Summary
Este protocolo describe un medio eficaz para controlar la persistencia de la célula y la biodistribución de humanas derivados del adiposo células madre mesenquimales (haMSCs) por far-red de la fluorescencia de etiquetado en un modelo de ratas rodilla osteoartritis (KOA) mediante inyección intra-articular (IA).
Abstract
Para apoyar la aplicación clínica de humano adiposo derivado mesenquimal (haMSC) terapia de células madre para la artrosis de rodilla (KOA), examinamos la eficacia de la persistencia de la célula y la biodistribución de haMSCs en modelos animales. Hemos demostrado un método para etiquetar la membrana de la célula de haMSCs con colorante fluorescente lipofílico. Posteriormente, la inyección intraarticular de las células etiquetadas en ratas con KOA quirúrgico inducido fue monitoreada dinámicamente por un en vivo sistema de imagen. Se empleó el lipofílico carbocyanines hizo (DilC18 (5)), un far-red análogo fluorescente de Dil (dialkylcarbocyanines), que utiliza un láser rojo para evitar la excitación de la autofluorescencia verde natural de los tejidos circundantes. Además, los espectros de emisión rojo-cambiado de puesto de permitir la proyección de imagen de tejidos profundos en animales vivos y el procedimiento de etiquetado no causaron efectos citotóxicos o daño funcional de haMSCs. Este enfoque ha demostrado ser un método de seguimiento eficiente para haMSCs en un modelo de ratas KOA. La aplicación de este método podría utilizarse también para determinar la vía de administración óptima y la dosis de MSCs de otras fuentes en los estudios preclínicos.
Introduction
Osteoartritis de rodilla (KOA) es un desorden degenerativo, resultantes de la pérdida de cartílago articular y la inflamación progresiva, que se ha convertido en una enfermedad crónica importante en los ancianos en el mundo1. Sin embargo, los tratamientos actuales con fármacos antiinflamatorios, suplementos físicos y procedimientos quirúrgicos sólo pueden proporcionar alivio temporal de dolor sintomático2.
Humanas derivado de adiposo células madre mesenquimales (haMSCs) se han convertido en un prometedor remedio regenerativo para la osteoartritis de la rodilla, debido a su diferenciación multipotent potencial para regeneración de cartílago e inmunomoduladores propiedades3, 4. En comparación con vías farmacológicas para investigar mecanismos de acción en vivo, seguimiento de haMSCs vivo en modelos animales de pequeño KOA es actualmente instructivo para establecer la razón de ser de y la factibilidad de la terapia de haMSC antes de la aplicación clínica. Para las pruebas preclínicas, meniscectomy medial (MM) desestabiliza la carga mecánica de la articulación para inducir KOA en ratas, que ofrece un modelo relativamente factible con reproducibilidad constante5. La aparición de KOA inducida por MM es anterior a la transección del ligamento cruzado anterior sola o combinada con parcial meniscectomy intermedio6. Por lo tanto, las interacciones a largo plazo entre haMSCs inyectado con el microambiente patológico de KOA son a menudo evaluadas en ratas inducidas por MM7,8.
Aunque la eficacia terapéutica de haMSCs ha sido ampliamente divulgado conocimiento relevante sobre la persistencia en vivo de haMSCs implantado mediante inyección intra-articular (IA) es escaso9,10. Por lo tanto, distintos métodos de etiquetado celulares han sido desarrollados, incluyendo el immunohistology11, luciferasa12, transfección de13 proteína fluorescente verde, óxido de hierro de etiquetado para la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI)14 y numerosas células fluorescentes tintes8,15,16. Comparado con el análisis de la histología de la mano de obra intensiva, en vivo no invasivo la proyección de imagen emplea dispositivos ópticos para detectar la distribución en tiempo real y dinámica de las células etiquetadas con señales fluorescentes10,17. Para la proyección de imagen funcional de células vivas, etiquetado fluorescente de cytocompatible es una técnica de sofisticado rastreo radioactivo libre para revelar actividades celulares después de trasplante de células madre18. Por otra parte, tintes lipofílicos fluorescentes multicoloras poseen ventajas sobre tintes hidrófilos amino reactivos o proteínas fluorescentes, incluyendo la permeabilidad de la célula mejorada y mayor fluorescencia cuántica rendimientos19.
Por lo tanto, los protocolos aquí utilizan un rojo láser para excitar las células etiquetadas con carbocyanines lipofílico hizo (DilC18(5)), que es un far-red fluorescente Dil (dialkylcarbocyanines) analógico20. Los espectros de excitación y emisión rojo-cambiado de puesto de evita autofluorescent interferencia y permite la proyección de imagen durante un largo período de tiempo en animales vivos8de tejidos profundos. Este método de seguimiento de células en vivo con que es válido para el monitoreo de células madre trasplantadas, tales como haMSCs, en modelos animales, que es esencial para entender y mejorar la actual terapia regenerativa con células madre.
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Protocol
procedimientos con sujetos animales fueron aprobados por el cuidado de Animal institucional local y Comité de ética, con un esfuerzo para minimizar el sufrimiento de los animales. El siguiente protocolo fue aprobado por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) en Shanghai novena personas ’ s Hospital afiliado a Shanghai JiaoTong University School of Medicine con el protocolo número [2017] 063.
1. establecimiento de un modelo de artrosis de rodilla de ratas de Surgically-Induced
- para este procedimiento quirúrgico, ratas Sprague Dawley (SD) macho de uso 8-12 semanas de edad con un peso entre 250 y 300 g.
- Anestesiar a los animales y 40 mg/kg tiletamina zolazepam de 40 mg/kg mediante inyección intramuscular.
- Colocar el animal en una posición lateral izquierda sobre una platina calefactada. Afeitado completamente la rodilla derecha con una navaja de afeitar. Desinfectar la zona quirúrgica con solución providone-yodo al 10% seguido de etanol al 70%, repetir dos veces más y luego pintar con solución providone-yodo al 10% y cubrir la zona no quirúrgica con un paño quirúrgico.
- Usando un bisturí, haga una incisión de 2 cm lateralmente a lo largo del tendón rotuliano para exponer el jointcapsules.
- Utilizar un bisturí para transecto del ligamento colateral medial. Reflejar el menisco hacia el fémur.
- Goteo de solución estéril de cloruro de sodio 0,9% en la superficie del cartílago articular durante la operación para evitar que el cartílago de la desecación.
- Coge el menisco medial con pinzas y corte a través el menisco en su punto más estrecho de la fijación tibial con un bisturí ( figura 1A). Evitar lesionar el cartílago.
- Cerca de la cápsula articular con una sutura absorbible 4-0.
- Controlar las ratas quirúrgicas hasta que recupere conciencia.
- Inyectar 20 mg/kg de gentamicina para prevenir la infección y 0,05 mg/kg de buprenorfina por vía intramuscular para aliviar el dolor después de la cirugía.
- Mantener las ratas en un Animalario con control de temperatura en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h durante 3-8 semanas Inicio KOA. Los animales continúan recibiendo medicamentos para el dolor, incluyendo pero no limitado a buprenorfina (0,05 mg/kg, i.m.) y gentamicina (20 mg/kg, i.m.), si persisten los síntomas de dolor.
2. Histología de rata KOA modelo
- sacrificar a las ratas con la excesiva inhalación de 2 CO (agregar una tasa de relleno de aproximadamente el 30% del volumen por minuto con dióxido de carbono del aire existente en la cámara para hacer la inconsciencia animal dentro de 2-3 min flujo de CO2 mantener por un mínimo de 1 minuto después de la respiración cesa.) en el indicado tiempo puntos (representante se muestran los resultados en 8 semanas de la inducción de KOA que van desde 3 a 8 semanas) después de la cirugía.
- disecar la piel y el músculo alrededor de las articulaciones de rodilla y de las articulaciones de la rodilla con un bisturí.
- Fijar las articulaciones de rodilla en paraformaldehído al 4% (PFA) durante 3 días a temperatura ambiente. Luego, descalcificación de las muestras en 20% de ácido etilendiaminotetracético (EDTA) por 4 semanas a 4 ° C y cambiar el EDTA cada 3 días.
PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es tóxico, usar equipo de protección personal (EPP), tales como guantes y gafas. - Deshidratar las muestras usando un procesador de tejidos automático. El menú para iniciar así un ciclo de lavado: etanol al 70% durante 1 hora; entonces 80% etanol y etanol al 95% para 1 h respectivamente; seguido por 2 ciclos de etanol al 100% para 1 h; Posteriormente, xileno dos veces durante 1 hora cada vez y parafina 3 veces en 58 ° C durante 1 hora cada vez.
PRECAUCIÓN: Xileno es tóxico, así que use PPE apropiado, como guantes y gafas.
Nota: Opcionalmente, utilice frascos Coplin para deshidratación manual con la misma configuración que el procesador de tejidos automático. - Deposite el aspecto medial de la cara común intacto e incrustar en el bloque de parafina con el tejido que encaja en el centro.
Nota: Opcionalmente, utilice pinzas para insertar manualmente las muestras en el bloque de parafina. - Empezar a disminuir 5 μm secciones sagitales del margen medial de la articulación para 30 μm intervalos con 2 secciones seriales en micrótomo rotatorio.
- Secciones en portaobjetos de vidrio y Desparafinizar el portaobjetos en xileno. Entre las secciones de serie 2, mancha una diapositiva con hematoxilina & eosina (H & E) tinción: 0,1% hematoxilina durante 15 min, 1% solución de ácido acético para 10 s y 0.5% eosina durante 10 minutos. Y mancha el otro portaobjetos con tinción de Safranina O/Fast Green: 0,1% hematoxilina durante 15 min, 0.02% verde Fast Green durante 3 min., 1% solución de ácido acético para 10 s y 0.1% O safranina durante 3 min
PRECAUCIÓN: Xileno es tóxico, usar PPE apropiado, tales como guantes, gafas. - Anotar las diapositivas manchadas con el sistema de evaluación internacional de la sociedad de investigación de la osteoartritis (OARSI) histopatología en ratas 6.
3. Etiquetado de humanos las células madre mesenquimales con el tinte fluorescente hizo
- preparar hizo etiquetado celular solución en etanol 100% a una concentración de 1 mM. Proteger la solución de etiquetado de la célula de la luz y almacenar a temperatura ambiente por 6 meses.
- Cultivar haMSCs con procedimientos de cultivo celular estándar en Dulbecco ' s modificado Eagle ' medio s (DMEM) suplementado con 1% penicilina y estreptomicina y 10% fetal suero de ternera (FCS) en un plato de petri de 10 cm.
- Separar haMSCs con tripsina de 0.25% de 2 mL con confluencia de previo a alrededor de 80% de EDTA 1 mM.
- Neutralizar la tripsina con medio de cultivo de 4 mL y centrifugar las células a 800 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
- Suspender las células en una densidad de 1 x 10 6 células/mL en medio de cultivo libre de suero de 5 mL.
- Etiqueta las células mediante la adición de 50 μl que solución de etiquetado de células en 5 mL medio de cultivo libre de suero a 37 ° C por 50 minutos
- Girar las células etiquetadas a 800 x g durante 3 min
- Lavan las células dos veces con 5 mL fosfato buffer salino (PBS) a 800 x g durante 3 min.
- Comprobar la haMSCs etiquetados usando un microscopio de fluorescencia con un sistema de filtro de Cy5.
- Contar las células con tinción de azul de tripano y obtener 2.5 x 10 6 células viables en 100 μl PBS para la inyección.
4. En Vivo Fluorescente imágenes a pista haMSCs
- ocho semanas después de la cirugía (paso 1), anestesiar las ratas KOA por la inyección intramuscular de tiletamina de 25 mg/kg y zolazepam de 25 mg/kg.
- Afeitado completamente la rodilla derecha con una navaja para exponer el área. Desinfectar el área con etanol al 70%.
- Con una aguja de jeringa 26 G, inyectar 2.5 x 10 6 etiquetado células en 100 μl PBS en el centro de la zona del triángulo formado por el lado medial del ligamento rotuliano, el cóndilo femoral medial y el cóndilo tibial medial ( figura 1B).
- Abra el software de la proyección de imagen e inicializar la bioluminiscencia en vivo sistema de imagen.
- Ratas de posición en el decúbito supino posición en la etapa central del sistema de proyección de imagen y cierre la puerta de la cámara de.
- Comprobar la " fluorescente " casilla de verificación y seleccione filtro fluorescente fija de 640 nm para la excitación y 680 nm de emisión ( figura 2A).
- Seleccionar campo de visión a D. Set pixel binning en medio (8), F/Stop para 2 y la exposición tiempo al auto. Mantener el óptimo tiempo de exposición constante para obtener resultados comparables en todo el estudio ( figura 2A).
- Quitar el animal de la etapa y el monitor para la recuperación de la anestesia.
Nota: Animal del lugar en una almohada cubierta con 2-3 capas de toallas de. - Elegir las unidades de eficiencia radiante para la medición de la fluorescencia ( figura 2B). Seleccione las regiones de interés (ROI) para el análisis y cuantificación de señales fluorescentes de cada imagen ( figura 2).
- Repetir en vivo la proyección de imagen para cada rata secuencialmente para el estudio de retención longitudinal haMSCs en el empalme de.
Nota: Sugerimos a los animales de la proyección de imagen ' señales fluorescentes por sistema de proyección de imagen in vivo una vez cada dos días durante la primera semana después de la inyección y una vez por semana hasta que la señal no puede ser detectada.
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Representative Results
Para inducir el modelo KOA, MM fue realizado en la articulación de la rodilla derecha de ratas SD (figura 3). Ocho semanas después de la cirugía, las ratas fueron sacrificadas y las secciones seriadas de empalmes de la rodilla se evaluaron con dos H & E y Safranina O/Fast Green tinción (figura 4). H & E la coloración, la superficie del cartílago articular exhibió las fronteras más ásperas en las rodillas de cirugía de la articulación normal sin necesidad de cirugía. Verde O/safranina-Fast de tinción, observó disminución de proteoglicanos (coloración roja) y aumentado fibrilado colágeno (coloración verde) en la cirugía común comparado con el normal, que indica la progresión de fenotipos degenerativos de KOA inducida por la cirugía. Para asemejarse a la progresión de KOA humana, las ratas fueron sacrificadas en 3 semanas, 6 semanas y 8 semanas después de la MM a patogenesia de evaluar y determinar el tiempo de las intervenciones terapéuticas.
Con la etiqueta haMSCs fue visualizada en modelo de rata KOA por un óptico en vivo sistema de imagen. 1 h después de etiquetar, con la etiqueta haMSCs exhibió alrededor de formas en vitro. El etiquetado de eficiencia había alcanzado alrededor del 95%. Después de 24 h, cultivadas haMSCs etiquetado exhiben formas de eje largo, indicando que hizo no cambia la capacidad de adherencia de haMSCs en vitro (figura 5). Ocho semanas después de la cirugía, 2,5 x 106 ha marcado haMSCs fueron inyectadas en las juntas con KOA. Aquí, lo hizo con la etiqueta haMSCs se observaron en la junta local desde el día 0 (8 semanas después de la cirugía) hasta el día 70 después de la inyección (18 semanas después de la cirugía) mediante el uso de un en vivo imágenes de sistema (figura 6).
Figura 1: esquema campo quirúrgico para el área de cirugía y la inyección de MM para la entrega del celular. (A) este diagrama muestra el área quirúrgico, que está resaltado en color azul. (B) este esquema indica el sitio de la inyección dentro del área en un círculo rojo. Definiciones de siglas son las siguientes: MM, menisco medial; MCL, ligamento colateral medial; LM, menisco lateral; LCL, ligamento colateral lateral; PL, ligamento rotuliano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: pantalla de fotos de software de tratamiento de imágenes en vivo. (A) configuración de la clave de parámetros para la adquisición de la imagen fluorescente se destaca con cuadrados rojos. (B) eficiencia radiante es elegido como la unidad para la medición de la fluorescencia. (C) en la paleta de herramientas, las regiones de interés (ROI) están en un círculo para las mediciones de eficacia de la fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: los procedimientos de KOA quirúrgicamente inducida. (A) exposición del espacio común de la rodilla. (B) la estructura interna de la articulación, con una flecha negra que indica el menisco medial de la rodilla. (C) el menisco medial disecado. (D) el espacio articular y la piel están cerrados.
Figura 4: cuadros histológicos representativos de las articulaciones de rodilla y análisis estadístico de puntuación OARSI de KOA. (A) ocho semanas post cirugía MM en ratas, se evaluaron las secciones seriales de empalmes de la rodilla con H & E y Safranina O/Fast verde coloración. H & E coloración demostró se redujo el grosor del cartílago en la rodilla de la cirugía. Safranina O/Fast verde coloración demostró disminución de proteoglicanos (coloración roja) y fibrilado colágeno (coloración verde) en la cirugía de la rodilla en comparación con la rodilla normal. Barra de escala = 500 μm. (B) para el análisis estadístico resultado de osteoartritis en las articulaciones normales y juntas KOA (n = 3). Los datos se expresan como ±SEM. * indica p < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: morfología de etiquetado como hizo haMSCs. Campo brillante, fluorescentes y combinadas las imágenes de haMSCs en 1 h después de etiquetar se muestran en el panel superior. Campo brillante, fluorescentand se combinaron imágenes de at24 haMSCs h después de etiquetado aparecen en el panel inferior. Barra de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: En vivo la proyección de imagen de etiquetado como hizo haMSCs. Después de la inyección de 2,5 x 106 etiquetado como hizo haMSCs, se muestran imágenes representativas de las ratas KOA. Lo hizo con haMSCs se detectaron hasta 9 semanas localmente en las articulaciones de las ratas KOA. Esta figura se ha reproducido de la publicación de Li M et al8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Normas de seguridad y estudios de biodistribución de terapia de células madre están urgente antes de que podemos llevar tratamiento regenerador de células madre para el KOA del Banco a la cabecera. Sin embargo, el medio ambiente patológico de la enfermedad desempeña un papel importante en la persistencia y la biodistribución de trasplantados haMSCs10. Recientemente, nuestro grupo demostró que la inyección intraarticular de haMSCs persistió ya en un ambiente patológico de KOA de las inyecciones bajo condiciones normales8. Es posible que el microambiente inflamatorio y degenerativo puede reclutar células madre mesenquimales para reparación y posteriormente favorecer la retención de haMSCs inyectado1,21. Además, los perfiles de seguridad y eficacia de haMSCs pueden estar influenciados por el momento de la entrega del celular con respecto a la severidad de KOA, por lo que la optimización de la progresión de KOA en animales de laboratorio proporcionará datos valiosos para apoyar los ensayos clínicos. Con el objetivo de asemejarse de leve a moderada severidad de KOA humano, ratas inducidas por MM se permiten desarrollar KOA desde 3 hasta 8 semanas. En este estudio, evaluaron el cambio morfológico del cartílago histopatológicas puntajes 8 semanas después de la cirugía, que ofrece un modelo relativamente factible con un grado moderado de KOA para investigar la eficacia y seguridad de haMSCs8. Hemos demostrado aquí un método sencillo y factible a la etiqueta haMSCs con tinta far-red membrana lipofílica fluorescente para la evaluación preclínica de la eficacia a largo plazo.
Los inconvenientes de esta técnica son que el tejido reflejado debe ser cerca de la piel y una cantidad sustancial de haMSCs con se requiere para la adquisición de señal suficiente debido a las producciones de quántum modesta de lo hizo. Aunque un en vivo imagen sistema óptico permite estudios longitudinales no invasivo de haMSCs modelos de biodistribución en KOA, las tendencias en el número de células y ubicación sólo se observan en general. Se abordará el análisis del destino de la célula de vástago, en particular de la célula proliferación y diferenciación, utilizando también la asignación de destino y proyección de imagen de microscopía de alta resolución.
Actualmente, una amplia variedad de técnicas de etiquetado están disponibles para el en vivo rastreo de células madre, incluyendo etiquetas radiactivas, nanopartículas y transducción viral de reportero genes22,23,24. Sin embargo, etiquetado radiactivos así como transducción viral de las células madre puede interferir con las propiedades genéticas de las células, que posteriormente pueden afectar tronco célula proliferación y supervivencia en vivo16. Por otra parte, rastreando células madre utilizando MRI por la absorción de nanopartículas como agente contrato requiere mejorar la resolución espacial a través de un fuerte campo magnético, que puede plantear las preocupaciones por la sensibilidad de esta técnica25. Colorantes fluorescente de la célula, tales como PKH26, CM-DiI y CFSE exhiben diversos grados de citotoxicidad y ofrecen una duración relativamente limitada (hasta 4 semanas) de tejido adiposo de etiquetado derivadas de células15. Por el contrario, exhibe fluorescencia débil en soluciones acuosas. Una vez incorporado con una membrana lipídica, difunde uniformemente dentro de la membrana de la célula y expresa estable fluorescencia far-red19. Células viables de las etiquetas y no afectan su proliferación y función de18. Más importante aún, los tintes no transferencia de células marcadas a las células sin etiqueta a menos que haya una interacción directa de la membrana entre las células26. La excitación far-red y espectros de emisión de evita la interferencia de autofluorescent de tejidos circundantes y proporciona proyección de imagen de tejidos profundos en animales vivos. Estas características permiten hicieron etiquetado como una técnica ideal de seguimiento a largo plazo para estudiar el destino de haMSCs implantado intra-articularly. Por lo tanto, hemos demostrado una fiable metodología para monitorear lo hizo con haMSCs durante un período de 63 días en la rata modelo8.
Dentro del protocolo para el seguimiento de haMSCs etiquetado como lo hizo en un modelo de rata KOA, son los pasos críticos para obtener resultados fiables y factibles para asegurarse de que: 1) el menisco hacia el fémur es completamente cortado a través en cada modelo de la rata para la constante aparición de KOA, 2) teñir una proporción optimizada de 10 μL contra 106 células haMSC por un min 50 manchas, 3) es el umbral de detección en vivo para haMSCs lo marcado entre 104 y 105 células, mientras que por encima de 106 células recomienda en el presente Protocolo.
Una vez que se domina esta técnica, la aplicación de este método podría utilizarse para determinar la ruta óptima o dosificación para la administración de MSCs en los estudios preclínicos. Este protocolo puede ser fácilmente adaptado para la evaluación a largo plazo preclínica de biodistribución en vivo de las células madre mesenquimales (MSCs) de otras fuentes, incluyendo la médula ósea y cordón umbilical de la sangre. A la luz de la prospectiva para el destino de la célula de vástago en modelos animales de KOA, immunohistology estudio de haMSCs xenogeneicos, como Ki67 proliferación8 y colágeno II para cartílago articular diferenciación27, puede combinarse con esto técnica.
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Disclosures
Li Meng, Hao Ming y Wang Wen son empleados actuales y los titulares de opciones sobre acciones de grupo de Biomedicina celular (Nasdaq: CBMG). Otros autores no declaran ningún conflicto de interés.
Acknowledgments
El presente estudio fue apoyado por Shanghai innovación fondos (1402H 294300) patrocinado por la ciencia y la tecnología de la Comisión de la Shangai municipio (CN) a Dr. Wen Wang. Nos gustaría agradecer a Dr. Zhou Guangdong (nacional tejido ingeniería centro de China) por su asistencia técnica y asesoramiento para este manuscrito. También quisiéramos agradecer a Sr. Huitang Xia (Hospital de Shanghai novena popular) por su ayuda en el bienestar de los animales.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrx VMR animal anesthesia system | Midmark | VIP3000 | |
| 4-0 suture | Shanghai Jinhuan | KC439 | |
| Razor | Pritech | LD-9987 | |
| Gentamicin | Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd. | None | |
| 0.9% Sodium chloride solution | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. | H43020455 | |
| Penicillin | Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Buprenorphine | Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Dilute to final concentration of 10% in PBS |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Dilute to final concentration of 20% in PBS |
| 0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s | Sigma-Aldrich | MHS16 | |
| 0.5% Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110116 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor | Thermo Fisher | A78400006 | |
| Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center | Thermo Fisher | B64100010 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| DiD | Molecular Probes, Life Technologies |
V-22887 | |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS | GIBCO, Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-114 | |
| 10 cm Petri Dish | Corning | V118877 | |
| Centrifuge | Beckman | Optima MAX-TL | |
| Fluorescent microscope | Olympus | BX53 | |
| 0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Titetamme | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Zolazepam | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Sterile hyposermic syringe for single use 26G | Shanghai Misawa Medical Industry | None | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| Living Imaging 4.0 software | PerkinElmer | None |
References
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