Summary

Vivo İnsan yağ elde edilen Mezenkimal kök hücrelerin sıçan diz osteoartrit modelinde floresan lipofilik membran boya ile izleme

Published: October 08, 2017
doi:

Summary

Bu iletişim kuralı tarafından far-red floresan intra artiküler (IA) enjeksiyon yoluyla bir sıçan diz osteoartrit (KOA) modelinde etiketleme hücre sebat ve biodistribution insan yağ elde edilen Mezenkimal kök hücrelerin (haMSCs) izlemek için etkili bir yöntem açıklanır.

Abstract

İnsan yağ elde edilen Mezenkimal Kök hücre (haMSC) tedavisinin klinik uygulama diz osteoartrit (KOA) desteklemek için hücre sebat etkinliği ve haMSCs hayvan modellerinde biodistribution inceledi. Lipofilik floresan boya ile haMSCs hücre membran etiketlemek için bir yöntem gösterdi. Daha sonra intra artiküler enjeksiyon cerrahi müdahale ile indüklenen KOA fareler etiketli hücre dinamik olarak görüntüleme sistemi bir vivo içinde tarafından izlenen. Lipofilik istihdam carbocyanines yaptım (DilC18 (5)), hangi üzerinden dokuları çevreleyen doğal yeşil autofluorescence uyarma önlemek için kırmızı bir lazer kullanmak bir far-red floresan Dil (dialkylcarbocyanines) analog,. Ayrıca, kırmızı kaymıştır emisyon spectra ile izin derin doku görüntüleme içinde canlı hayvan ve etiketleme işlemi sitotoksik efekt veya haMSCs fonksiyonel hasar yok neden. Bu yaklaşım bir verimli izleme yöntemini haMSCs bir sıçan KOA modeli için olmak gösterilmiştir. Bu yöntemin uygulama da en uygun yönetim rota ve MSCs önceden klinik çalışmalarda diğer kaynaklardan doz belirlemek için kullanılabilir.

Introduction

Diz Osteoartriti (KOA) eklem kıkırdak kaybı ve dünya1çevresinde Yaşlılarda büyük kronik bir hastalık haline gelmiştir ilerici iltihap kaynaklanan bir dejeneratif hastalığıdır. Ancak, geçerli terapiler anti-inflamatuar ilaçlar, fiziksel takviyeleri ve cerrahi işlemler kullanarak yalnızca semptomatik ağrı2için geçici bir rahatlama sağlayabilir.

İnsan yağ elde edilen Mezenkimal Kök hücre (haMSCs) onların multipotent farklılaşma kıkırdak rejenerasyon ve immunomodulatory özellikleri3için potansiyel sayesinde diz osteoartrit için umut verici bir rejeneratif ilaç haline gelmiştir, 4. Eylem içinde vivomekanizmaları araştırmak için farmakolojik yolları ile karşılaştırıldığında, küçük KOA hayvan modellerinde canlı haMSCs izleme için gerekçe ve fizibilite haMSC terapi klinik uygulamadan önce kurmak için şu anda öğreticidir. Preklinik test etmek için medial Menisektomi (MM) ile tutarlı tekrarlanabilirlik5nispeten uygun bir model sağlayan KOA de, fareler, ikna etmek için eklem mekanik yük oynattığını. MM tarafından indüklenen KOA başlangıcı ön çapraz bağ transeksiyon tek başına veya kombine ile kısmi medial Menisektomi6daha öncedir. Bu nedenle, enjekte haMSCs KOA patolojik microenvironment ile uzun vadeli Hofstede kez MM7,8tarafından indüklenen Sıçanlarda değerlendirilir.

HaMSCs tedavi edici etkinliği yaygın olarak bildirilen, ilgili bilgi üzerinde olmasına rağmen intra artiküler (IA) enjeksiyon yolu ile implante haMSCs in vivo sebat kıt9,10‘ dur. Bu nedenle, çeşitli hücresel etiketleme yöntemleri, immunohistology11, luciferase12, yeşil flüoresan protein13 transfection, demir oksit manyetik rezonans görüntüleme (MRG)14 etiketleme de dahil olmak üzere geliştirilmiştir. ve çok sayıda hücre floresan boyalar8,15,16. Emek yoğun Histoloji analizleri ile karşılaştırıldığında, vivo non-invaziv görüntüleme bulmak belgili tanımlık gerçek zamanlı dağıtım ve floresan sinyallerini10ile,17etiketli hücre dinamiği için Optik aygıtları kullanır. Fonksiyonel canlı hücre görüntüleme için cytocompatible floresan etiketlemeyi hücresel aktiviteler kök hücre nakli18sonra ortaya çıkarmak için bir gelişmiş izleme radyoaktif ücretsiz bir tekniktir. Ayrıca, çok renkli floresan lipofilik boyalar hidrofilik amino-reaktif boyalar veya floresan proteinler, onların gelişmiş hücre geçirgenliği ve gelişmiş Floresans kuantum sayıları19gibi avantajlara sahip.

Böylece, bir kırmızı burada dahil iletişim kurallarını kullanmak lazer ile lipofilik carbocyanines etiketli hücreleri heyecanlandırmak için mi (DilC18(5)), hangi bir far-red floresan Dil (dialkylcarbocyanines) analog20‘ dir. Bir kırmızı kaymıştır uyarma ve emisyon spectra autofluorescent girişim önler ve derin doku canlı hayvan8uzun bir süre görüntüleme sağlar. Bu yöntem izleme ile etiketli vivo içinde hücreleri mi anlamak ve geçerli kök hücre Yenileyici tedavisi geliştirmek için gerekli olduğu gibi haMSCs, hayvan modellerinde transplante kök hücre izlemek için geçerlidir.

Protocol

hayvan konular içeren yordamlar onaylanan yerel kurumsal hayvan bakım ve Etik Komitesi, tarafından hayvan acı en aza indirmek için bir çaba ile. Aşağıdaki iletişim kuralı kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Shanghai dokuzuncu insanlar tarafından kabul edildi ’ hastane bağlı Shanghai JiaoTong Üniversitesi Tıp Fakültesi için iletişim kuralı ile s sayı [2017] 063. 1. Surgically-Induced fare diz osteoartrit manken kurulması için bu cerrahi …

Representative Results

KOA modeli ikna etmek için MM SD fareler (şekil 3) sağ diz eklemi gerçekleştirildi. Sekiz hafta sonra ameliyat fareler kurban ve diz eklemleri seri bölümlerini her iki H ile değerlendirildi & E ve Safranin O/hızlı yeşil boyama (şekil 4). H için & E boyama, eklem kıkırdak yüzeyinde daha ameliyat olmadan normal eklem cerrahisi diz kaba sınırları sergiledi. Safranin-O/hızlı yeşil, boyama için gözlenen…

Discussion

Başucu için tezgah KOA rejeneratif kök hücre tedavisinde getirebiliriz önce güvenlik standartları ve kök hücre tedavisi biodistribution çalışmaları acilen ihtiyaç vardır. Ancak, hastalığın patolojik ortam sebat ve Transplante haMSCs10biodistribution önemli bir rol oynar. Son zamanlarda, bizim grup enjeksiyonları8normal şartlar altında daha haMSCs intra artiküler enjeksiyon artık patolojik bir KOA ortamında kalıcı gösterdi. Enflamatuar ve dejenera…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Çalışmada Shanghai yenilik (1402 H 294300) finansman bilim ve teknoloji Komisyonu, Shanghai Belediyesi (CN) Dr Wen Wang tarafından sponsor tarafından desteklenmiştir. Dr Guangdong Çu (Ulusal doku Mühendisliği merkezi Çin) onun teknik yardım ve bu el yazması için bilimsel tavsiyeler için teşekkür etmek istiyorum. Biz de Bay Huitang Xia (Shanghai dokuzuncu insanların hastane) teşekkür etmek için hayvan refah içinde onun yardım etmek istiyorum.

Materials

Matrx VMR animal anesthesia system Midmark VIP3000
4-0 suture Shanghai Jinhuan KC439
Razor Pritech LD-9987
Gentamicin Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd. None
0.9% Sodium chloride solution Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. H43020455
Penicillin Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd. None
Buprenorphine Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd. None
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 16005 Dilute to final concentration of 10% in PBS
EDTA Sigma-Aldrich E9884 Dilute to final concentration of 20% in PBS
0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s Sigma-Aldrich MHS16
0.5% Eosin Y solution, alcoholic Sigma-Aldrich HT110116
Safranin O Sigma-Aldrich S8884
Fast Green Sigma-Aldrich F7258
Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor Thermo Fisher A78400006
Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center Thermo Fisher B64100010
Fully Automated Rotary Microtome Leica RM2255
DiD Molecular Probes, Life
Technologies
V-22887
D-MEM High Glucose Sigma-Aldrich D5648
PBS GIBCO, Life Technologies 14190-144
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200-114
10 cm Petri Dish Corning V118877
Centrifuge Beckman Optima MAX-TL
Fluorescent microscope Olympus BX53
0.4% Trypan Blue solution Sigma-Aldrich 93595
Titetamme Virbac (Zoletil 50) 1000000188
Zolazepam Virbac (Zoletil 50) 1000000188
Sterile hyposermic syringe for single use 26G Shanghai Misawa Medical Industry None
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System PerkinElmer 124262
Living Imaging 4.0 software PerkinElmer None

References

  1. Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis Rheum. 64 (6), 1697-1707 (2012).
  2. Lane, N. E., Shidara, K., Wise, B. L. Osteoarthritis year in review 2016: clinical. Osteoarthritis Cartilage. 25 (2), 209-215 (2017).
  3. Wang, W., Cao, W. Treatment of osteoarthritis with mesenchymal stem cells. Sci China Life Sci. 57 (6), 586-595 (2014).
  4. Burke, J., et al. Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clin Transl Med. 5 (1), 27 (2016).
  5. Bendele, A. M. Animal models of osteoarthritis. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1 (4), 363-376 (2001).
  6. Gerwin, N., Bendele, A. M., Glasson, S., Carlson, C. S. The OARSI histopathology initiative – recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the rat. Osteoarthritis Cartilage. 18, S24-S34 (2010).
  7. Janusz, M. J., et al. Induction of osteoarthritis in the rat by surgical tear of the meniscus: Inhibition of joint damage by a matrix metalloproteinase inhibitor. Osteoarthritis Cartilage. 10 (10), 785-791 (2002).
  8. Li, M., et al. In vivo human adipose-derived mesenchymal stem cell tracking after intra-articular delivery in a rat osteoarthritis model. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 160 (2016).
  9. Zhou, B., et al. Administering human adipose-derived mesenchymal stem cells to prevent and treat experimental arthritis. Clin Immunol. 141 (3), 328-337 (2011).
  10. Desando, G., et al. Intra-articular delivery of adipose derived stromal cells attenuates osteoarthritis progression in an experimental rabbit model. Arthritis Res Ther. 15 (1), 22 (2013).
  11. Riester, S. M., et al. Safety Studies for Use of Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stromal/Stem Cells in a Rabbit Model for Osteoarthritis to Support a Phase I Clinical Trial. Stem Cells Transl Med. 6 (3), 910-922 (2017).
  12. Bai, X., et al. Tracking long-term survival of intramyocardially delivered human adipose tissue-derived stem cells using bioluminescence imaging. Mol Imaging Biol. 13 (4), 633-645 (2011).
  13. Wolbank, S., et al. Labelling of human adipose-derived stem cells for non-invasive in vivo cell tracking. Cell Tissue Bank. 8 (3), 163-177 (2007).
  14. Heymer, A., et al. Iron oxide labelling of human mesenchymal stem cells in collagen hydrogels for articular cartilage repair. Biomaterials. 29 (10), 1473-1483 (2008).
  15. Hemmrich, K., Meersch, M., von Heimburg, D., Pallua, N. Applicability of the dyes CFSE, CM-DiI and PKH26 for tracking of human preadipocytes to evaluate adipose tissue engineering. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 117-127 (2006).
  16. Shim, G., et al. Pharmacokinetics and in vivo fate of intra-articularly transplanted human bone marrow-derived clonal mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 24 (9), 1124-1132 (2015).
  17. Chen, B. K., et al. A safety study on intrathecal delivery of autologous mesenchymal stromal cells in rabbits directly supporting Phase I human trials. Transfusion. 55 (5), 1013-1020 (2015).
  18. Chan, M. M., Gray, B. D., Pak, K. Y., Fong, D. Non-invasive in vivo imaging of arthritis in a collagen-induced murine model with phosphatidylserine-binding near-infrared (NIR) dye. Arthritis Res Ther. 17, 50 (2015).
  19. Texier, I., et al. Cyanine-loaded lipid nanoparticles for improved in vivo fluorescence imaging. J Biomed Opt. 14 (5), 054005 (2009).
  20. Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
  21. Rahmati, M., Mobasheri, A., Mozafari, M. Inflammatory mediators in osteoarthritis: A critical review of the state-of-the-art, current prospects, and future challenges. Bone. 85, 81-90 (2016).
  22. Detante, O., et al. Intravenous administration of 99mTc-HMPAO-labeled human mesenchymal stem cells after stroke: in vivo imaging and biodistribution. Cell Transplant. 18 (12), 1369-1379 (2009).
  23. Hu, S. L., et al. In vivo magnetic resonance imaging tracking of SPIO-labeled human umbilical cord mesenchymal stem cells. J Cell Biochem. 113 (3), 1005-1012 (2012).
  24. Xia, Q., et al. Intra-articular transplantation of atsttrin-transduced mesenchymal stem cells ameliorate osteoarthritis development. Stem Cells Transl Med. 4 (5), 523-531 (2015).
  25. Jasmin, , et al. Optimized labeling of bone marrow mesenchymal cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles and in vivo visualization by magnetic resonance imaging. J Nanobiotechnology. 9, 4 (2011).
  26. Lehmann, T. P., et al. Coculture of human nucleus pulposus cells with multipotent mesenchymal stromal cells from human bone marrow reveals formation of tunnelling nanotubes. Mol Med Rep. 9 (2), 574-582 (2014).
  27. Wang, W., et al. Human adipose-derived mesenchymal progenitor cells engraft into rabbit articular cartilage. Int J Mol Sci. 16 (6), 12076-12091 (2015).

Play Video

Cite This Article
Li, M., Hao, M., Jiang, D., Chen, Y., Wang, W. In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye. J. Vis. Exp. (128), e56273, doi:10.3791/56273 (2017).

View Video