH26 for tracking of human preadipocytes to evaluate adipose tissue engineering. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 117-127 (2006).
- Shim, G., et al. Pharmacokinetics and in vivo fate of intra-articularly transplanted human bone marrow-derived clonal mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 24 (9), 1124-1132 (2015).
- Chen, B. K., et al. A safety study on intrathecal delivery of autologous mesenchymal stromal cells in rabbits directly supporting Phase I human trials. Transfusion. 55 (5), 1013-1020 (2015).
- Chan, M. M., Gray, B. D., Pak, K. Y., Fong, D. Non-invasive in vivo imaging of arthritis in a collagen-induced murine model with phosphatidylserine-binding near-infrared (NIR) dye. Arthritis Res Ther. 17, 50 (2015).
- Texier, I., et al. Cyanine-loaded lipid nanoparticles for improved in vivo fluorescence imaging. J Biomed Opt. 14 (5), 054005 (2009).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
- Rahmati, M., Mobasheri, A., Mozafari, M. Inflammatory mediators in osteoarthritis: A critical review of the state-of-the-art, current prospects, and future challenges. Bone. 85, 81-90 (2016).
- Detante, O., et al. Intravenous administration of 99mTc-HMPAO-labeled human mesenchymal stem cells after stroke: in vivo imaging and biodistribution. Cell Transplant. 18 (12), 1369-1379 (2009).
- Hu, S. L., et al. In vivo magnetic resonance imaging tracking of SPIO-labeled human umbilical cord mesenchymal stem cells. J Cell Biochem. 113 (3), 1005-1012 (2012).
- Xia, Q., et al. Intra-articular transplantation of atsttrin-transduced mesenchymal stem cells ameliorate osteoarthritis development. Stem Cells Transl Med. 4 (5), 523-531 (2015).
- Jasmin,, et al. Optimized labeling of bone marrow mesenchymal cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles and in vivo visualization by magnetic resonance imaging. J Nanobiotechnology. 9, 4 (2011).
- Lehmann, T. P., et al. Coculture of human nucleus pulposus cells with multipotent mesenchymal stromal cells from human bone marrow reveals formation of tunnelling nanotubes. Mol Med Rep. 9 (2), 574-582 (2014).
- Wang, W., et al. Human adipose-derived mesenchymal progenitor cells engraft into rabbit articular cartilage. Int J Mol Sci. 16 (6), 12076-12091 (2015).
