Summary
このプロトコルでは、効率的に遠赤色蛍光 (IA) の関節内注入によるラット膝変形性関節症 (KOA) モデルで、セルの永続性とひと脂肪由来間葉系幹細胞 (haMSCs) の体内を監視する方法について説明します。
Abstract
膝変形性関節症 (コア)、ひと脂肪由来間葉系幹細胞 (haMSC) 療法の臨床応用を支援するため、セルの永続性の有効性と動物モデルにおける haMSCs の体内を調べた。脂溶性色素と haMSCs の細胞膜にラベルを付ける方法を示しました。その後、心術のコアを持つラットの標識細胞の関節内注入は、生体内イメージング システム動的に監視されました。我々 は、親油性を採用 carbocyanines でした (DilC18 (5))、周囲の組織から自然の緑色蛍光の励起を避けるために赤色レーザーを活用した遠赤色蛍光 Dil (dialkylcarbocyanines) アナログ。またの赤いシフトの発光スペクトルは、生きている動物の深い組織イメージングとラベリングのプロシージャは細胞毒性または haMSCs に機能障害生じなかった許可でした。このアプローチは、KOA ラットモデルにおける haMSCs の効率的な追跡方法であると示されています。最適な投与経路と前臨床試験で他のソースからの MSCs の投与量を決定するこのメソッドのアプリケーションが使えます。
Introduction
膝変形性関節症 (コア) は、関節軟骨の損失や世界の1のまわりの高齢者の主要な慢性疾患になった進歩的な炎症から生じる退行性疾患です。ただし、抗炎症薬、物理的なサプリメントや手術の手順を使用して現在の治療症状痛み2の一時的な救済を提供することがあります。
膝変形性関節症、軟骨の再生と免疫調節特性3、潜在的な多能性分化のための有望な再生治療薬となっているひと脂肪由来間葉系幹細胞 (haMSCs) 4。生体内でアクションのメカニズムを調査する薬理学的ルートと比べると、小さなコア動物モデルでライブの haMSCs を追跡する現在の理論的根拠と臨床応用の前に haMSC 療法の有効性を確立するために有益です。前臨床試験の内側半月 (MM) は、一貫性のある再現性5比較的実現可能なモデルを提供するラットでは, コアを誘導するために関節の機械的負荷を不安定化します。MM によるコアの発症は、膝前十字靭帯断裂単独あるいは部分内側半月6より前です。したがって、コアの病理学的微小環境と注入された haMSCs の長期的な相互作用は多くの場合8MM7,投与ラットにおける評価されます。
HaMSCs の薬効は広く報道されると、関連する知識をされているが (IA) の関節内注射による注入 haMSCs の生体内で持続性は乏しい9,10です。したがって、様々 な細胞ラベリング方法が開発されて、immunohistology11、ルシフェラーゼ12、緑の蛍光蛋白質13トランスフェクション、鉄酸化物の磁気共鳴画像 (MRI)14 のラベリングなど、および多数蛍光セル染料8,15,16。手間のかかる組織解析と比較して、生体内の非侵襲的イメージングはリアルタイム配信や蛍光信号10,17の付いた細胞の動態を検出する光学デバイスを採用しています。機能の生きているセルイメージ投射のため cytocompatible の蛍光標識、幹細胞移植18後細胞活動を明らかにする洗練された放射性無料トラッキング手法です。また、多色蛍光脂溶性色素は、アミノ反応親水性染料や蛍光蛋白質が改良されたセル透磁率および増強蛍光量子収量19を含む上の利点を所有しています。
こうして、ここで含まれるプロトコル利用赤い脂溶性 carbocyanines ラベルの付いたセルを励起するレーザーでした (DilC18(5))、遠赤色蛍光 Dil (dialkylcarbocyanines) アナログ20であります。赤いシフト励起と発光スペクトルされる干渉を回避したし、深い組織の生きている動物の8時間の長期間画像をことができます。この方法で追跡細胞の生体内での付いたでしたを理解し、現在の幹細胞再生治療の向上に不可欠な動物モデルでの haMSCs などの移植の幹細胞を監視するためです。
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Protocol
動物を対象とする手順は動物の苦痛を最小限に抑える努力をローカル機関動物のケアと倫理委員会で承認されました。次のプロトコルは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 上海 9 人によって承認された ’ プロトコルと上海交通大学医学部付属病院 s [2017] 番号 063
。1 です Surgically-Induced ラット膝関節変形性関節症モデルの確立
- 。
- 40 mg/kg チレタミンと 40 mg/kg 筋肉内注射を介してチレタミン動物を麻酔します 。
- は、左側臥位で加熱ステージに動物を配置します。右膝を徹底的にかみそりで剃る。70% エタノールに続いて 10 %providone ヨード溶液による外科的領域を消毒、2 回以上繰り返すと後 10 %providone ヨード溶液でペイントし、非外科的手術パッド領域をカバーします 。
- 、Jointcapsules を公開する膝蓋腱に沿って横方向に 2 cm の切開を行う手術のメスを使用しています 。
- は、内側側副靱帯のトランセクトを手術用メスを使用します。大腿骨に向かってメニスカスを反映します 。
- 軟骨が乾くを防ぐために操作中に関節軟骨の表面の滅菌の 0.9% 塩化ナトリウム溶液を滴下します 。
- は、ピンセットで内側半月板をつかむし、メス ( 図 1 a) と脛骨の添付ファイルからの狭いポイントで半月板をカットします。避けるために軟骨を負傷します 。
- 4-0 吸収性縫合糸と関節包を閉じます 。
- 彼らは意識を取り戻すまで、手術のラットを監視します 。
- 感染や手術後の痛みを和らげるために筋肉内のルートを通じて 0.05 mg/kg ブプレノルフィン 20 mg/kg のゲンタマイシンを挿入します 。
- 温度制御動物施設発症コアに 3-8 週の 12 h 明暗サイクルの下でラットを維持します。動物が痛み症状が続く場合、ブプレノルフィン (0.05 mg/kg, i. m.) とゲンタマイシン (20 mg/kg, i. m.) に限定されないなどの鎮痛薬を受け取り続けます 。
2。ラット コア モデルの組織評価
- 過剰な CO 2 吸入 (動物の無意識を作るに追加商工会議所の既存の空気に二酸化炭素を 1 分あたり試験室の容積の約 30% のフィル レートとラットを犠牲に2-3 分の最低維持 CO2 流れ呼吸後 1 分以内停止します。)手術後時点 (代表コア誘導 3 から 8 週間までの 8 週間で結果が表示されます) を示した
- メスと膝継手を切り肌と膝の関節の周りの筋肉を解剖 。
- は、室温で 3 日間の 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の膝継手を修正します。その後、4 ° C で約 4 週間 20% エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) のサンプルをめし、EDTA を 3 日ごとに変更します
。 注意: パラホルムアルデヒドは有毒である、手袋、眼鏡など適切な個人用保護具 (PPE) を着用します 。
- は、自動ティッシュ プロセッサを使用してサンプルを脱水します。フラッシュ サイクルを次のように起動するメニューを設定: 70% のエタノールの 1 h。その後 80% エタノールと 95% のエタノール 1 h のそれぞれ;1 時間の 100% エタノールの 2 サイクルが続くその後、1 h の 2 倍のキシレンのたび、たび 58 ° C 1 時間で 3 回パラフィンします
。 注意: キシレンは有毒である、ので、適切な PPE は、手袋、眼鏡などを着用します
。 注: 必要に応じて、Coplin Jar の使用自動ティッシュ プロセッサとして同じセットアップと手動脱水します 。
- そのまま接合面の内側面を下に置くし、中央に埋め込まれた組織をパラフィン ブロックに埋め込む
。 注: 必要に応じて、パラフィン ブロックにサンプルを手動で埋め込む鉗子を使用します 。
- 回転式ミクロトームで 2 連続切片で 30 μ m 間隔で 5 μ m 矢状セクション内側縁から関節をカットを開始します 。
- は、スライド ガラス上のセクションをマウントし、キシレンでスライドを deparaffinize します。2 連続切片の間ヘマトキシリンと 1 つのスライドを染色 & エオシン (H & E) 染色: 0.1% 1%、15 分間ヘマトキシリン 10 s および 0.5% の酢酸水溶液 10 分エオシン。サフラニン O/高速の緑色の染色と他のスライドを染色: 0.1%、0.02% の 15 分間ヘマトキシリン 3 分、1% の高速グリーン酢酸溶液に 10 s および 3 分の 0.1% サフラニン O
注意: キシレンは有毒である、眼鏡、手袋などの適切な PPE を着用します 。
- ラット 6 で変形性関節症の研究の社会インターナショナル (OARSI) 病理組織評価システムを使用して染色スライドをスコアします 。
3。蛍光色素は、ヒト間葉系幹細胞をラベリング
- 1 mM の濃度で 100% エタノールの細胞ラベリング ソリューションの準備をしました。光から保護して細胞ラベリング ソリューションと 6 ヶ月間常温保存します 。
- 成長ダルベッコの標準的な細胞培養プロシージャと haMSCs ' s 変更イーグル ' s 培 (DMEM) 1% ペニシリン、ストレプトマイシンと 10% 牛胎児血清 (FCS) 10 cm シャーレで 。
- 1 mM EDTA 合流前の約 80% 点と 2 mL 0.25% トリプシン haMSCs をデタッチします 。
- 培地 4 mL のトリプシンを中和し、室温で 3 分間 800 x g でセルをスピンします 。
- 5 mL 無血清培地の 1 x 10 6 セル/ml の密度でセルを中断します 。
- 50 を追加することによって、セルのラベル μ L は 5 mL 50 分の 37 ° C で培養の無血清細胞ラベリング ソリューション
- 800 x g で 3 分間でラベル付きセルをスピン
- 5 mL リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) 3 分間 800 x g で 2 セルを洗浄して回以上 。
- Cy5 のフィルター セットと蛍光顕微鏡を用いたラベル付きの haMSCs を確認してください 。
- トリパン ブルー染色でセルをカウントし、2.5 倍の注射用 100 μ L の PBS で 10 の 6 の実行可能なセルを取得します 。
4。生体内で蛍光イメージング トラック haMSCs
- (ステップ 1)、手術後 8 週間は 25 mg/kg チレタミンとチレタミン 25 mg/kg の筋肉内投与によりコア ラットを麻酔します 。
- 右膝を徹底的に関節部を公開するかみそりで剃る。70% エタノールで関節部を消毒します 。
- 2.5 x 10 26 G 注射針を使用して注入 6 標識三角形領域の中央に 100 μ L の PBS 中に浮遊細胞は内側膝蓋靭帯、内側の大腿骨顆と脛骨の内側顆 (によって形成されます。 図 1 b).
- イメージング ソフトウェアを開き、体内 の発光イメージング システムを初期化します 。
- イメージング システムの中央ステージでの位置や部屋のドアを閉じる位置ラット臥 。
- チェック、" 蛍光 " 640 の設定チェック ボックスと蛍光フィルターの選択励起、nm および 680 nm の発光 ( 図 2 a) ため 。 D. 設定中 (8) にピクセルビニングに
- 選択フィールドのビュー 2 と露出に F/ストップの自動時間します。最適な維持します。全体の研究 ( 図 2 a) で同等の結果を取得する一貫性のある露出時間 。
- はステージと麻酔からの回復のためのモニターから動物を削除します
。 注: 加熱パッド上の場所の動物のタオル地の 2-3 層で覆われている 。
- は、放射効率の蛍光 ( 図 2 b) 測定のための単位を選択します。利益 (率 ROI) 分析のための領域を選択し、それぞれのイメージ ( 図 2) から蛍光信号を定量化します 。
- は 生体内 イメージング研究 haMSCs 縦保持関節の順に各ラットのための手順を繰り返します
。 注: 動物のイメージングを提案 ' 蛍光信号を用いたイメージング システム注入後最初の週 2 日に一度と一度毎週まで信号が検出できません 。
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Representative Results
コア モデルを誘導するために MM は SD ラット (図 3) の右ひざ関節で行われました。手術後 8 週間ラットを犠牲に、膝継手の連続切片を両方 H で行った & E、サフラニン O/高速グリーン染色 (図 4)。H の & E 染色、関節軟骨の表面の展示手術膝手術をせず通常の関節よりも粗いボーダー。サフラニン-O/高速緑染色 (赤染色) 減少のプロテオグリカンを観測し、共同手術表現型コア変性の進行を示されている通常のものと比較して繊維コラーゲン (緑染色) を増加手術によって誘導されます。人間のコアの進行に似せて、3 週間、6 週間、病態を評価し、治療の時間を決定する MM 後 8 週間でラットが犠牲になった。
ラベルは haMSCs は光で生体内イメージング システム コア ラットモデルにおける可視化しました。ラベル付け後に 1 h した培養形状ラウンド展示 haMSCs というラベルの付いた。ラベリング効率約 95% に達した。24 h 後、培養したラベル付き haMSCs 展示したかを示す長いスピンドル形状 haMSCs体外(図 5) の付着能力は変更されません。手術後 8 週間 106でしたラベル haMSCs x 2.5 コア接合部に注入しました。ここでは、ラベル付けした haMSCs は、生体内でイメージ投射システム (図 6) を使用して 70 日のポスト噴射 (手術後 18 週) までの日 0 (手術後 8 週間) からローカル共同で観察されました。
図 1: 携帯配信用 MM 手術と注入領域の概略の外科分野します。(A)この回路図は、青色で強調表示されている外科の領域を示しています。(B)この回路図は、赤い丸で囲んだ領域内で注射部位を示します。頭字語の定義は次のとおりです: ミリメートル、内側半月板;MCL、内側側副靱帯です。LM、外側半月板;LCL、外側側副靱帯。膝蓋靭帯の PL。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: in vivo イメージング ソフトウェアの画面例です。(A)蛍光画像の取得のパラメーターのキー設定は赤い四角形で強調表示されます。(B)放射効率は蛍光の測定のための単位として選択されます。(C)蛍光効率測定のため、利益 (率 ROI) の領域で、ツール パレットが囲んでいます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 手術によるコアの手順です。(A)膝の関節腔の露出。(B)膝関節内側半月板を示す黒の矢印での内部構造。(C)郭内側の半月板。(D)共同スペースと皮膚が閉じられます。
図 4: 膝継手とコアの OARSI スコアの統計的解析の代表的な組織学的写真。(A) 8 週間ポスト ラット MM 手術、膝関節の連続切片を H で行った & E、サフラニン O/高速グリーン染色します。H & E 染色を示した手術膝の軟骨の厚さが減少しました。サフラニン O/高速グリーン染色を示したプロテオグリカン (赤染色) を減少し、健常者の膝と比較して手術膝 (緑染色) 繊維のコラーゲンを増加しました。スケール バー = 500 μ m (B)統計解析コア継手と通常関節変形性関節症のスコアのため (n = 3)。データを mean±SEM として表現する、* p を示します < 0.05。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: しなかった分類された haMSCs の形態。明視野、上のパネルにラベリングした後 1 時間で haMSCs の蛍光とマージされた画像のとおりです。明視野、下のパネルで表示されるラベル付け後、始動マージ haMSCs at24 h の画像です。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: In vivoイメージングしたラベル haMSCs の.106でしたラベル haMSCs x 2.5 の注入後、コア ラットの代表的な画像が表示されます。したラベル haMSCs は、KOA ラット関節のローカル 9 週間で検出されました。この図は、李ら8の出版物から再現されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
我々 はベンチから枕元にコアの再生幹細胞治療をもたらすことができる前に、安全基準と体内の幹細胞療法の研究は必要緊急です。ただし、疾患の病理組織学的環境は、永続性と移植 haMSCs10の体内で重要な役割を果たしています。最近、私たちのグループを示した haMSCs の関節内注入の永続化をもはや病理コア環境よりも通常の条件8下注射をしました。炎症と変性微小環境が修理の間葉系幹細胞を募集し、その後注入 haMSCs1、21の保持を支持、不可能です。さらに、haMSCs の安全性と有効性のプロファイルは、実験動物の KOA の進行の最適化は臨床試験をサポートするための貴重なデータを提供できるようにコアの重要度に関する携帯配信のタイミングに左右される可能性があります。目的に似た人間のコアの中等度の軽度、3 から 8 週間まで及ぶコアを開発 MM によるラットが許可されています。本研究では軟骨の形態学的変化は、比較的実現可能なモデルの有効性を調査するためコアの中程度と haMSCs8の安全性を提供しています, 術後病理組織学的得点 8 週間によって評価されました。我々 は長期的な前臨床試験の有効性評価のため遠赤色蛍光油性膜色素でラベル haMSCs にシンプルかつ実現可能な方法を紹介しました。
この手法の欠点は、イメージ化された組織が皮膚の近くにする必要がありますおよびラベル haMSCs の相当な量からのささやかな量子収率による十分な信号集録に必要なでした。生体の光イメージング システムにより、非侵襲的な縦断的研究 haMSCs のコアで体内のモデルは、セル数の推移、場所は一般に識別のみことができます。幹細胞の運命、特定の細胞の増殖や分化の解析にも運命のマッピングと高分解能顕微鏡イメージングを用いた対処されます。
現在、さまざまなラベリング技術が生体内で幹細胞追跡、放射性ラベル、ナノ粒子、レポーター遺伝子22,23,24のウイルスの伝達などに使用できます。しかし、幹細胞のウイルスの伝達だけでなく、放射化ラベリングはその後幹細胞増殖と生存体内16に影響を与えるかもしれない細胞の遺伝的性質を妨げる可能性があります。また、契約エージェント必要強磁場を介して空間分解能向上とナノ粒子の通風管によって MRI を用いた幹細胞をトレース、この技術25の感度についての懸念を上げるかもしれないが。蛍光セル染料、PKH26、CM DiI と CFSE 細胞毒性の度合いを示す、脂肪組織をラベリングの比較的限られた期間 (4 週間) 派生セル15など。対照的に、水溶液中で弱い蛍光を展示しました。脂質膜を組み込んだ後は、細胞膜とエクスプレス安定した遠赤色蛍光19内均一に拡散でした。ラベル実行可能な細胞しはない、増殖に影響を与える、機能18。もっと重要なは、それら細胞26間直接膜の相互作用がある場合を除いて、細胞に標識細胞からは染料か転送されません。遠の励起・発光スペクトルの周囲の組織から蛍光干渉を防ぐでしたし、生きている動物の深い組織イメージングを提供します。これらの機能を有効にするは、内リドカイン注入 haMSCs の運命を研究する理想的な長期追跡手法として標識しました。したがって、我々 は信頼性の高い示している監視する方法論がラット モデル8の 63 日間の期間にわたって標識 haMSCs をしました。
KOA ラットモデルではラベルの haMSCs 追跡のためのプロトコル、信頼性の高いかつ実現可能な結果を得るための重要なステップは確認する: をコアの一貫した発症のため各ラットモデルにおける大腿骨に向かって 1) 半月板を完全にカット、2) があります。10 μ L の最適化された比率は、染色、3 50 分の 10 の6 haMSC 細胞に対する染料でした) でしたラベル haMSCs の生体内検出閾値が 10 間は4と 10 の5セル 106セルの上はお勧めしますがこのプロトコル。
一度このテクニックをマスターすると、このメソッドのアプリケーションは、最適なルートまたは MSCs 投与前臨床試験の投与量を決定する使用できます。このプロトコルは、間葉系幹細胞 (MSCs) 骨髄および臍帯血を含む他のソースからの体内体内の長期的な前臨床評価のために容易に適応することができます。これと、前向きで幹細胞の運命の動物モデルをコアに、光キ67 増殖8と軟骨分化27、コラーゲン II などの異種 haMSCs の immunohistology 研究を組み合わせること技術。
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Disclosures
孟李明浩、温王が現在の従業員と細胞生物医学グループのストック オプションの保有者 (Nasdaq: CBMG)。他の著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
現在の研究は、上海科学技術委員会の上海の自治体 (CN) 博士温王に主催の革新資金 (294300 1402 H) によって支えられました。彼の技術支援とこの原稿の科学的助言のため広東省周博士 (組織工学センターの中国国家) に感謝したいと思います。我々 も感謝したい氏 Huitang 夏 (上海第九人民病院) 動物の福祉に貢献しました。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Matrx VMR animal anesthesia system | Midmark | VIP3000 | |
4-0 suture | Shanghai Jinhuan | KC439 | |
Razor | Pritech | LD-9987 | |
Gentamicin | Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd. | None | |
0.9% Sodium chloride solution | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. | H43020455 | |
Penicillin | Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
Buprenorphine | Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Dilute to final concentration of 10% in PBS |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Dilute to final concentration of 20% in PBS |
0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s | Sigma-Aldrich | MHS16 | |
0.5% Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110116 | |
Safranin O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor | Thermo Fisher | A78400006 | |
Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center | Thermo Fisher | B64100010 | |
Fully Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
DiD | Molecular Probes, Life Technologies |
V-22887 | |
D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
PBS | GIBCO, Life Technologies | 14190-144 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-114 | |
10 cm Petri Dish | Corning | V118877 | |
Centrifuge | Beckman | Optima MAX-TL | |
Fluorescent microscope | Olympus | BX53 | |
0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | 93595 | |
Titetamme | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
Zolazepam | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
Sterile hyposermic syringe for single use 26G | Shanghai Misawa Medical Industry | None | |
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
Living Imaging 4.0 software | PerkinElmer | None |
References
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