Summary
Dit protocol beschrijft een efficiënte manier om te controleren de cel persistentie en ook menselijke adipeus afkomstige mesenchymale stamcellen (haMSCs) door far-red fluorescentie labeling in een rat knie artrose (KOA) model via intra-articulaire (IA) injectie.
Abstract
Ter ondersteuning van de klinische toepassing van menselijke adipeus afkomstige mesenchymale stamcellen (haMSC) therapie voor knie artrose (KOA), onderzochten we de werkzaamheid van cel persistentie en ook van haMSCs in diermodellen. We toonden een methode om de celmembraan van haMSCs met lipofiele fluorescente kleurstof van een label. Intra-articulaire injectie van de gelabelde cellen bij ratten met chirurgisch geïnduceerde KOA werd vervolgens dynamisch gecontroleerd door een in vivo imaging systeem. We gebruikt de lipofiele carbocyanines deed (DilC18 (5)), een far-red analoge tuners fluorescerende Dil (dialkylcarbocyanines) en die een rode laser gebruikt Voorkom excitatie van de natuurlijke groene autofluorescence uit de omliggende weefsels. Voorts de rood-verschoven emissie spectra van toegestaan diep-weefsel beeldvorming in levende dieren en de labeling procedure veroorzaakt geen cytotoxische effecten of functionele schade aan haMSCs. Deze aanpak is aangetoond dat een efficiënte tracking methode voor haMSCs in een rat KOA model. De toepassing van deze methode kan ook worden gebruikt om te bepalen van de optimale administratie route en de dosering van MSCs uit andere bronnen in de pre-klinische studies.
Introduction
Knie artrose (KOA) is een degeneratieve aandoening als gevolg van verlies van de articulaire kraakbeen en progressieve ontsteking, die uitgegroeid een grote chronische ziekte bij ouderen rond de wereld1 tot is. Huidige therapieën met anti-inflammatoire geneesmiddelen, fysieke supplementen en chirurgische procedures kunnen echter alleen tijdelijke verlichting voor symptomatische pijn2.
Menselijke adipeus afkomstige mesenchymale stamcellen (haMSCs) geworden een veelbelovende regeneratieve remedie tegen artrose van de knie, als gevolg van hun multipotente differentiatie mogelijkheden voor regeneratie van het kraakbeen en immunomodulerende eigenschappen3, 4. Vergeleken met farmacologische routes naar mechanismen van actie in vivoonderzoeken, is het bijhouden van levende haMSCs in kleine KOA diermodellen momenteel leerzaam om vast te stellen van de redenen voor en de haalbaarheid van haMSC therapie voorafgaand aan klinische toepassing. Voor preklinische testen, destabiliseert mediale meniscectomy (MM) de mechanische belasting van het gewricht te bewegen KOA in ratten, waarmee een relatief haalbaar model met consistente reproduceerbaarheid5. Het begin van de KOA geïnduceerd door MM is lager dan voorste cruciate ligament transect alleen of in combinatie met gedeeltelijke mediale meniscectomy6. De langdurige interacties tussen ingespoten haMSCs met de pathologische communicatie van KOA worden daarom vaak bij ratten geïnduceerd door MM7,8beoordeeld.
De therapeutische werking van haMSCs is uitgebreid gerapporteerd, relevante kennis op wel de in vivo persistentie van geïmplanteerde haMSCs via intra-articulaire (IA) injectie schaars9,10. Vandaar, diverse cellulaire labeling methoden zijn ontwikkeld, met inbegrip van de immunohistology11, luciferase12, groen fluorescent proteïne13 transfectie, ijzeroxide labeling voor magnetische resonantie beeldvorming (MRI)14 , en talrijke fluorescerende cel kleurstoffen8,15,16. Vergeleken met de arbeidsintensieve histologie analyses, in vivo niet-invasieve imaging maakt gebruik van optische apparaten te detecteren de real-time verdeling en dynamiek van cellen die zijn gelabeld met de fluorescerende signalen10,17. Voor functionele levende cel imaging is cytocompatible TL labeling een geavanceerd radioactieve-gratis tracking techniek te onthullen van cellulaire activiteiten na stamcel transplantatie18. Multicolor fluorescente lipofiele kleurstoffen bezitten bovendien voordelen ten opzichte van amino-reactieve hydrofiele kleurstoffen of fluorescerende eiwitten, met inbegrip van hun verbeterde cel permeabiliteit en verbeterde fluorescentie quantum opbrengsten19.
Dus de hier opgenomen protocollen gebruiken een rode laser te prikkelen van cellen die zijn gemarkeerd met de lipofiele carbocyanines deed (DilC,18lid 5), die is een far-red fluorescerende Dil (dialkylcarbocyanines) analoge20. De rood-verschoven excitatie en emissie spectra van vermijdt autofluorescent interferentie en diep-weefsel imaging gedurende een lange periode van tijd in levende dieren8staat. Deze methode van tracking cellen in vivo aangeduid met deed is geldig voor de controle van de getransplanteerde cellen van de stam, zoals haMSCs, in diermodellen, die is essentieel om te begrijpen en te verbeteren huidige regeneratieve therapie van de stamcel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
procedures met betrekking tot dierlijke onderwerpen werden goedgekeurd door de lokale institutionele Animal Care en ethisch comité, met een poging om te minimaliseren van dierenleed. Het volgende protocol goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) bij mensen van de negende van de Shanghai ’ s ziekenhuis bij Shanghai JiaoTong University School of Medicine met het protocol aangesloten nummer [2017] 063.
1. oprichting van een Surgically-Induced Rat knie artrose Model
- voor deze chirurgische procedure gebruik 8-12 weken oude mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten met een lichaamsgewicht tussen 250 en 300 g.
- Anesthetize van de dieren met 40 mg/kg tiletamine en 40 mg/kg zolazepam via intramusculaire injectie.
- Plaats het dier in een laterale linkerpositie in een verwarmde werkgebied. De rechterknie grondig scheren met een scheermes. Ontsmetten van het chirurgische gebied met 10% providone-jodiumoplossing gevolgd door 70% ethanol, herhaal twee meer tijden dan verf met 10% providone-jodiumoplossing en de niet-chirurgische oppervlakte met een chirurgische zeem.
- Met behulp van een chirurgische scalpel, het maken van een incisie van 2 cm zijwaarts langs de Patellaire pees blootstellen van de jointcapsules.
- Kunt een chirurgische scalpel transect van het mediale collaterale ligament. Weerspiegelen de meniscus naar het dijbeen.
- Steriel 0,9% natriumchlorideoplossing op het oppervlak van de articulaire kraakbeen druppelen tijdens de operatie om te voorkomen dat het kraakbeen uitdrogen.
- Pak van de mediale meniscus met een tang en snijden door de meniscus op het smalste punt van de tibiale bijlage met een scalpel ( figuur 1A). Voorkomen verwonden het kraakbeen.
- Sluit de gezamenlijke capsule met een 4-0 absorbeerbare hechtdraad.
- Volgen de chirurgische rats totdat ze bewustzijn herwinnen.
- 20 mg/kg gentamicine om te voorkomen dat infectie en 0,05 mg/kg buprenorfine via een intramusculaire route voor het verlichten van pijn na de operatie injecteren.
- Handhaven de ratten in een temperatuurgevoelig dier faciliteit onder een 12u licht/donker cyclus 3-8 weken tot begin KOA. Dieren blijven ontvangen van pijn medicatie, met inbegrip van maar niet beperkt tot buprenorfine (0,05 mg/kg, i.m.) en gentamicine (20 mg/kg, i.m.), als de pijn symptomen aanhouden.
2. Histologie beoordeling van Rat KOA Model
- offeren de ratten met buitensporige CO 2 inademing (Add een opvulling tarief van ongeveer 30% van het volume van de kamer per minuut met kooldioxide aan de bestaande lucht in de kamer om de dierlijke bewusteloosheid binnen 2-3 min. handhaven CO2-stroom voor een minimum van 1 min na ademhaling vervalt.) op aangegeven tijdstippen (vertegenwoordiger van de resultaten worden weergegeven op de 8 weken KOA inductie variërend van 3 tot 8 weken) na de chirurgie.
- ontleden van de huid en de spieren rond de knie gewrichten en afgesneden van de gewrichten van de knie met een scalpel. Voor 3 dagen bij kamertemperatuur vast
- de gewrichten van de knie in 4% paraformaldehyde (PFA). Daarna, decalcify van de monsters in de 20% ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) voor ongeveer 4 weken bij 4 ° C, en de EDTA elke 3 dagen wijzigen.
Let op: Paraformaldehyde is giftig, het dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), zoals handschoenen en bril. - Uitdrogen de monsters met behulp van een automatische weefsel processor. Het menu start een flush cyclus als volgt instellen: 70% ethanol voor 1 h; dan 80% ethanol en 95% ethanol voor 1 h respectievelijk; gevolgd door 2 cycli van 100% ethanol voor 1 h; vervolgens, xyleen tweemaal voor 1 h telkens en telkens 3 keer bij 58 ° C gedurende 1 h paraffine.
Let op: Xyleen is giftig, dus draag passende PPE, zoals handschoenen en bril.
Opmerking: Gebruik eventueel Coplin potten voor handmatige uitdroging met de dezelfde opzet als de automatische weefsel processor. - Plaats van het mediale aspect van het intact gezamenlijke gezicht naar beneden en insluiten in het blok paraffine met weefsel ingebed in het midden.
Opmerking: Gebruik eventueel pincet inbedden van de monsters in de paraffine blok handmatig. - Beginnen te snijden 5 µm Sagittaal secties uit de mediale marge van het gewricht voor 30 µm intervallen met 2 seriële secties door rotary microtome.
- Secties op glas dia's monteren en deparaffinize van de dia's in xyleen. Tussen de 2 seriële gedeelten, vlekken één dia met haematoxyline & eosine (H & E) kleuring: 0,1% Haematoxyline gedurende 15 minuten, 1% azijnzuur oplossing voor 10 s en 0,5% eosine gedurende 10 minuten. En de andere dia met Safranine O/Fast Green kleuring vlekken: 0,1% Haematoxyline gedurende 15 minuten, 0,02% snel groen voor 3 min, 1% azijnzuur oplossing voor 10 s en 0,1% Safranine O voor 3 min.
Let op: Xyleen is giftig, passende PPE, zoals handschoenen, bril dragen. - Score van de gekleurde dia's met behulp van artrose Research Society International (OARSI) histopathologisch onderzoek beoordelingssysteem in ratten 6.
3. Etikettering van menselijke mesenchymale stamcellen met de fluorescerende kleurstof deed
- cel-labeling oplossing bereiden deed in 100% ethanol bij een concentratie van 1 mM. De cel-labeling oplossing beschermen tegen licht en op te slaan bij kamertemperatuur voor 6 maanden.
- HaMSCs met standaard cel cultuur procedures in Dulbecco groeien ' s bewerkt Eagle ' s medium (DMEM), aangevuld met 1% penicilline en streptomycine en 10% foetaal kalfsserum (FCS) in een petrischaal 10 cm.
- HaMSCs met 2 mL 0,25% trypsine met 1 mM EDTA voorafgaand aan ongeveer 80% samenvloeiing loskoppelen.
- Neutraliseren trypsine met 4 mL gestolde voedingsbodem en draaien de cellen bij 800 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
- Schorten de cellen bij een dichtheid van 1 x 10 6 cellen/mL in serumvrij cultuurmedium 5 mL.
- Het label van de cellen door toevoeging van 50 µL deed cel-labeling oplossing in 5 mL serumvrij cultuurmedium bij 37 ° C gedurende 50 minuten
- De gelabelde cellen bij 800 x g gedurende 3 min. spin
- De cellen twee keer wassen met 5 mL fosfaat buffer zoutoplossing (PBS) bij 800 x g gedurende 3 minuten elk.
- Check de gelabelde haMSCs met een fluorescente microscoop met een Cy5 filter set.
- Cellen met trypan blauw kleuring tellen en verkrijgen van 2.5 x 10 6 levensvatbare cellen in 100 µL PBS voor injectie.
4. In Vivo Fluorescerende Imaging Track haMSCs
- acht weken na de operatie (stap 1), anesthetize de KOA ratten door intramusculaire injectie van 25 mg/kg tiletamine en 25 mg/kg zolazepam. De rechterknie wordt grondig door
- scheren met een scheermes om het gemeenschappelijke gebied bloot te stellen. Desinfecteren van de gezamenlijke ruimte met 70% ethanol.
- Met behulp van een naald van de spuit 26 G injecteren 2.5 x 10 6 label cellen gesuspendeerd in 100 µL PBS in het midden van het gebied van de driehoek gevormd door de mediale zijde van de Patellaire ligament, de mediale femur condyle, en de mediale tibiale condyle ( figuur 1B).
- De imaging software niet openen en de Bioluminescentie in vivo imaging systeem initialiseren.
- Positie ratten in de liggende positie in de centrale fase van de imaging systeem en sluit de deur van de kamer.
- Controleren de " fluorescerende " checkbox en selecteer fluorescerende filter sets van 640 nm voor excitatie en 680 nm voor emissie ( figuur 2A).
- Selecteer gezichtsveld naar D. instellen pixel weggooien op gemiddeld (8), F/Stop naar 2 en blootstelling tijd op automatisch. Handhaven van de optimale belichtingstijd consistente vergelijkbare resultaten te verkrijgen over de gehele studie ( figuur 2A).
- Verwijderen het dier uit de fase en de monitor voor het herstel van anesthesie.
Opmerking: Plaats dier op een verwarming pad bedekt met 2-3 lagen van breedbank. - Kies de eenheden van de stralende efficiëntie voor de meting van de fluorescentie ( figuur 2B). Selecteer regio's van belang (ROI) voor analyse en kwantificeren van fluorescerende signalen van elke afbeelding ( figuur 2C).
- Herhaal de procedure voor in vivo imaging voor elke rat opeenvolgend te bestuderen van de longitudinale retentie van de haMSCs in het gewricht.
Opmerking: Wij stellen voor dat de dieren imaging ' fluorescerende signalen door in vivo imaging systeem eenmaal om de twee dagen voor de eerste week na de injectie en eenmaal per week totdat het signaal kan niet zitten speurder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om te induceren KOA model, werd MM uitgevoerd in het gewricht van de rechterknie van SD ratten (Figuur 3). Acht weken na de operatie, ratten werden opgeofferd en de seriële secties van de gewrichten van knie werden geëvalueerd met beide H & E en Safranine O/snel groen kleuring (Figuur 4). Voor H & E kleuring, het oppervlak van de articulaire kraakbeen tentoongesteld ruwer grenzen in de chirurgie knieën dan het normale gewricht zonder chirurgie. Voor Safranine-O/Fast green kleuring, we waargenomen verminderde Proteoglycaan (rode vlekken) en verhoogde fibrillated collageen (groene kleuring) in de gezamenlijke operatie in vergelijking met normale degene, die de progressie van degeneratieve KOA fenotypen aangegeven geïnduceerd door chirurgie. Om te lijken op de progressie van menselijke KOA, werden ratten opgeofferd op 3 weken, 6 weken, en 8 weken na MM te beoordelen pathogenese en bepalen van het tijdstip van therapeutische interventies.
Het label haMSCs in KOA rat model werd gevisualiseerd door een optische in vivo imaging systeem. 1 h na de etikettering, het label van haMSCs tentoongesteld ronde vormen in vitro. De labeling efficiëntie bereikt ongeveer 95%. Na 24 h, gekweekte deed gelabelde haMSCs tentoongesteld lange spil vormen, die aangeeft heeft geen invloed op het vermogen van de naleving van de haMSCs in vitro (Figuur 5). Acht weken na de operatie, waren 2.5 x 106 deed-label haMSCs geïnjecteerd in de gewrichten met KOA. Hier het label haMSCs werden waargenomen in de lokale gewricht vanaf dag 0 (8 weken na de operatie) tot dag 70 post injectie (18 weken na de operatie) met behulp van een in vivo imaging systeem (Figuur 6).
Figuur 1: schematische chirurgische veld voor de MM chirurgie en injectie gebied voor cel levering. (A) dit schematisch diagram toont het chirurgische gebied, dat wordt gemarkeerd door blauwe kleur. (B) dit schematisch diagram geeft de injectieplaats binnen de rood omcirkelde gebied. Acroniem definities zijn als volgt: MM, mediale meniscus; MCL, mediale collaterale ligament; LM, laterale meniscus; LCL, laterale collaterale ligament; PL, Patellaire ligament. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Screen shots van in vivo imaging software. (A) toets instellingen van parameters voor fluorescerende Beeldacquisitie zijn gemarkeerd met rode vierkantjes. (B) stralend efficiëntie wordt gekozen als de eenheid voor het meten van fluorescentie. (C) In the Tool palet, regio's van belang (ROI) worden omcirkeld voor fluorescentie efficiëntie metingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: de procedures van chirurgisch-geïnduceerde KOA. (A) blootstelling van de knie gewrichtsruimte. (B) de innerlijke structuur van het kniegewricht, met een zwarte pijl die aangeeft van de mediale meniscus. (C) de ontleed mediale meniscus. (D) de gewrichtsruimte en de huid zijn gesloten.
Figuur 4: vertegenwoordiger histologische foto's van de gewrichten van knie en statistische analyse voor OARSI score van KOA. (A) acht weken post MM chirurgie bij ratten, seriële secties van de gewrichten van knie werden geëvalueerd met H & E en Safranine O/snel groen kleuring. H & E kleuring toonde de dikte van het kraakbeen in de knie chirurgie werd verminderd. Safranine O/Fast Green kleuring toonde daalde van Proteoglycaan (rode vlekken) en toegenomen fibrillated collageen (groene kleuring) in de knie van de chirurgie in vergelijking met normale knie. Schaal bar = 500 µm. (B) statistische analyse voor score van artrose in normale gewrichten en KOA gewrichten (n = 3). De gegevens worden uitgedrukt als mean±SEM. * geeft p < 0.05. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: morfologie van deed-geëtiketteerden haMSCs. Helder veld, fluorescerende en samengevoegde afbeeldingen van haMSCs 1 uur na de etikettering worden weergegeven in het bovenste deelvenster. Helder veld, fluorescentand samengevoegd beelden van haMSCs at24 h nadat labeling worden weergegeven in het onderste paneel. Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: In vivo imaging van deed-geëtiketteerden haMSCs. Na injectie van 2.5 x 106 deed-label haMSCs, worden representatieve beelden van KOA ratten weergegeven. Deed gelabelde haMSCs werden ontdekt tot 9 weken lokaal in de gewrichten van KOA ratten. Dit cijfer is vanaf de bekendmaking van Li M et al.8weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Veiligheidsnormen en ook studies van stamcel therapie zijn dringend nodig voordat we regeneratieve stamcel behandeling voor KOA van de Bank aan het bed brengen kunnen. Echter, het pathologische milieu van ziekte speelt een belangrijke rol in de persistentie en ook van getransplanteerde haMSCs10. Onlangs, heeft onze fractie aangetoond dat intra-articulaire injectie van haMSCs bleef langer in een pathologische KOA omgeving dan injecties onder normale omstandigheden8deed. Het is mogelijk dat de inflammatoire en degeneratieve communicatie kan mesenchymale stamcellen voor reparatie werven en later het voordeel van het behoud van geïnjecteerd haMSCs1,21. Bovendien, de veiligheid en werkzaamheid profielen van haMSCs kunnen beïnvloed worden door de timing van cel levering met betrekking tot de ernst van KOA, zodat de optimalisatie van de progressie van KOA in laboratoriumdieren zorgt voor de ondersteuning van klinische proeven voor waardevolle gegevens. Met als doel lijkt op milde tot matige ernst van menselijke KOA, ratten geïnduceerd door MM mogen ontwikkelen KOA variërend van 3 tot 8 weken. In deze studie, werd de morfologische verandering van kraakbeen beoordeeld door histopathologisch scoren 8 weken na de operatie, die een relatief haalbaar model met een gematigde graad van KOA te onderzoeken van de werkzaamheid en veiligheid van haMSCs8biedt. We laten zien hier een methode van het simpel en haalbaar om label haMSCs met far-red TL lipofiele membraan kleurstof voor de lange termijn evaluatie van de pre-klinische werkzaamheid.
De nadelen van deze techniek zijn dat het verbeelde weefsel in de buurt van de huid moet en een aanzienlijke hoeveelheid gelabelde haMSCs zijn vereist voor voldoende signaal overname als gevolg van de bescheiden quantum oogsten van deed. Hoewel een in vivo optische imaging systeem niet-invasieve longitudinale studies kunt van haMSCs ook in KOA modellen, trends in celaantal en locatie kan alleen in het algemeen worden onderkend. De analyse van het lot van de cel van de stam, in bepaalde celproliferatie en differentiatie, zal worden aangepakt door ook met behulp van lot toewijzing en hoge resolutie microscopie beeldvorming.
Momenteel vindt u een breed scala aan etikettering van technieken voor in vivo stamcel volgen, met inbegrip van radioactieve labels, nanodeeltjes en virale transductie reporter genen22,23,24. Echter kan radioactieve labeling evenals virale transductie van stamcellen interfereren met de genetische eigenschappen van cellen, die vervolgens stam-cel proliferatie en overleving in vivo16kunnen beïnvloeden. Bovendien, opsporing met behulp van MRI door opname van nanodeeltjes als arbeidscontractant betere ruimtelijke resolutie via een sterk elektromagnetisch veld vereist van de cellen van de stam, die aanleiding kunnen geven tot bezorgdheid over de gevoeligheid van deze techniek25. Fluorescerende cel kleurstoffen, zoals PKH26, CM-DiI en CFSE variërende graden van cytotoxiciteit vertonen en een relatief beperkte duur (maximaal 4 weken bieden) van labeling adipeus weefsel afgeleide cellen15. Daarentegen vertoont zwakke fluorescentie in waterige oplossingen. Wanneer verwerkt met een lipide membraan, uniform diffundeert binnen het celmembraan en uitdrukkelijke stabiel far-red fluorescentie19. Etiketten levensvatbare cellen en niet van invloed zijn op de verspreiding en functioneren van18. Nog belangrijker, overdragen de kleurstoffen niet van gelabelde cellen naar labelloze cellen tenzij er een directe membraan interactie tussen die cellen26 is. De excitatie van de far-red en emissie spectra van voorkomt dat autofluorescent interferentie van omringende weefsels en biedt diep-weefsel imaging in levende dieren. Deze functies inschakelen deed labelen als een ideale techniek voor op lange termijn tracking te bestuderen van het lot van geïmplanteerde haMSCs tijdens articularly. Daarom hebben wij aangetoond een betrouwbare methode om te controleren deed gelabelde haMSCs over een periode van 63 dagen in een rat model8.
Binnen het protocol voor deed-label haMSCs bijhouden in een model van de rat KOA, de kritische stappen om betrouwbare en haalbare resultaten te behalen zijn om ervoor te zorgen dat: 1) de meniscus richting het dijbeen is volledig doorsnijden in elk model rat voor consistente begin van KOA, 2) er is een geoptimaliseerde ratio van 10 μL kleurstof tegen 106 haMSC cellen voor een 50 min. kleuring, 3) de in vivo detectie drempel voor haMSCs deed-label is tussen 104 en 105 cellen, terwijl boven 106 cellen wordt aanbevolen in dit protocol.
Zodra deze techniek is de knie, kan de toepassing van deze methode worden gebruikt om te bepalen van de optimale route of de dosering voor beheer van MSCs in pre-klinische studies. Dit protocol kan worden gemakkelijk aangepast voor de lange termijn preklinische evaluatie van in vivo ook van mesenchymale stamcellen (MSCs) uit andere bronnen, met inbegrip van het beenmerg en navelstreng bloed. In het licht van de toekomstige lot van de cel van de stam in diermodellen KOA, kan immunohistology studie van XENOGENECELLEN haMSCs, zoals Ki67 voor proliferatie8 en collageen II voor articulair kraakbeen differentiatie27, gecombineerd worden met dit techniek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Meng Li Ming Hao en Wen Wang zijn huidige werknemers en de houders van het optieplan van cellulaire biologie-groep (Nasdaq: CBMG). De andere auteurs verklaren geen belangenconflict.
Acknowledgments
De huidige studie werd ondersteund door het Shanghai innovatiefinanciering (1402H 294300) gesponsord door de wetenschap en de technologie Commissie van Shanghai gemeente (CN) aan Dr. Wen Wang. Wij wil Dr Guangdong Zhou (nationale Tissue Engineering Center van China) bedanken voor zijn technische bijstand en de wetenschappelijke adviezen voor dit manuscript. Wij ook bedank Mr. Huitang Xia (Shanghai negende Volksgeschiedenis ziekenhuis) voor zijn hulp bij het welzijn van dieren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrx VMR animal anesthesia system | Midmark | VIP3000 | |
| 4-0 suture | Shanghai Jinhuan | KC439 | |
| Razor | Pritech | LD-9987 | |
| Gentamicin | Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd. | None | |
| 0.9% Sodium chloride solution | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. | H43020455 | |
| Penicillin | Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Buprenorphine | Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Dilute to final concentration of 10% in PBS |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Dilute to final concentration of 20% in PBS |
| 0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s | Sigma-Aldrich | MHS16 | |
| 0.5% Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110116 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor | Thermo Fisher | A78400006 | |
| Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center | Thermo Fisher | B64100010 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| DiD | Molecular Probes, Life Technologies |
V-22887 | |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS | GIBCO, Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-114 | |
| 10 cm Petri Dish | Corning | V118877 | |
| Centrifuge | Beckman | Optima MAX-TL | |
| Fluorescent microscope | Olympus | BX53 | |
| 0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Titetamme | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Zolazepam | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Sterile hyposermic syringe for single use 26G | Shanghai Misawa Medical Industry | None | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| Living Imaging 4.0 software | PerkinElmer | None |
References
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis Rheum. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Lane, N. E., Shidara, K., Wise, B. L. Osteoarthritis year in review 2016: clinical. Osteoarthritis Cartilage. 25 (2), 209-215 (2017).
- Wang, W., Cao, W. Treatment of osteoarthritis with mesenchymal stem cells. Sci China Life Sci. 57 (6), 586-595 (2014).
- Burke, J., et al. Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clin Transl Med. 5 (1), 27 (2016).
- Bendele, A. M. Animal models of osteoarthritis. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1 (4), 363-376 (2001).
- Gerwin, N., Bendele, A. M., Glasson, S., Carlson, C. S. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the rat. Osteoarthritis Cartilage. 18, Suppl 3. S24-S34 (2010).
- Janusz, M. J., et al. Induction of osteoarthritis in the rat by surgical tear of the meniscus: Inhibition of joint damage by a matrix metalloproteinase inhibitor. Osteoarthritis Cartilage. 10 (10), 785-791 (2002).
- Li, M., et al. In vivo human adipose-derived mesenchymal stem cell tracking after intra-articular delivery in a rat osteoarthritis model. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 160 (2016).
- Zhou, B., et al. Administering human adipose-derived mesenchymal stem cells to prevent and treat experimental arthritis. Clin Immunol. 141 (3), 328-337 (2011).
- Desando, G., et al. Intra-articular delivery of adipose derived stromal cells attenuates osteoarthritis progression in an experimental rabbit model. Arthritis Res Ther. 15 (1), 22 (2013).
- Riester, S. M., et al. Safety Studies for Use of Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stromal/Stem Cells in a Rabbit Model for Osteoarthritis to Support a Phase I Clinical Trial. Stem Cells Transl Med. 6 (3), 910-922 (2017).
- Bai, X., et al. Tracking long-term survival of intramyocardially delivered human adipose tissue-derived stem cells using bioluminescence imaging. Mol Imaging Biol. 13 (4), 633-645 (2011).
- Wolbank, S., et al. Labelling of human adipose-derived stem cells for non-invasive in vivo cell tracking. Cell Tissue Bank. 8 (3), 163-177 (2007).
- Heymer, A., et al. Iron oxide labelling of human mesenchymal stem cells in collagen hydrogels for articular cartilage repair. Biomaterials. 29 (10), 1473-1483 (2008).
- Hemmrich, K., Meersch, M., von Heimburg, D., Pallua, N. Applicability of the dyes CFSE, CM-DiI and PKH26 for tracking of human preadipocytes to evaluate adipose tissue engineering. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 117-127 (2006).
- Shim, G., et al. Pharmacokinetics and in vivo fate of intra-articularly transplanted human bone marrow-derived clonal mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 24 (9), 1124-1132 (2015).
- Chen, B. K., et al. A safety study on intrathecal delivery of autologous mesenchymal stromal cells in rabbits directly supporting Phase I human trials. Transfusion. 55 (5), 1013-1020 (2015).
- Chan, M. M., Gray, B. D., Pak, K. Y., Fong, D. Non-invasive in vivo imaging of arthritis in a collagen-induced murine model with phosphatidylserine-binding near-infrared (NIR) dye. Arthritis Res Ther. 17, 50 (2015).
- Texier, I., et al. Cyanine-loaded lipid nanoparticles for improved in vivo fluorescence imaging. J Biomed Opt. 14 (5), 054005 (2009).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
- Rahmati, M., Mobasheri, A., Mozafari, M. Inflammatory mediators in osteoarthritis: A critical review of the state-of-the-art, current prospects, and future challenges. Bone. 85, 81-90 (2016).
- Detante, O., et al. Intravenous administration of 99mTc-HMPAO-labeled human mesenchymal stem cells after stroke: in vivo imaging and biodistribution. Cell Transplant. 18 (12), 1369-1379 (2009).
- Hu, S. L., et al. In vivo magnetic resonance imaging tracking of SPIO-labeled human umbilical cord mesenchymal stem cells. J Cell Biochem. 113 (3), 1005-1012 (2012).
- Xia, Q., et al. Intra-articular transplantation of atsttrin-transduced mesenchymal stem cells ameliorate osteoarthritis development. Stem Cells Transl Med. 4 (5), 523-531 (2015).
- Jasmin,, et al. Optimized labeling of bone marrow mesenchymal cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles and in vivo visualization by magnetic resonance imaging. J Nanobiotechnology. 9, 4 (2011).
- Lehmann, T. P., et al. Coculture of human nucleus pulposus cells with multipotent mesenchymal stromal cells from human bone marrow reveals formation of tunnelling nanotubes. Mol Med Rep. 9 (2), 574-582 (2014).
- Wang, W., et al. Human adipose-derived mesenchymal progenitor cells engraft into rabbit articular cartilage. Int J Mol Sci. 16 (6), 12076-12091 (2015).
